Tài liệu Nghiên cứu đa hình gen tnf α 308 ga và tgf β1 509ct ở bệnh nhân utbmtbg có hbsag dương tính

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma - HCC, UTBMTBG) là một trong những bệnh lý ác tính hay gặp hàng đầu thế giới. Bệnh đứng hàng thứ 6 trong 10 loại ung thư hay gặp, là nguyên nhân thứ ba gây tử vong do ung thư. Theo GLOBOCAN ước tính riêng năm 2018 đã có 841.00 trường hợp mắc mới và 782.000 bệnh nhân tử vong do UTBMTBG [1]. Các nghiên cứu đã ghi nhận nhiễm virus viêm gan B (HBV) mạn là nguyên nhân chính gây UTBMTBG. Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HBV cao tương ứng có số người mắc UTBMTBG tương đối lớn. Đây là loại ung thư có tiên lượng xấu với thời gian sống thêm ngắn, liên quan đến khả năng chẩn đoán sớm còn nhiều hạn chế. Do vậy, hiện nay trên thế giới những nghiên cứu về sinh bệnh học của UTBMTBG nhằm mục tiêu nhận diện những dấu ấn sinh học có giá trị trong chẩn đoán, điều trị đã được tiến hành rộng rãi. Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận vai trò kiểu gen, đặc biệt các đa hình gen (SNP: Single nucleotide polymorphism) của vật chủ đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi nhiễm HBV, ảnh hưởng đến quá trình hình thành viêm gan mạn, xơ gan, phát triển UTBMTBG. Như vậy, nghiên cứu đa hình gen giúp phân tầng đối tượng nguy cơ, cải thiện phát hiện sớm và kết quả điều trị bệnh [2], [3]. Gen TNF - α nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (NST 6p21). Đây là một gen có nhiều điểm đa hình đơn, điểm đa hình tại vị trí -308 được đánh giá có liên quan đến nguy cơ UTBMTBG. Các nghiên cứu cho thấy alen A của điểm đa hình trên liên quan đến tăng cường sản xuất TNF – α trên cả in vitro và in vivo. Ngoài ra, người mang alen A có tăng nguy cơ UTBMTBG cao hơn khi so sánh với người mang alen G [4], [5]. Gen TGF – β1 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 19 (19q13.1-13.3), có nhiều điểm đa hình, trong đó điểm đa hình tại vị trí -509 C>T đã được 2 đánh giá có liên quan đến nồng độ TGFβ huyết tương. Hơn nữa, phân tích điểm đa hình TGF – β1-509 C>T thấy những cá thể có alen T tăng nguy cơ UTBMTBG so với những cá thể mang alen C [6]. Nhiều nghiên cứu cho thấy các điểm đa hình TNF - α -308 và TGF - β1509 ảnh hưởng đến tiến triển của viêm gan mạn, xơ gan, hình thành, phát triển và di căn của UTBMTBG thông qua việc kiểm soát nồng độ các cytokine tương ứng [3], [7], [8]. TNFα và TGFβ là những cytokine đa chức năng, đóng vai trò kiểm soát nhiều quá trình của tế bào như tăng trưởng, biệt hóa, hình thành mạng lưới gian bào, đáp ứng miễn dịch, sinh mạch máu, chết theo chương trình. Bên cạnh đó, trong vi môi trường sinh u các cytokine này tương tác, hỗ trợ lẫn nhau làm tăng cường quá trình hình thành và tiến triển UTBMTBG [5],[3], [9]. Việt Nam là quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV và mắc UTBMTBG cao với những hậu quả vô cùng nặng nề. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của đa hình hai gen trên với nguy cơ bị UTBMTBG. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa hình gen TNF-α-308 và TGF-β1-509 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có HBsAg dương tính” với 2 mục tiêu: 1. Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của 2 điểm đa hình gen TNF - α - 308, TGF - β1 - 509 ở bệnh nhân UTBMTBG có HBsAg (+). 2. Phân tích mối liên quan của đa hình gen TNF- α - 308, TGF- β1- 509 với nguy cơ UTBMTBG và một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân UTBMTBG có HBsAg (+). 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN Ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) là một bệnh ác tính khởi phát từ tế bào gan (HCC: hepatocellular carcinoma), chiếm đa số các bệnh ác tính của gan (> 90%) [10]. 