Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9440117 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Bùi Minh Lý 2. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Bùi Minh Lý và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này. Tác giả luận án Bùi Văn Nguyên ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Bùi Minh Lý và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị phụ trách của Học Viện Khoa học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới UBND tỉnh Khánh Hòa, ban giám hiệu trường Đại học Khánh Hòa, Khoa KHTN và Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, các nhà khoa học, anh chị em và bạn bè đang công tác tại Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các nhà khoa học trong nhóm nghiên cứu PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân, PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy, GS.TSKH. Anatolii I. Usov và PGS.TS. Yoshiaki Yuguchi đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các đề tài hợp tác quốc tế với Liên Bang Nga mã số VAST.HTQT.Nga.02.15-16 và VAST.HTQT.Nga.06.13-14, với Nhật Bản mã số VAST.HTQT.NHATBAN.02.13-15 đã tài trợ kinh phí giúp hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Như Hậu, Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang đã giúp đở tôi trong quá trình thu thập mẫu rong nâu và giám định tên khoa học. Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên tôi hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này. Xin chân thành cảm ơn! Tác giả Bùi Văn Nguyên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ii MỤC LỤC.............................................................................................................iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .............................................................................. xi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4 1.1. Tổng quan về rong nâu ............................................................................ 4 1.1.1. Giới thiệu về rong biển ................................................................... 4 1.1.2. Giới thiệu về Rong Nâu .................................................................. 7 1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ................................. 7 1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam ..................................... 9 1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu ................................................... 14 1.1.3.1. Polysaccharide .............................................................................. 14 1.1.3.2. Hợp chất phenolic ......................................................................... 19 1.1.3.3. Hợp chất carotenoid...................................................................... 21 1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid ...................................................................... 22 1.1.3.5. Các hợp chát khác ......................................................................... 25 1.2. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan) ................................. 26 1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan ............................................................ 26 1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu ........ 26 1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan .......................................................... 28 1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan ........................................................... 29 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan .................................. 30 1.2.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối ........................ 30 1.2.5.2. Hoạt tính chống virus .................................................................... 32 1.2.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch....................................... 33 1.2.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa................................................................ 35 1.2.5.5. Giảm lipid máu ............................................................................. 36 iv 1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................ 36 1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan .......................................................... 37 1.2.5.8. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 37 1.2.5.9. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu. ............................ 37 1.2.5.10. Các ứng dụng của fucoidan......................................................... 38 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án .......................................................................... 39 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 39 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................... 44 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 49 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 49 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 50 2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan............................... 51 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan .................................................. 51 2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan ................................................. 51 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan .............................. 51 2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .......................... 51 2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ..................................... 53 2.2.2.3. Phương pháp phổ IR ..................................................................... 53 2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR ................................................................. 54 2.2.2.5. Phương pháp phổ MS .................................................................... 59 2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .................................... 64 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ................................................. 66 2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro............ 66 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm....................................................................... 68 2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu ................. 68 Chương 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 70 3.1. Thu thập và xử lý rong ............................................................................. 70 3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu .......................................... 71 3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan ....................................... 77 v 3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate ........................................... 77 3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide .............................................. 77 3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate ............................................................... 