Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình tự gen phân loại cây sói rừng (sarcandra glabra (thunb.) nakai)

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2016 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến Thái Nguyên - 2016 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và ThS. Hồ Mạnh Tường cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo các nhà khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu. Cảm ơn các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh v MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Tổng quan về cây sói rừng .......................................................................3 1.1.1. Phân loại học ......................................................................................... 3 1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng ................................................. 4 1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng .................................................... 4 1.2. Tổng quan về mã vạch DNA....................................................................7 1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode ................................................................ 7 1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode .......................................... 8 1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật .......................................................................................................... 9 1.2.3.1. Trình tự gen nhân.................................................................................. 9 1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome ............................................................... 10 1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp............................................................................. 10 1.3. Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu ..................14 Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ...............................................18 2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................. 18 2.1.2. Chủng vi khuẩn ................................................................................... 18 2.1.3. Hóa chất............................................................................................... 18 2.1.4. Thiết bị sử dụng .................................................................................. 19 2.1.5. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................19 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái.................................... 19 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................... 20 2.2.2.2. Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết...................................... 21 2.2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR ....................... 22 2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................... 24 vi 2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector ..................................... 25 2.2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt....... ............................................................................................................ 26 2.2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) ............... 26 2.2.2.8. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli .................................................. 28 2.2.2.9. Phương pháp xác định trình tự của gen ............................................. 29 2.2.2.10. Phương pháp phân tích số liệu .................................................... 29 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 30 3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn ...................30 3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng ..........................................................32 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số..................................................................... 32 3.2.2. Khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phản ứng PCR ................... 33 3.2.3. Kết quả ghép nối gen vào vector tách dòng ...................................... 35 3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp ................................ 36 3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ................................................ 37 3.3. Kết quả xác định trình tự đoạn các đoạn gen nghiên cứu.....................38 3.3.1. Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1 ..................................................... 39 3.3.2. Phân tích vùng ITS ............................................................................. 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleostide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E. coli Escherichia coli IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside UV Ultraviolet LB Luria Bertani ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA Kb Kilobase OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution STS Sequence-Tagged Site TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X-gal X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp .................................................................................................................. 111 Bảng 2.1. Các máy móc và các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ..................... 19 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa ...................................................... 200 Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách ................................................... 200 Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 22 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen ITS.............................. 23 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ......................... 23 Bảng 2.7. Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR ........................................... 23 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng .... 25 Bảng 2.9.Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang ................. 26 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................ 27 Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR................................... 27 Bảng 2.12. Thành phần hóa chất tách plasmid ............................................... 28 Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 ... 41 Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ............................................ 41 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của gen ITS của mẫu sói rừng nghiên cứu với một số trình tự trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ....................................... 44 Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen ITS ........ 46 Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ................................................ 46 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cây sói rừng trong tự nhiên ............................................... 3 Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT ............................................................................ 