1.1.1. Dịch tễ ung thư biểu mô tế bào gan trên thế giới Ung thư biểu mô tế bào gan là loại ung thư đứng hàng thứ 6 trong 10 loại ung thư phổ biến trên toàn cầu (thứ 5 với nam, thứ 9 đối với nữ). Đặc điểm dịch tễ của UTBMTBG khác nhau ở các vùng trên thế giới, những vùng có tỷ lệ mắc cao bao gồm Sahara châu Phi, Đông Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, do đây là nơi lưu hành dịch tễ của HBV, loại virus có mối liên quan chặt chẽ với UTBMTBG [11]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính riêng năm 2018 đã có tới 841.000 trường hợp mắc mới UTBMTBG trên toàn cầu, chịu trách nhiệm cho 782.000 trường hợp tử vong cùng năm. Số trường hợp tử vong gần bằng số mới mắc, phản ánh UTBMTBG là một bệnh có tiên lượng nặng, thời gian sống thêm ngắn [12]. Nam giới có mắc bệnh cao hơn nữ, gấp từ 2-4 lần. Tỷ lệ mắc tăng dần theo tuổi, cao nhất khoảng 65-70 tuổi, trong đó ở những vùng lưu hành dịch tễ HBV, đỉnh mắc bệnh thấp hơn chỉ từ 55-60 tuổi [10], [13], [14]. Vài thập kỷ gần đây, xu hướng mắc UTBMTBG thay đổi khá nhiều. Trong khi các vùng có tỷ lệ mắc thấp (Mỹ, trung tâm châu Âu) bệnh có xu hướng gia tăng do liên quan đến béo phì và nhiễm HCV, các vùng trước đây có tỷ lệ mắc cao lại có xu hướng giảm vì áp dụng chương trình tiêm phòng HBV [2]. 4 Hình 1.1. Tỷ lệ mắc ung thư biểu mô tế bào gan chuẩn theo tuổi và giới trên thế giới * Nguồn: Singal, A.(2020) [15] 1.1.2. Dịch tễ ung thư biểu mô tế bào gan Việt Nam Nằm trong khu vực Đông Nam Á, điểm nóng của thế giới về UTBMTBG, Việt Nam có tỷ lệ mắc bệnh cao. Tổng kết một số nghiên cứu được tiến hành tại nhiều địa phương trên toàn quốc, ở các thời điểm khác nhau cho thấy UTBMTBG thực sự là một gánh nặng với nền y tế. Báo cáo của Nguyễn Văn Vy và cs về công tác phòng chống ung thư kéo dài 10 năm tại Hải Phòng (2003) đã cho thấy UTBMTBG có mức độ phổ biến đứng hàng thứ 3 trong các loại ung thư [16]. Một nghiên cứu được khác tiến hành bởi Nguyễn Đình Tùng (2010) tại Thừa Thiên Huế trong thời gian từ 2001 – 2009 với 7234 trường hợp mắc ung thư mới, cũng ghi nhận trong 10 loại ung thư hay gặp, UTBMTBG đứng hàng đầu ở nam với ASRI (Age Standardised Incidence Rate – tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi)/ 100.000 người là 34,8 và đứng thứ 4 đối với nữ [17]. Năm 2018, GLOBOCAN đã công bố tỷ lệ mắc UTBMTBG chuẩn theo tuổi (ASIR) tính chung cho hai giới tại Việt Nam là 23,2 xếp thứ 4 trên toàn cầu sau Mông Cổ (93,7), Ai Cập (32,2) và Giambia (23,9) [1]. 5 Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), UTBMTBG là loại ung thư phổ biến nhất, có xu hướng phát triển nhanh là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong do ung thư ở cả hai giới tại Việt Nam. Dựa vào những số liệu thống kê đã được công bố từ 2010 - 2018 cho thấy UTBMTBG có tốc độ phát triển nhanh thứ 2 đối với nam và thứ 5 đối với nữ. Tính riêng năm 2018 tại Việt Nam, đã có tới 25.335 trường hợp mắc UTBMTBG mới và có tới 20.710 trường hợp tử vong cùng năm [18]. Tương ứng với tình trạng UTBMTBG có tỷ lệ mắc và tử vong cao, thực trạng nhiễm HBV cũng rất đáng lo ngại, theo Robert G. và cs (2011) tiến hành nghiên cứu tại 12 bệnh viện trên toàn quốc từ 2005 – 2008 cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới với gần 12% người có HBsAg (+), khoảng 10 triệu người chung sống với HBV mạn. Tình hình nhiễm HBV khác nhau giữa các vùng: như tại thành phố Hồ Chí Minh, Hà Nội khoảng 10-14%, Thái Bình, Thanh Hóa chiếm 18,8-19%. Tỷ lệ nhiễm HBV thậm chí còn cao hơn ở những bệnh nhân có biểu hiện bệnh lý gan, ước tính lên tới 31,2 - 47%. Nhóm nghiên cứu đã tính toán và đưa ra ước lượng với tình hình nhiễm HBV như trên vào năm 2025, HBV sẽ là nguyên nhân gây nên 56.650 bệnh nhân xơ gan, 25.000 người bị UTBMTBG và 40.000 người tử vong [19]. Rõ ràng tại Việt Nam, gánh nặng UTBMTBG do nhiễm HBV là rất lớn, do vậy thực sự cần có biện pháp hỗ trợ sàng lọc giúp chẩn đoán, điều trị sớm cho bệnh nhân, nhằm cải thiện tiên lượng bệnh. 