78 3.3.4. Phương pháp khử sulfate ................................................................... 78 3.3.5. Xác định hàm lượng axít uronic ........................................................ 78 3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa ................................................... 79 3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide .......................................................... 79 3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) .............................................................. 79 3.3.9. Phổ IR ................................................................................................. 80 3.3.10. Phổ NMR .......................................................................................... 80 3.3.11. Phổ ESI-MS/MS ............................................................................... 80 3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) ..................................... 80 3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học ...................................................................... 81 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào .................................................................... 81 3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm .............................................................................................................. 82 3.4.3. Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu ........................................ 83 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 85 4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan.......................... 85 4.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được. ........................................................................................... 86 4.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S. binderi và S. duplicatum ................................................................................ 90 4.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi ................. 90 4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum .......... 92 4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium .............................................................................. 96 4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan........................................................ 96 4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan ...................................................... 100 4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation) ...................................... 100 vi 4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA ....... 101 4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis) .......... 104 4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion.............................. 106 4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 .................................. 107 4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 ................................................ 111 4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 ................................................ 115 4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 ................................................ 117 4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS ..... 117 4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học ............................................................. 124 4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................. 124 4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro .................................................... 124 4.4.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu ...................................................... 126 4.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens.......................................................... 131 4.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens. ............................................................... 131 4.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens........................................................................................................ 135 4.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M .......................... 142 4.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào ... 144 4.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ .......................................................................... 144 4.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây đốc tế bào. .................................................................................... 151 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 156 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 159 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............. 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 162 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography GC Gas Chromatography GC-MS Gas Chromatography - Mass Spectrometry GLC Gas Liquid Chromatography GPC Gel permeation chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography LC-MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry GC - FID Gas Chromatography – Flame Ionization Detector Các phương pháp phổ 13 C-NMR Carbon-13 NMR Spectroscopy 1 H-NMR Proton NMR Spectroscopy COSY Correlation Spectroscopy ESI-MS HMBC ESI-MS HSQC IR MALDITOF/MS NMR NOESY Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Infrared Spectroscopy Time-of-flight mass spectrometry with matrix-assisted laser desorption/ionization Nuclear Magnetic Resonance Rgc Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Radius of gyration SAXS TOCSY Small-angle X-ray Scattering Total correlation spectroscopy Sắc ký cột thường Sắc ký khí Sắc ký khí - Phổ khối Sắc ký khí, pha tĩnh lỏng Sắc ký lọc gel Sắc ký lỏng cao áp Sắc ký lỏng cao áp - Phổ khối Sắc ký khí – Đầu dò ion hóa ngọn lửa Phổ CHTHN carbon 13 Phổ CHTHN proton Phổ tương tác hai chiều 1H1 H Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Phổ hồng ngoại Phổ khối MALDI-TOF/MS Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) Phổ NOESY Bán kính hồi chuyển, bán kính quay Tán xạ tia X góc nhỏ Phổ tương tác toàn phần viii Hoạt tính sinh học APTT Activated Partial Thromboplastin Time CS Hep-G2 HIV Cell Survival, Cell Viability Human hepatocellular carcinoma Human immunodeficiency virus IC50 Inhibitory Concentration 50% LU-1 RD Human lung adenocarcinoma Human Rhabdomyosarcoma Monosaccharide Fuc Fucose Fucf Fucofuranose Fucp Fucopyranose Gal Galactose Gluc Glucose GlucA Glucuronic Acid Man Mannose Xyl Xylose Hóa chất Cetavlon DMSO EtOAc EtOH MeOH TFA Hexadecyltrimethylammonium bromide, Cetrimonium bromide Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Ethanol Methanol Trifluoroacetic acid Xét nghiệm APTT đánh giá chức năng đông máu Tế bào sống sót Ung thư gan ở người Virus gây suy giảm miễn dịch ở người Nồng độ ức chế 50% tăng trưởng của đối tượng thử Ung thư biểu mô phổi Ung thư mô liên kết Đường fucose Fucofuranose Fucopyranose Đường galactose Đường glucose Axit glucuronic Đường mannose Đường xylose Hexadecyl trimethyl ammonium bromid Dimethylsulfoxid Ethyl acetat Ethanol Methanol Axit trifluoroacetic ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa ................................. 