25 Hình 3.1. Mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng sơn ......................................... 30 Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng............................................................ 31 Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số cây Sói rừng trên gel agarose 1% ....... 32 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 và sản phẩm nhân gen ITS từ các cặp mồi đặc hiệu ........................................................................... 34 Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................. 35 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony các khuẩn lạc sử dụng mồi rpoC1 và mồi ITS ........................................................................................... 37 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid.................................. 38 Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng và hai trình tự mang mã số EF380352 và KP256024 trên Genbank ................... 40 Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của mẫu sói rừng với mẫu EF380352 và KP256024 trên Genbank. ..................... 42 Hình 3.10. Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR và 4 trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên ngân hàng gen quốc tế............................................................................................... 45 Hình 3.11. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS của mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên ngân hàng gen quốc tế …………………………………………………..46 1 MỞ ĐẦU Theo đánh giá của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh ung thư hiện nay luôn là gánh nặng của nền kinh tế - xã hội đối với mọi quốc gia, trung bình mỗi năm có thêm 10 - 16 triệu người mắc bệnh. Đây là một căn bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao. Mặc dù hiện nay đã có rất nhiều phương pháp điều trị hiện đại nhằm loại bỏ khối u như phương pháp xạ trị, hóa trị, liệu pháp hormon, liệu pháp sinh học, điều trị trúng đích và ghép tế bào gốc để ức chế và tiêu diệt tế bào ung thư. Ngoài ra, người bệnh còn phải sử dụng các thuốc nhằm nâng cao thể trạng, khắc phục hậu quả do khối u gây ra, kéo dài thời gian sống cho người bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này rất tốn kém về mặt kinh tế [3], [9]. Ngày nay việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay các hợp chất được tổng hợp từ các chất có nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày càng tăng và chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học, bởi chúng có khả năng chữa trị bệnh cao, an toàn và ít tác dụng phụ. Ở Việt Nam tính đến 2005 đã xác định được 3948 loài thực vật và nấm, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Đa số các cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % trong số đó là cây thuốc trồng [1]. Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú đa dạng về chủng loại. Các nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy cây Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) là dược liệu có khả năng chữa trị các bệnh cảm mạo, viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lưng và một số bệnh ung thư như ung thư tụy, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư cuống họng… [2], [12], [21]. Tuy nhiên việc nghiên cứu sử dụng cây thuốc còn chưa được quan tâm đúng mức đã và đang làm cho khu vực phân bố của loài bị thu hẹp và trữ lượng của loài suy giảm một cách nghiêm trọng. 2 Hiện nay thị trường về các nguồn nguyên liệu thảo dược dùng trong sản xuất dược phẩm có tiềm năng lớn và đang tiếp tục phát triển. Tuy nhiên cùng với sự phát triển đó, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi. DNA barcode là một trong những phương pháp phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật. Xuất phát từ những nguyên nhân và lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình tự gen phân loại cây sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)”.  Mục tiêu nghiên cứu - Mô tả được một số đặc điểm hình thái của cây sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai - Xác định được một số trình tự gen phân loại cây sói rừng Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai.  Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây sói rừng - Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và ITS. Nhân bản và tách dòng hai đoạn gen rpoC1 và ITS . - Xác định, phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 và ITS được phân lập từ mẫu sói rừng thu được từ Lạng Sơn. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây sói rừng 1.1.1. Phân loại học Tên khoa học: Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai. Phân loại: Giới: Plantae Bộ: Chloranthales Họ: Chloranthaceae Chi: Sarcandra Loài: S. glabra. Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus glaber (Thunb.) Makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae. Ở Việt Nam cây sói rừng còn có một số tên gọi khác như sói lãng, sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc [5]. Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở vùng Hình 1.1. Hình ảnh cấy Sói rừng núi đất, ở bìa rừng và ven đồi ẩm trong tự nhiên nhiều nơi như: Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng. Thu hái toàn cây vào mùa hạ, dùng tươi 4 hay phơi khô trong râm. Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch cắt đoạn, phơi khô trong râm hoặc dùng tươi [5]. 1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng Trong thành phần cây Sói rừng có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học cao như: flavonoid, coumarin , sesquiterpen, saponin,… . Các este, phenol, đường, flavon, cyanogens, axit fumaric, …[7]. Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật khi nghiên cứu về cây thuốc cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là sesquiterpen lactose, curmarin, flavonoid [17], [19], [46]. Những nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học đã xác định Sói rừng có chứa một số các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như chloranoside A; Tertorigenin 7-glucoside có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp và tiêu hóa, hợp chất isofraxidin, một vị thuốc trong bài thuốc trị bệnh vảy nến tại Trung Quốc [4], [6]. Bên cạnh đó, bột cây Sói rừng còn có hoạt tính kháng gốc tự do, có tác dụng ức chế sự phát triển của các khối u, hỗ trợ trong điều trị bệnh ung thư. Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết sói rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người Hep-A549, HCT-29, BGC-823 [2], [12]. 1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng cay, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây được ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống trị bệnh lao, hoặc giã đắp chữa rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp chữa vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau nhức xương khớp [4], [6]. Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều, hoa được dùng để ướp trà [4], [7]. 5 Ngoài ra dịch chiết từ cây sói rừng có tác dụng chống viêm đạt hiệu quả 97,6% mà không gây tác dụng phụ, đặc biệt phần lá cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất. Các nhà y học cổ truyền Trung Quốc đã bào chế Sói rừng thành dạng thuốc tiêm bắp để trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp một cách hiệu quả [6], [12]. Theo các tài liệu thu thập được, các nhà khoa học còn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch của cây sói rừng. Nghiên cứu về tác dụng kháng u, Zhong L. và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của Sói rừng trên phòng và chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu. Kết quả thí nghiệm đã chứng minh S.glabra có tác dụng rõ rệt trong điều trị giảm tiểu cầu và có thể ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây ra bởi 5-FU. Wen J. và cộng sự (2003) đã sử dụng dịch chiết Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai tiêm cho chuột được cấy ghép tế bào ung thư gan Hep-A22 đồng thời cũng quan sát tác dụng của dịch chiết trên sự phát triển in vitro của dòng tế bào này. Kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư Hep-A22 cả trên in vitro và in vivo [47]. Trong một nghiên cứu khác của Zhenzhen Z., chất SGP-2, một polysaccharide chiết xuất từ Sacandra glabra đã ức chế sự tăng sinh và di căn của tế bào ung thư MG-63 in vitro [55]. Các kết quả nghiên cứu trên đã tạo tiền đề xây dựng cơ sở khoa học cho những nghiên cứu chống ung thư tiếp theo của các thành phần có hoạt tính sinh học trong cây sói rừng [29]. Kang và cộng sự [28] nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S. glabra và gây chết tế bào theo chương trình của dòng tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát triển khối u invivo. Yuan K., Zhu J.X. và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết n - butanol của Sói rừng. Kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn theo 6 mm của các hợp chất kaempferol-3-O-beta-D-glucoronid, isofraxidin-7-O-betaD-glucopyranosid, kaempferol được ghi lại có thứ tự là 14,67±0,08; 11,14±1,06; 8,26 ±1,26 [52]. Xu X.D., Hu X.R. và cộng sự [49] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của Sói rừng. Kết quả thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform và EtOAc của dịch chiết EtOH toàn cây Sói rừng, có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Đồng thời với nghiên cứu ức chế sự phát triển các tế bào u, các nhà khoa học còn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch của cây sói rừng. Theo các tác giả He R. (2009) và Sun W. (2015) về tác dụng của dịch chiết Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai lên hệ miễn dịch của chuột thì dịch chiết có liên quan tới sự cân bằng của tế bào T, làm tăng phần trăm diệt tự nhiên và hiệu quả bảo vệ theo kiểu miễn dịch ở chuột bị ung thư thông qua sự cải thiện tỉ lệ và số lượng tế bào miễn dịch, tăng trọng lượng lách, tuyến ức và tăng số lượng bạch cầu [23], [38]. Trong một thí nghiệm của tác giả Từ Quốc Lượng và cộng sự (2005), dịch chiết phân đoạn cây sói rừng làm tăng trọng lượng lách, tuyến ức và số lượng tiểu cầu trên chuột xuất huyết giảm tiểu cầu. Nghiên cứu ảnh hưởng của cây sói rừng trên điều trị giảm tiểu cầu do hóa trị liệu [39]. Trên các bệnh nhân ung thư biểu mô mũi họng, điều trị tia xạ kết hợp uống cao Sói rừng đã làm giảm được một số tác dụng phụ do tia xạ so với chỉ tia xạ đơn thuần [20]. Có rất nhiều bài thuốc dân gian sử dụng cây Sói rừng làm thuốc trong điều trị viêm khớp, phong thấp. Ngoài ra Sói rừng còn có mặt trong thành phần của một số thực phẩm chức năng như Flamasol, Hoàng Thấp Linh,viên Gout Tâm Bình, Tiêu Khiết Thanh, hỗ trợ điều trị cho người bị viêm đau khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, giúp phòng ngừa và giảm các triệu cứng viêm đường hô hấp. 7 1.2. Tổng quan về mã vạch DNA 1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode Để phân loại và xác định loài ở động, thực vật hiện nay có rất nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau, hầu hết các phương pháp đều dựa trên các nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Trong đó phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện. Tuy nhiên phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) nên cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu thực vật có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [24], các mẫu thực vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện được bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại tốn nhiều thời gian và công sức [22]. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Năm 2003, khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên, nhằm giúp nhận diện các mẫu thực vật [31]. Mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn (400 - 800 bp) nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào. Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài. Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học. Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm. Phương pháp này vô cùng 8 có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua chế biến… Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào. Với sự hỗ trợ của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới [33]. Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lưu ý rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm… 1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể. Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR. Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều 9 khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn gốc các loài. Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [15], [35], [41]. Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [16], [27], [41]. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [16], [30], [34]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [16], [27], [39]. Theo Taberlet P. và cộng sự (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây: - Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài. - Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. - Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…). - Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA [39]. 1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật 1.2.3.1. Trình tự gen nhân Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định. Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc 10 có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [43], [50]. 1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome Gen DNA ribosome (rDNA) là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau. Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng [13]. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [43], [50], [51]. 1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large singlecopy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao được 11 phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng [8]. Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp [14], [26], [ 44] Trình tự 5’→3’ Mồi a-f a-r matK 1F matK 1R matK matK 2F matK 2R rpoB 1 rpoB 2 rpoB rpoB 3 rpoB 4 rpoC1 1 rpoC1 2 rpoC1 rpoC1 3 rpoC1 4 ycf5 1 ycf5 ycf5 2 (ccsA) ycf5 3 ycf5 4 trnH2 trnH psbAF psbA trnH(GUG) psb A trnL-c trnL-d trnL-e trnL-F trnL-f trnL-g trnL-h Kí hiệu: → mồi xuôi; ← rbcL ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC CCATAAGCATATCTTGAGTTGG → ← → ← → ← → → ← ← → → ← ← GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC → → ← CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG → ← → ← → ← → ← → ← CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG3’ GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC mồi ngược