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô tế bào gan Các yếu tố nguy cơ chủ yếu của UTBMTBG bao gồm nhiễm HBV, HCV, bệnh gan do rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, xơ gan. Các yếu tố nguy cơ khác ít gặp hơn như ứ sắt huyết thanh di truyền, thiếu hụt alpha 1antitrypsin, bệnh gan tự miễn, nhiễm aflatoxin B (AFB1), đái tháo đường typ 2, béo phì...Trong các yếu tố nguy cơ gây UTBMTBG, HBV và HCV là 6 nguyên nhân hàng đầu chiếm tới 80% các trường hợp, trong đó nguyên nhân do HBV chiếm 75-80%, HCV chiếm 10-20%. Yếu tố nguy cơ chính ở những vùng có tỷ lệ bị UTBMTBG cao như các quốc gia châu Á, châu Phi là nhiễm HBV và tiếp xúc với aflatoxin, ngược lại các vùng có tỷ lệ bị UTBMTBG thấp gồm Mỹ, châu Âu lại là nhiễm HCV, nghiện rượu, đái tháo đường và béo phì. Nhiễm HBV chiếm khoảng 60% các nguyên nhân gây UTBMTBG ở các nước đang phát triển, trong khi đối với các nước phát triển tỷ lệ này chỉ khoảng 23% [20]. 1.1.4. Chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan Chẩn đoán xác định Trên thế giới các khuyến cáo chẩn đoán UTBMTBG chủ yếu dựa vào kích thước khối u và tính chất ngấm thuốc, thải thuốc của khối u trên các phương pháp chẩn đoán hình ảnh [21] - Khuyến cáo của AASLD, EASL khối u có kích thước khối u (>1cm), cần tiến hành chụp CT hoặc MRI có tiêm thuốc. Nếu khối có hình ảnh điển hình của UTBMTBG là ngấm thuốc nhanh, hiện rõ thì động mạch và thải thuốc nhanh ở thì tĩnh mạch và thì muộn thì có thể khẳng định chẩn đoán. Sinh thiết chẩn đoán mô bệnh học được đặt ra nếu phương pháp chẩn đoán hình ảnh không thấy hình ảnh điển hình. - Khuyến cáo APASL và JSH khối tăng sinh mạch ở pha động mạch sau đó thải thuốc nhanh ở pha tĩnh mạch được chẩn đoán UTBMTBG. Những khối tăng sinh mạch ở pha động mạch nhưng không có thải thuốc ở pha tĩnh mạch hoặc pha muộn cần đánh giá thêm bằng SPIO-MRI hoặc MRI sử dụng chất đặc hiệu với tế bào, hoặc siêu âm sử dụng Levovist hoặc Sonazoid. Trường hợp những tổn thương ít mạch máu trên pha động mạch của CT hoặc MRI, theo APASL cần đánh giá thêm bằng SPIO-MRI hoặc siêu âm cản âm như trên để khẳng định chẩn đoán, trong khi JSH cần thêm cả Gd-EOB- 7 DTPA-MRI để chẩn đoán xác định, nếu kết quả chỉ có 1 trong 2 phương pháp điển hình cần thêm sinh thiết để chẩn đoán. Tại Việt Nam, năm 2012 Bộ Y tế đã đưa ra hướng dẫn chẩn đoán xác định UTBMTBG khi có 1 trong 3 tiêu chuẩn sau: [22] - Có bằng chứng giải phẫu bệnh - Hình ảnh điển hình trên chụp CT có tiêm thuốc cản quang hoặc MRI có thuốc cản từ + αFP ≥ 400 ng/ml - Hình ảnh điển hình trên chụp CT ổ bụng có cản quang hoặc MRI có cản từ + αFP tăng cao hơn bình thường (< 400 ng/ml) + nhiễm HBV hoặc HCV Chẩn đoán giai đoạn Hiện nay, trên thế giới có nhiều bảng phân loại giúp đánh giá giai đoạn UTBMTBG như phân loại TNM, CLIP, Barcelona, Okuda. Trong đó, phân loại Barcelona được sử dụng rộng rãi do tính ưu việt trong lựa chọn phương pháp điều trị và tiên lượng thời gian sống cho bệnh nhân [21]. 1.1.5. Mối liên quan giữa nhiễm HBV và ung thư biểu mô tế bào gan UTBMTBG có mối liên quan chặt chẽ với nhiễm HBV, các nghiên cứu dịch tễ cho thấy những vùng có tỷ lệ dân số bị nhiễm HBV mạn tính > 8% như châu Á, Sahara, châu Phi song hành với tỷ lệ mắc UTBMTBG cao [20]. Hơn nữa, khoảng 80% các trường hợp UTBMTBG trên thế giới xẩy ra ở các nước đang phát triển, nơi có tỉ lệ nhiễm HBV cao nhất [23]. Trên thực tế nguy cơ UTBMTBG tăng cả đối với những trường hợp nhiễm HBV không hoạt động. Một nghiên cứu trên 20.000 người mang HBV không hoạt động thấy nguy cơ tương đối bị ung thư tăng với RR 4,6, nguy cơ tử vong liên quan đến bệnh gan tăng với RR là 2,1 [24]. HBV gây UTBMTBG qua cả cơ chế trực tiếp và gián tiếp, trong khi cơ chế gián tiếp gây tổn thương gan kéo dài, tăng tái tạo tế bào gan dẫn đến tích lũy các đột biến, thì hiện tượng HBV có khả năng tích hợp vào bộ gen người, 8 gây giảm hoạt động methyl hóa DNA, kết quả làm mất ổn định về nhiễm sắc thể của vật chủ, từ đó phát triển ung thư là cơ chế chính của con đường trực tiếp [25]. Tổng kết các nghiên cứu cho thấy những bệnh nhân nhiễm HBV có nguy cơ UTBMTBG cao hơn khi có kèm một hoặc nhiều các yếu tố sau: HBeAg (+) kéo dài, nồng độ HBV DNA tăng cao (≥ 10 4 copies/ml), HBV genotype C (gấp 2-3 lần so với genotype B), xuất hiện các đột biến của virus viêm gan B như các đột biến tiền nhân, vùng nhân hay mất đoạt pre S [13], [24], [26]. Hình 1.2. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và ung thư biểu mô tế bào gan * Nguồn: Kew M.C. (2010) [23] Tuy nhiên, trên thực tế lâm sàng không phải bệnh nhân nhiễm HBV nào cũng phát triển thành UTBMTBG. Do đó, cả bản thân HBV và cơ thể vật chủ đều có vai trò quan trọng, tương tác với nhau gây nên bệnh cảnh cuối cùng. Tổn thương gan do HBV được cho là thông qua đáp ứng miễn dịch trung gian chủ yếu do hoạt động đặc hiệu của tế bào lympho T với HBV. Khi cơ thể bị nhiễm HBV, vi môi trường viêm có thể làm tăng tần số đột biến của virus thông qua tác dụng cảm ứng tế bào. Tính nhạy cảm di truyền được quy định bởi các yếu tố viêm, các cytokine và chemokin do các tế bào viêm tiết ra kèm theo đó là sự mất cân bằng giữa các cytokine của Th1 và Th2 góp vai trò quan 9 trọng vào phản ứng viêm, hoại tử, tái tạo tế bào gan và phát triển ung thư. Bên cạnh đó, các con đường gây viêm bao gồm các đường dẫn tín hiệu NF-κB, STAT3, Wnt/β catenin và TGF-β1 cũng góp phần vào sự hình thành ung thư. Nghiên cứu những yếu tố trên có ý nghĩa đối với việc giám sát tích cực các đối tượng nhiễm HBV, những người có nhiều khả năng phát triển UTBMTBG, từ đó giúp phân tầng đối tượng nguy cơ, phục vụ chẩn đoán sớm, cải thiện hiệu quả điều trị bệnh. Do vậy, cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá sự di truyền đa hình quy định các cytokine như TNF-α, TGF- β1, IL-6, IL-10 ...với nguy cơ UTBMTBG [26]. 1.2. GEN TNFα, TGFβ VÀ ĐIỂM ĐA HÌNH GEN TNFα-308 G>A, TGFβ1-509 C>T 1.2.1. Khái niệm đa hình nucleotide đơn (SNP) Bộ gen người, phần lớn được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, ít nhất 99,5% số gen giữa hai cá thể bất kỳ sẽ giống hệt nhau, như vậy sự khác biệt chỉ chiếm 0,1% - 0,5%. Đây là điểm mấu chốt tạo ra mỗi cá thể là duy nhất do có các đặc điểm, tính trạng khác nhau (hình dạng, bệnh di truyền …). Nhiều yếu tố trong hệ gen góp phần tạo nên khác biệt trên, trong đó SNP đóng vai trò quan trọng. Thuật ngữ polymorphisms nghĩa là nhiều dạng (poly: nhiều, morphisms: dạng). Single nucleotide polymorphism (SNP) đọc “snip”, được định nghĩa là sự thay đổi base đơn lẻ trên một chuỗi trình tự DNA, thay đổi này chiếm tỉ lệ ≥ 1% trong cộng đồng lớn và được tiếp tục di truyền [27]. Do có 4 loại nucleotide nên mỗi một vị trí SNP của gen có thể có tối đa 4 đa hình tương ứng với bốn loại nucleotide A, C, G và T. SNP có thể xẩy ra trong cả bộ gen của người với tần số 1/250 đôi nucleotide. Điều này có nghĩa là có khoảng 11 triệu SNP trong 3 tỷ nucleotide của bộ gen người. Hầu hết, SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển của cơ thể. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu đã thấy một số SNP có thể giúp dự đoán ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và 10 nguy cơ phát triển bệnh. SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gen bệnh trong gia đình [28], [29], [30]. Hình 1.3. Đa hình gen thay thế nucleotid * Nguồn: Aguiar-Pulido V. và CS (2010) [31] Cơ chế tác dụng của các SNP SNP có thể nằm ở các vùng khác nhau của gen như vùng khởi động, exon, intron hoặc ở vùng không phiên mã (UTR: untranslated regions) 5’và 3’. Các điểm đa hình này ảnh hưởng đến hoạt động của gen bằng những cơ chế khác nhau, phụ thuộc vào vị trí của chúng trên gen. Hình 1.4. Các vùng của gen * Nguồn: Huang W.L. và CS (2014) [32] Vùng khởi động gen (promoter) đóng vai trò quan trọng giúp kiểm soát sự bắt đầu và mức độ sao chép gen, các SNP tại vùng này tác động đến gen thông qua hai cơ chế. Thứ nhất là ảnh hưởng đến hoạt động vùng khởi động do tác dụng lên hộp chức năng TATA (một đoạn DNA nằm cách vị trí phiên mã khoảng 30 nucleotid có trình tự phổ biến là TATAAAT) và hoạt động gắn 11 các yếu tố sao chép. Thứ hai chúng tác động đến biểu hiện gen thông qua tác động lên quá trình methyl hóa DNA như thay đổi số lượng vị trí methyl hóa, ảnh hưởng đến hoạt động gắn yếu tố sao chép gen với các đảo CpG, hoạt hóa các enzyme của quá trình sao chép và gây thay đổi các histon. SNP ở vùng exon có thể ảnh hưởng đến gen bằng cách ức chế quá trình dịch mã, phiên mã của gen. SNP ở vùng intron có những ảnh hưởng khác nhau với quá trình sao mã như thúc đẩy hoặc ức chế khả năng kéo dài RNAs không mã hóa. SNP ở vùng 5’-UTR ảnh hưởng đến dịch mã, trong khi ở vùng 3’-UTR lại ảnh hưởng đến khả năng gắn microRNA [28]. Hình 1.5. Vùng khởi động của đa hình gen và sự nhạy cảm phát triển ung thư * Nguồn: Deng N. và CS (2017) [28] TF:(Transcription factor - yếu tố phiên mã), TFBS:(Transcription factor binding site - vị trí gắn yếu tố phiên mã). Cytokine Cytokine là một nhóm các phân tử protein truyền tin phức tạp. Các phân tử truyền tin này có thể được tiết vào huyết tương hay gắn ở màng tế bào, cho phép thực hiện sự truyền tin giữa các tế bào, các mô khác nhau. Các cytokine có tác dụng phức tạp, thậm chí đối nghịch nhau trong hệ thống miễn dịch tùy 12 vào vị trí tác dụng và nồng độ. Ví dụ IL-1β, TNFα...vừa có tác dụng như yếu tố tiền viêm, vừa có tác dụng như yếu tố chống viêm. Các cytokine kích thích đáp ứng của vật chủ để hạn chế tổn thương tế bào, do dó duy trì sự ổn định nội môi. Mặt khác, chúng cũng đóng góp vai trò quan trọng trong sự hình thành, phát triển ung thư do tác động lên các tế bào miễn dịch, kiểm soát sự phát triển, biệt hóa và di căn của tế bào, đặc biệt khi có hiện tượng mất cân bằng về nồng độ hay rối loạn quá trình truyền tin của các cytokine [33]. Nồng độ cytokine có vai trò quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch, phụ thuộc vào hoạt động các gen tổng hợp chúng. Tính đa hình của các gen quy định cytokine chủ yếu là SNP, các microsatellite nằm ở vùng khởi động hay các vùng kiểm soát sẽ ảnh hưởng đến quá trình sao chép, từ đó quy định nồng độ cytokine ở các cá thể khác nhau. Như vậy, bằng việc cho phép sản xuất các cytokine với các mức độ khác nhau, đa hình của các gen sẽ quyết định các hoạt động đáp ứng miễn dịch. Đây là lý do tại sao sự hiện diện một số các alen của các SNP nhất định có thể ảnh hưởng đến hậu quả của quá trình nhiễm virus, vi khuẩn và tiến trình hình thành bệnh lý ở người. 1.2.2. Gen TNFα và điểm đa hình TNF-α–308 G>A 1.2.2.1. Gen TNF-α và một số điểm đa hình Gen TNF-α Gen TNF-α (Tumor necrosis factor - alpha) nằm ở locus 21.3 của nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), thuộc vùng III của phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC: Major Histo Compatibility complex) Hình 1.6. Vị trí gen TNF-α trên nhiễm sắc thể số 6 * Nguồn: Berlingerio M. và CS (2009) [34] 13 Gen TNF-α có chiều dài khoảng 3kb gồm 4 exon, chứa 2770 cặp bazơ, từ cặp bazơ 31.575.567 đến 41.578.336. Gen trên mã hóa cho phân tử TNF-α với 157 amino acid polypeptid, có khối lượng phân tử 25.644 Da [35], [36], [37], [38]. Hình 1.7. Sơ đồ gen TNF- α và một số điểm đa hình * Nguồn: Pujhari S.K. và CS (2012) [36] Các nghiên cứu đã ghi nhận gen TNF-α có rất nhiều điểm đa hình, đặc biệt tại vùng khởi động như: -1031 (T>C), -863 (C>A), -857 (C>A), -851 (C>T), -419 (G>C), -376 (G>A), -308 (G>A), -238 (G>A), -162 (G>A), và -49 (G>A). Trong đó, những vị trí đột biến tại điểm -149, -163, - 49 ít gặp ở người da trắng. Các SNP khác như thêm một cytosine tại vị trí +70 của exon đầu tiên, hay G>A tại vị trí +488 của intron đầu tiên...[4]. Điểm đa hình gen TNF-α – 308 G>A Những điểm đa hình nucleotid đơn của gen TNF-α có tác dụng trực tiếp đến khả năng sản xuất TNFα huyết tương do chúng thường nằm ở vị trí khởi động của gen. Trong đó điểm đa hình tại vị trí -308 có vai trò quan trọng được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu. SNP này có 2 alen bao gồm: loại chứa -308G (còn được gọi là TNFA*1), loại còn lại hiếm gặp hơn, chứa -308A (còn được gọi là TNFA*2). Tổng kết các nghiên cứu dịch tễ thấy tần suất xuất hiện kiểu 14 gen và alen của đa hình đơn TNF-α 308 (G>A) có độ đa dạng cao, khác nhau ở từng quần thể [5], [37]. 1.2.2.2. Tỷ lệ alen và gen TNF- a – 308 G>A Tỷ lệ đa hình gen và alen của TNF-α – 308 G>A ở các quần thể khác nhau khá đa dạng, nhìn chung alen G xuất hiện ưu thế, alen A xuất hiện với tần suất ít hơn. Sookoian S. và cs (2005) tiến hành phân tích dựa trên 824 tài liệu tham khảo và 31 nghiên cứu đã công bố tần suất mang kiểu gen GA + AA đối với kiểu gen TNF- α – 308 G/A ở quần thể Trung Quốc 18%, Nhật Bản 3%, người da trắng 45%, Phần Lan 36% và Brazil 23% [39]. Tỷ lệ kiểu gen này rất khác nhau giữa các quần thể, với p < 0,001 [40], [41], [42]. Bảng 1.1. Tỷ lệ kiểu gen TNF-α – 308 G>A ở một số quẩn thể ST T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Quần thể N Nam Ấn Độ [37] Tây Ban Nha [37] Phần Lan [37] Úc [37] Đài Loan [37] Đức [37] Hồng Công [37] Nhật [37] Pháp [37] Ai Cập [43] 250 313 490 170 246 176 121 177 710 150 TNF-α - 308 genotype GG (%) GA (%) AA (%) 2 94 4 86 14 74 25 1 31 64 5 84,2 15,4 0,4 67 30 2,84 92,6 7,4 97,2 2,8 85 15 68,8 25,3 6 Tỷ lệ alen A TNF-α-308A ở các quần thể khác nhau rất đa dạng [41], [44]. 15 Bảng 1.2. Tỷ lệ alen A của TNF-α-308 G>A ở một số quần thể STT 1 2 3 4 5 6 Quần thể Ireland (n=100) [45] Macedonia (n=250) [44] Đài Loan (n=246) [37] Ấn Độ (n=216) [46] Brazil (n=200) [46] Việt Nam (n = 2350) [47] Alen A TNF-α - 308 (%) 23,0 13,2 15,8 6,0 14,0 7,0 1.2.3. Gen TGF-β1 và điểm đa hình TGF-β1 – 509 C>T Gen TGF-β1 Gen TGF-β1 (Transforming Growth Factor, Beta 1) là gen mã hóa protein, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 19 (19q13.1-13.3) Hình 1.8. Gen TGF-β1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 19 * Nguồn: Lister Hill National Center for Biomedical Communications (2017)[48] Gen TGF-β1 có chiều dài 23,56 kB, gồm 7 exon, 6 intron, chứa 52.347 đôi bazơ, bắt đầu từ đôi bazơ 41.301.587 đến 41.353.933. Gen TGF-β1 mã hóa cho phân tử protein là TGFB1, đây là một cytokine đa chức năng chứa 390 acid amin, khối lượng phân tử là 44.341 Da [6], [49], [50]. 16 Hình 1.9. Gen TGF-β1 và một số điểm đa hình * Nguồn: Heidari Z. và CS (2013) [51] Điểm đa hình TGF-β1-509 C>T Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được hơn 147 điểm đa hình đơn nằm trên gen TGF-β1. Một vài điểm đa hình đơn đáng lưu ý gồm 3 điểm nằm ở vùng upstream -988 (C>A), -800 (G>A) và -509 (C>T), 1 điểm đa hình nằm ở vùng không sao mã thêm C tại vị trí +72, 2 điểm nằm ở vùng exon 1 tại codon 10 (+869 C>T) và codon 25 (+915 G>C), 263 (C>T) và 1 ở vùng exon 5, codon 629 [52], [53], [54]. 1.2.3.1. Gen TGF-β1 và điểm đa hình TGF-β1- 509 C>T Trong các SNP nói trên, SNP tại vị trí C-509T nằm tại vùng khởi động của gen là một điểm đa hình quan trọng liên quan đến khả năng sao chép gen và sản xuất TGF – β huyết tương [55]. 1.2.3.2. Tỷ lệ kiểu alen và kiểu gen của TGF-β1-509 C>T Tỷ lệ kiểu alen và gen của TGFβ1 – 509 khá đa dạng ở các quần thể khác nhau, trong đó tỷ lệ alen C và T của gen TGF-β1-509 xuất hiện với tỷ lệ khá cân bằng, nhưng không thấy sự nhất quán về kiểu alen ưu thế [50], [52], [56]. 17 Bảng 1.3. Tỷ lệ kiểu gen, alen của TGF-β1-509 ở một số quần thể TGF-β1-509 Alen TT 1. 2. 3. 4. 5. 6. Quần thể N C (%) T (%) 198 TGF-β1-509 Gen CC CT TT 262 (%) 67 (%) 64 (%) 99 (43,04) 441 (56,96) 59 (29,13) 193 (27,83) 55 (43,04) 2 (88,2) 243 (11,8) 127 (77,2) 79 (22) 85 (0,8) 21 140 (65,68) 132 (34,32) 248 (43) 35 (46) 62 (11) 43 (2012) [58] Mexico Nữ 253 (47,1) 238 (52,9) 268 (25) 56 (44,3) 126 (30,7) 71 (2013) [52] Nhật Bản Nữ (47,04) 309 (52,96) 285 (22,13) 76 (49,80) 157 (28,07) 64 (52) (48) (25,6) (52,9) (21,5) Trung Quốc (2015) [57] Ấn Độ (2017) [50] Tây Ban Nha (2005) [56] Iran (2004) [59] 230 250 185 297 1.2.4. Phương pháp xác định điểm đa hình gen Phương pháp giải trình tự trực tiếp hiện đang được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự nucleotid của các gen [60] Phương pháp Sanger - Enzyme DNA polymerase tổng hợp sợi DNA bổ sung từ sợi đơn với là nucleotide. Nguồn nguyên liệu cung cấp cho phản ứng trên ngoài các nucleotide cơ bản (A, T, G, C) có thêm 1% ddNTP (dideoxynucleotide) gồm ddCTP, ddATP, ddGTP, ddTTP có đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh quang. Khác với phân tử nucleotide thông thường, ddNTP thiếu nhóm 3’-OH do vậy nó không tạo được liên kết với nucleotide mới. - Khi men DNA polymerase kéo một ddNTP vào chuỗi, sợi bổ sung sẽ bị chặn lại, kết quả tạo các sợi bổ sung với độ dài khác nhau. Do có nhiều copy 18 của DNA đích được tạo ra đồng thời nên các sản phẩm DNA được tổng hợp mới (tận cùng là dd NTP) có tất cả các kích thước. - Dùng gel polyacrylamide biến tính (có độ phân giải cao) giúp phân biệt các đoạn ADN khác nhau 1 nucleotide - Sản phẩm PCR được phân loại kích thước (khác nhau 1 nucleotide) sẽ được phân tích bằng tia laser đánh giá cường độ huỳnh quang và màu sắc của mỗi đoạn DNA. Trình tự đoạn DNA đọc theo chiều 5’ đến 3’[61]. Hình 1.10. Nguyên lý giải trình tự trực tiếp * Nguồn: Dey P. (2018) [61] Giải trình tự bằng máy tự động Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger phát minh. Hệ thống điện di là điện di mao quản. Khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA phát ra màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang, máy nhận diện được các nucleotide khác nhau, từ đó xác định được trình tự của DNA đích [62]. 19 1.3. MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐIỂM ĐA HÌNH TNF-α–308 G>A VÀ NGUY CƠ UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN 1.3.1. Liên quan điểm đa hình TNF-α–308 G>A và nồng độ TNFα huyết tương 1.3.1.1. Cytokine TNFα và tác dụng hình thành u Cytokine TNFα Yếu tố hoại tử u α (TNFα Tumor necrosis factor α ) là một cytokine đa chức năng thuộc siêu họ TNF, phát huy tác dụng khi kết hợp với hai loại receptor (TNFR-1: TNF- alpha receptor 1, TNFR-2: TNF- alpha receptor 2). TNFα là một protein chứa 157 acid amin, được tổng hợp dưới dạng gắn protein màng (pro – TNF) sau đó được giải phóng bằng enzyme chuyển TNF (TACE). Bình thường trong cơ thể nhiều loại tế bào tham gia sản xuất cytokine trên như đại thực bào, bạch cầu mono, lympho bào T, tế bào gan... Được xác định lần đầu vào năm 1970, những hiểu biết về cytokine này khá đơn giản như được sản xuất bởi các tế bào miễn dịch, có khả năng ức chế tế bào u tăng sinh và gây thoái triển khối u. Tuy nhiên, sau khi được phân lập vào năm 1984, hàng loạt các nghiên cứu đã phát hiện vai trò to lớn của TNFα đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể cũng như ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm virus, vi khuẩn và nguy cơ phát triển nhiều bệnh [63], [64]. Trong cơ thể, TNFα vừa có tác dụng chống ung thư, vừa có tác dụng kích thích hình thành khối u, phát huy ưu thế tác dụng nào là tùy thuộc vào nồng độ và tương tác của cytokine này với vi môi trường xung quanh. Tác dụng chống ung thư của TNFα được thực hiện thông qua hoạt động kích hoạt các con đường dẫn truyền trong tế bào, kiểm soát quá trình sống sót, tăng sinh và chết của tế bào. TNFα gây trình diện các phân tử kết dính trên thành mạch, cho phép các tế bào miễn dịch như bạch cầu trung tính, đại thực bào đến tập trung ở các mô tổn thương, thực hiện chức năng chống nhiễm trùng hay hoạt động dọn vi khuẩn và virus. Mặt khác, TNFα lại kích thích sự tăng sinh, sống 20 sót, di cư và tăng sinh mạch ở phần lớn các tế bào và mô ung thư. Tác dụng này xẩy ra khi xuất hiện những tế bào có khả năng kháng với tác dụng diệt tế bào của TNFα, từ đó hình thành và phát triển u [65], [66]. Tác dụng của TNFα đối với sự hình thành khối u Kou và cs (2013) nghiên cứu ở chuột thấy TNFα kích hoạt con đường NF-κB làm thúc đẩy quá trình hình thành UTBMTBG. Tác giả đã tiến hành thực nghiệm trên 2 dòng tế bào Hep3b và SMMC -7721, ghi nhận việc dùng liều cao TNF-α (100-1000 ng/ml) gây tăng hiện tượng chết theo chương trình nhưng dùng liều thấp (0,1; 1 và 10ng/ml) lại làm giảm quá trình này. Kết quả trên cho thấy TNFα đóng vai trò quan trọng trong hình thành, phát triển UTBMTBG [67]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cũng ghi nhận có hiện tượng tăng nồng độ TNFα ở huyết tương của các bệnh nhân ung thư, các tổn thương tiền ung thư, ung thư, hay hiện tượng nồng độ TNFα giảm khi điều trị ung thư có hiệu quả [63]. Lý giải điều này các tác giả cho rằng TNFα kích thích phát triển khối u bằng nhiều cơ chế khác nhau như: TNFα gây tăng sản xuất các gốc tự do (ROS) trong tế bào góp phần tạo ra những phân tử DNA mất ổn định làm xuất hiện các đột biến gen. TNFα tham gia vào quá trình hình thành, phát triển khối u do gây tăng cường sự chuyển dạng biểu mô thành trung mô (EMT: epithelial mesenchymal transition). Trong quá trình này liên kết giữa các tế bào bị phá vỡ, đó là điều kiện tiên quyết gây nên sự xâm nhập và di căn. Cơ chế chính của sự mất liên kết trên là hiện tượng mất E-cadherin (chất gây kết dính các tế bào). Ảnh hưởng đến giảm và mất E-cadherin có sự tham gia của nhiều yếu tố như Snail/slug, Twist, ZEB1...Trong đó Snail là yếu tố được phát hiện đầu tiên, có tác dụng ức chế E-cadherin nhiều nhất. Mức độ biểu hiện Snail được kiểm soát bởi hệ thống truyền tin bao gồm ILK (Integrin - Linked Kinase), PI3-K (Phosphatidylinositol 3 - Kinase), MAPKs (Mitogen – Activated Protein Kinases), GSK - 3β (Glycogen Synthase Kinase) và con đường truyền