12 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan .............................................. 27 Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan ........................................ 30 Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu .................... 39 Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ..................... 54 Bảng 2.2. Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đường ................ 56 Bảng 2.3: Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate .................. 61 ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm ................................................. 61 Bảng 2.4. Fucoidan phân đoạn SmF3 của rong S. mcclurei ................................... 62 Bảng 2.5. Thông số  đối với một số dạng cấu trúc polymer ................................. 65 Bảng 4.1. Thành phần polysaccharid tan trong nước từ một số loài rong nâu (% trên trọng lượng rong khô) ............................................................................................ 87 Bảng 4.2. Thành phần hóa học của các fucoidan phân lập được từ 06 loài rong nâu thu ở Nha Trang. ................................................................................................... 88 Bảng 4.3. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi 91 Bảng 4.4. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ S. duplicatum ........ 93 Bảng 4.5. Hiệu suất và thành phần (%) của FSA và các phân đoạn fucoidan thu được sau sắc ký trao đổi anion. .............................................................................. 98 Bảng 4.6. Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M). .......................... 101 Bảng 4.7. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa ......................................... 104 Bảng 4.8. Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng. ................................... 107 Bảng 4.9. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 ( = ppm, ký hiệu của các gốc đường xem Hình 4.16). ................................................................................. 109 Bảng 4.10. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4 ..................................... 114 Bảng 4.11. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6 ..................................... 116 Bảng 4.12. Kết quả phân tích methyl hóa FSA-1,5M và 1,5M-deS. ..................... 118 x Bảng 4.13. Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan từ FSA. ................................................................................................................ 124 Bảng 4.14. Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần thể tế bào ............................................................................................................. 125 Bảng 4.15: Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens........................................................................................... 135 Bảng 4.16. Kết quả thử nghiệm tác dụng chống khối u của FTD-2,0N trên tế bào ung thư gan Hep-G2 ............................................................................................ 142 Bảng 4.17. Hiệu suất, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam. ................................................... 146 Bảng 4.18. Bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc ước lượng từ đồ thị Guinier của các mẫu fucoidan đo trong NaCl 0,5M.. ........................................................ 149 Bảng 4.19. Hoạt tính độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. .............................................................. 152 Bảng 4.20. Liên hệ giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan .... 153 Bảng 4.21. Liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng sulfat và tỉ lệ sulfat/đường của các mẫu fucoidan. ...................................................................................................... 153 Bảng 4.22. Liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi chuyển Rgc của các mẫu fucoidan. ............................................................................................................. 154 xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa........................................................................................................................ 11 Hình.1.2. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan đặc trưng tách và phân lập từ rong nâu ........................................................................................................................ 46 Hình 2.1. Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens............ 50 Hình 2.2. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysaccharide. 52 Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ion hóa ESI-MS ................................ 59 Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate ...................................................... 60 Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate ...................................................... 61 Hình 2.6. Cơ chế phân mảnh oligosacaride với sự có mặt của ion kim loại ............ 62 Hình 2.7. Phổ MS và cơ chế phân mảnh của fucoidan ........................................... 62 Hình 3.1. Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium .............................................................................................................................. 70 Hình 3.2. Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens ..................... 71 Hình 3.3. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium ............................................................................................................. 73 Hình 3.4. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens .............................................................................................................................. 74 Hình 3.5. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto) .............................................................................................................................. 75 Hình 3.6. Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) ....... 76 Hình 4.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium ........... 86 Hình 4.2. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ............. 86 Hình 4.3. Tách các phân đoạn của fucoidan từ S.binderi trên cột DEAE-Cellulose 90 Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi .. 92 Hình 4.5. Phân đoạn của fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum ................ 93 Hình 4.6. Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum .............................................................................................................................. 94 xii Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S. duplicatum ......... 94 Hình 4.8. Sơ đồ chiết xuất, phân lập và chuyển hóa các fucoidan của S. aquifolium .............................................................................................................................. 97 Hình 4.9. Sắc ký đồ GPC của fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium ... 99 Hình 4.10. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium .......... 99 Hình 4.11. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-2,0M ........................................... 102 Hình 4.12. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,5M ........................................... 103 Hình 4.13. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,0M ........................................... 103 Hình 4.14. Sắc ký đồ của 1.0M-deS trên cột trao đổi anion DEAE-Sephacel. ...... 106 Hình 4.15. Một phần của phổ HSQC của deS-2 ................................................... 108 Hình 4.16. Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều ở dạng pyranose). ................................................................................................ 108 Hình 4.17. Một phần của phổ HMBC của deS-2 ................................................. 110 Hình 4.18. Phổ HSQC của deS-4 ......................................................................... 112 Hình 4.19. Một phần của phổ HMBC của deS-4 .................................................. 112 Hình 4.20. Mảnh cấu trúc của deS-4 .................................................................... 114 Hình 4.21. Phổ HSQC của deS-6 ......................................................................... 115 Hình 4.22. Một phần của phổ HMBC của deS-6 .................................................. 115 Hình 4.23. Mảnh cấu trúc của deS-6 .................................................................... 116 Hình 4.24. Phổ ESI-MS của FSA-1,5M trong vùng m/z 320 đến m/z 610 ........... 120 Hình 4.25. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243 .................................. 121 Hình 4.26. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389 ................................ 122 Hình 4.27. Phổ ESIMS/MS thức âm của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) .................. 123 Hình 4.28. Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi cấy trên thạch mềm dưới tác dụng của cácchất thử .............................................. 126 Hình 4.29. Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S. aliqualium đo được bằng phương pháp APTT..................................................................................... 127 Hình 4.30. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ............................................................................................................ 132 Hình 4.31. Sắc ký đồ của GPC của fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens ............................................................................................................................ 133 xiii Hình 4.32. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens .......... 134 Hình 4.33. Phổ IR của FTD-2,0N ........................................................................ 135 Hình 4.34. Các đoạn trích từ phổ 1H-NMR của FTD-2,0N .................................. 136 Hình 4.35. Các đoạn trích từ phổ 13C-NMR của FTD-2,0N ................................ 137 Hình 4.36. Một đoạn trích từ phổ HSQC của FTD-2,0N ...................................... 138 Hình 4.37. Một đoạn trích từ phổ HMBC của FTD-2,0N ..................................... 138 Hình 4.38. Phổ ESI-MS/MS của ion [FucSO3]- (m/z 243) ................................... 139 Hình 4.39 : Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) ............................. 140 Hình 4.40. Sơ đồ phân mảnh của Fucoidan FTD-2,0N......................................... 141 Hình 4.41. Hình ảnh hiển vi của các khối u dưới tác dụng của chất thử ............... 142 Hình 4.42. Vùng tán xạ góc nhỏ so sánh với vùng góc lớn thường được dùng trong các phương pháp phân tích nhiễu xạ (diffraction analysis). .................................. 144 Hình 4.43. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo tán xạ tia X góc nhỏ ....................... 145 Hình 4.44. Đồ thị Kratky cho các kết quả đo SAXS của 6 mẫu fucoidan trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M............................................................................. 147 Hình 4.45. Đồ thị Kratky cho tất cả các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong nước............................................................................................. 148 Hình 4.46. Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong dung dịch NaCl 0,5M trong nước. ........................ 149 Hình 4.47: Cấu trúc dựa trên các dữ kiện hóa học và phổ được đề xuất cho Fto bởi Thành Thị Thu Thủy và Yuguchi......................................................................... 150 Hình 4.48. Mô hình cấu trúc cho các mạch nhánh của Fto [92]. ........................... 150 Hình 4.49. Đồ thị Kratky của Fto so sánh với các đồ thị lý thuyết ước lượng được từ 4 mô hình cấu trúc trên Hình 4.48 ....................................................................... 151 1 MỞ ĐẦU Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú. Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Rong biển có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp... Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn. Do vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2,3,4,5,6]. Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật,… [6]. Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là 2 bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có uronic acid [6,7]. Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu. Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated polysaccharide khác nhau. Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8]. Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô. Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [12,13,14]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu của luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: 3 Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc. Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc. 4 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong nâu 1.1.1. Giới thiệu về rong biển Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn [1,4]. Tổng số loài rong biển trên thế giới được báo cáo chủ yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới. Tổng số loài rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài: 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [1]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [15]. Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển. Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), 5 thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật [16]. Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong. Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc : làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu được các tinh thể mannitol. Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên