Tài liệu Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật

  • Số trang: 231 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 93 |
  • Lượt tải: 0
nguyetha

Đã đăng 8490 tài liệu

Mô tả:

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BỔ SUNG TỪ VI SINH VẬT" MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC04.05/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp thực phẩm Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm 8570 Hà Nội – 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BỔ SUNG TỪ VI SINH VẬT" MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC.04.05/06-10 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm PGS.TS. Lê Đức Mạnh Ban Chủ nhiệm Chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ Hà Nội – 2010 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACE Angiotensin Converting Enzyme – Enzim chuyển angiotensin ACEI Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory – Chất kìm hãm enzim chuyển angiotensin ACEIPs Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory peptides – Các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin ALT Alanin aminotransferase AST Aspartate aminotransferase BC Bạch cầu CT Cholesterol DOM Các chất hữu cơ hoà tan EMEA Cơ quan đánh giá các sản phẩm y học châu Âu FDA Food and Drug Administration – Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ GFA1, GlmS Glucosamine-6-phosphate synthase GFAT Glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase GlcN Glucosamine GlcNAc N-acetyglucosamine GLUT Glucose transporters GlcN-6-P Enzyme glucosamine-6-phosphate GS Glucosamine sulfate GTF Glucose Tolerance Factor – Nhân tố kích thích dung nạp glucose HCT Hematocrit HGB Hemoglobin HA Huyết áp HAHS Huyết áp hiệu số HATT Huyết áp tâm thu HATTr Huyết áp tâm trương HATB Huyết áp trung bình HC Hồng cầu HDL - C Cholesterol của lipoprotein có tỷ trọng cao (cholesterol tốt) HHL Hippuryl-Histidyl-Leucine ISH International Society of Hypertension - Hội tăng huyết áp thế giới JNC Joint National Committee - Liên Ủy ban Quốc gia Hoa Kỳ LDL - C: Cholesterol của lipoprotein có tỷ trọng thấp (cholesterol xấu) NagA N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylas NIH Viện sức khoẻ quốc gia Mỹ NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs OA Bệnh viêm xương khớp (osteoarthritis) RAAS Hệ thống Renin – Angiotensin - Aldosterol UDP-GlcNAc N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase TC Tiểu cầu TG Triglycerid THA Tăng huyết áp WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới YHCT Y học cổ truyền YHHĐ Y học hiện đại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm enzim chuyển angiotensin tổng hợp 7 Bảng 1.2 Một số peptit kìm hãm ACE thu nhận bằng phương pháp enzim từ nguồn protein thực phẩm 10 Bảng 1.3 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein bằng một số loại protease 11 Bảng 1.4 Một số peptit kìm hãm ACE được tổng hợp từ protein sữa bằng phương pháp lên men 12 Bảng 1.5 Tác dụng hạ huyết áp trên người của một số ACEIPs thương mại 14 Bảng 1.6 Kết quả nghiên cứu tác dụng của crom đối với người mắc bệnh tiểu đường typ 2 21 Bảng 2.1 Các enzim sử dụng trong nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 41 Bảng 2.3 Các thí nghiệm theo ma trận Doehlert 45 Bảng 3.1.1 Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng vi khuẩn DC2 67 Bảng 3.1.2 Hàm lượng peptit và hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm bột sấy phun dịch lên men prtein đậu tương 71 Bảng 3.1.3 Khảo sát khả năng lên men tổng hợp ACEIPs từ protein sữa bò của một số chủng vi khuẩn lactic 72 Bảng 3.1.4 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch sữa bò lên men sử dụng kết hợp các chủng vi khuẩn lactic 72 Bảng 3.1.5 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch sữa bò lên men sử dụng kết hợp Lactobacillus bulgaricus Lac 9 với các chủng nấm men Saccharomyces 73 Bảng 3.1.6 Thành phần môi trường, điều kiện lên men thích hợp để tổng hợp ACEIPs từ sữa bò bằng L. bulgaricus Lac 9 và S. cerevisae TBS 74 Bảng 3.1.7 So sánh kết quả lên men protein sữa bò để thu nhận các peptit kìm hãm ACE trên các thiết bị phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm 77 Bảng 3.1.8 So sánh kết quả lên men protein sữa bò để thu nhận các peptit kìm hãm ACE trên các thiết bị phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm 77 Bảng 3.1.9 Hoạt tính kìm hãm ACE của các peptit thu nhận từ protein sữa bò theo phương pháp lên men qua từng công đoạn thu hồi, làm sạch 78 Bảng 3.1.10 Kết quả sau tinh sạch dịch lên men protein sữa bò bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-25 78 Bảng 3.1.11 Điều kiện cô dịch chứa ACEIPs từ dịch lên men protein sữa bò 81 Bảng 3.1.12 Danh mục thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung Angiofemin chứa các peptit kìm hãm ACE từ protein sữa bò lên men 84 Bảng 3.1.13 Ước tính giá thành sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung Angiofemin chứa các peptit kìm hãm ACE từ protein sữa bò lên men 85 Bảng 3.1.14 Các chỉ tiêu hoá, lý của sản phẩm Angiofemin chứa ACEIP từ protein sữa bò lên men 86 Bảng 3.1.15 Ảnh hưởng của enzim tiêu hoá pepsin và trypsin đến hoạt tính kìm hãm ACE sản phẩm bột sấy phun dịch lên men protein sữa bò 86 Bảng 3.1.16 Độ giảm huyết áp trung bình trên chó tại các thời điểm sau khi uống Angiofemin 87 Bảng 3.1.17 Thay đổi nhịp tim chó tại các thời điểm sau khi uống Angiofemin 88 Bảng 3.1.18 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng peptit tạo thành và hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm thủy phân bằng Flavourzyme 90 Bảng 3.1.19 Kết quả lựa chọn enzim thủy phân casein để thu nhận dịch thủy phân chứa ACEIPs 91 Bảng 3.1.20 Hoạt tính kìm hãm ACE của các phân đoạn dịch thủy phân casein bằng Flavourzyme 91 Bảng 3.1.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein 92 Bảng 3.1.23 Hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm casein thủy phân thu nhận theo các phương pháp sấy khác nhau 93 Bảng 3.1.24 Hiệu suất thu hồi protein từ đậu xanh tách vỏ 94 Bảng 3.1.25 Lựa chọn nguyên liệu để thu nhận ACEIPs từ đậu xanh theo phương pháp enzim 95 Bảng 3.1.22 93 Bảng 3.1.26 Lựa chọn enzim protease để thủy phân và thu nhận ACEIPs từ protein đậu xanh tách vỏ 95 Bảng 3.1.27 Lựa chọn điều kiện thủy phân protein đậu xanh bằng Papain 96 Bảng 3.1.28 Hoạt tính kìm hãm ACE của các mẫu sản phẩm chứa ACEIPs thu nhận từ protein đậu xanh thủy phân bằng Papain 96 Bảng 3.1.29 Lựa chọn điều kiện sấy thu nhận sản phẩm bột chứa ACEIPs từ protein đậu xanh trên thiết bị sấy phun công suất bốc hơi 5 kg/h 98 Bảng 3.1.30 Lựa chọn điều kiện sấy thu nhận sản phẩm bột chứa ACEIPs từ protein đậu xanh trên thiết bị sấy phun công suất bốc hơi 5 -25 kg/h 99 Bảng 3.1.31 Ước tính giá thành cho 100 kg sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung Angiohibin chứa ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 101 Bảng 3.1.32 Danh mục thiết bị trong mô hình sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung Angiohibin 102 Bảng 3.1.33 Các chỉ tiêu hoá, lý, vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm thực phẩm chức năng Angiohibin chứa ACEIP từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 102 Bảng 3.1.34 Các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm Angiohibin chứa ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 103 Bảng 3.1.35 Hàm lượng các axit amin của sản phẩm Angiohibin 103 Bảng 3.1.36 Ảnh hưởng của pepsin và trypsin đến hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm bột protein đậu xanh thủy phân bằng phương pháp enzim 104 Bảng 3.1.37 Độ giảm huyết áp trung bình của chó tại các thời điểm sau khi uống Angiohibin 105 Bảng 3.1.38 Thay đổi nhịp tim chó tại các thời điểm sau khi uống Angiohibin 105 Bảng 3.1.39 Bảng 3.1.40 Sự thay đổi huyết áp của bệnh nhân sau các đợt điều trị 107 Thay đổi huyết áp trung bình của bệnh nhân sau điều trị 107 Bảng 3.1.41 Kết quả nghiên cứu theo độ tăng huyết áp trước và sau điều trị 107 Bảng 3.1.42 Sự biến đổi nhịp tim và mạch của bệnh nhân trước và sau điều trị 108 Bảng 3.2.1 Khả năng phát triển trên môi trường đĩa thạch chứa CrCl3 của các chủng nấm men Saccharomyces 109 Bảng 3.2.2 Xác định khả năng lên men của các chủng nấm men khi bổ sung CrCl3 trong môi trường nuôi cấy 111 Bảng 3.2.3 Khả năng tích lũy crom trong sinh khối tế bào nấm men 111 Bảng 3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ CrCl3 trong môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và hấp thụ ion Cr3+của các chủng nấm men 112 Bảng 3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy đến khả năng hấp thụ ion Cr3+ của các chủng nấm men 113 Bảng 3.2.6 Nghiên cứu lựa chọn phương thức nuôi cấy và thời điểm bổ sung muối crom vào môi trường lên men 113 Bảng 3.2.7 Hàm lượng crom hấp thụ trong sinh khối tế bào nấm men nuôi cấy trong môi trường có bổ sung CrCl3 114 Bảng 3.2.8 So sánh khả năng tích lũy crom khi nuôi cấy nấm men S. cerevisiae TBS trên thiết bị lên men 14 và 500 lít. 116 Bảng 3.2.9 Kết quả làm giàu crom trong sinh khối nấm men sau sản xuất bia 117 Bảng 3.2.10 Hàm lượng protein và crom hữu cơ trong dịch trích ly sinh khối nấm men giàu crom bằng các phương pháp tách chiết khác nhau 118 Bảng 3.2.11 Nghiên cứu thu nhận sinh khối nấm men giàu crom và sản phẩm chứa protein nấm men giàu crom bằng phương pháp sấy phun 119 Bảng 3.2.12 Dự kiến giá thành sản phẩm Chromen từ S. cerevisiae TBS khi sản xuất quy mô pilot trên thiết bị lên men 500 lít 122 Bảng 3.2.13 Dự kiến giá thành sản phẩm Chromin từ nấm men giàu crom 123 Bảng 3.2.14 Danh mục các thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung Chromen 123 Bảng 3.2.15 Các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng của sản phẩm Chromen 124 Bảng 3.2.16 Các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm Chromen 124 Bảng 3.2.17 Chỉ tiêu hóa lý, an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm Chromin 124 Bảng 3.2:18 Hàm lượng các axit amin của sản phẩm Chromen 125 Bảng 3.2.19 Ảnh hưởng của bột sinh khối nấm men giàu crom Chromen lên nồng độ glucose máu chuột nhắt trắng bị gây đái đường bằng Streptozocin 126 Bảng 3.2.20 Ảnh hưởng của Chromin lên nồng độ glucose máu chuột nhắt trắng bị gây đái đường bằng Streptozocin 126 Bảng 3.3.1 Thành phần phản ứng cắt 132 Bảng 3.3.2 Thành phần phản ứng ghép nối 133 Bảng 3.3.3 Thành phần phản ứng cắt AND plasmit 133 Bảng 3.3.4 Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp Elson và Morgan 135 Bảng 3.3.5 Sự phát triển hệ sợi và bào tử các chủng nấm sợi trên môi trường thạch và môi trường nuôi cấy lên men chìm Hiệu suất tổng hợp sinh khối hệ sợi của các chủng nấm sợi trên môi trường lên men chứa glucose, cao nấm men và peptone 145 Bảng 3.3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tổng hợp sinh khối chứa chitin, chitosan của các chủng nấm sợi 146 Bảng 3.3.8 Hàm lượng glucosamine tách chiết từ sinh khối các chủng nấm sợi chứa chitin và chitosan trên một số môi trường nuôi cấy khác nhau 146 Bảng 3.3.9 Hàm lượng sinh khối các chủng Aspergillus niger sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 147 Bảng 3.3.10 Hàm lượng glucosamine và N-acetyl-glucosamine trong sinh khối tế bào các chủng Aps. niger 147 Bảng 3.3.11 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất tổng hợp sinh khối, các hợp chất chitin và chitosan của R. microsporus var. chinensis BG 148 Bảng 3.3.12 Ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối của chủng A. niger AN6 149 Bảng 3.3.13 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh khối, chitin, chitosan, glucosamine của R. microsporus var. chinensis BG 151 Bảng 3.3.14 Kết quả nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm sợi Rhizopus microsporus var. chinensis BG trên thiết bị lên men 500 lít 152 Bảng 3.3.15 Bảng tổng hợp các thông số công nghệ lên men chủng A. niger AN6 quy mô xưởng thực nghiệm trên thiết bị dung tích 100 lít 152 Bảng 3.3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý sinh khối nấm sợi đến hiệu suất thủy phân thu nhận glucosamine 153 Bảng 3.3.17 Ảnh hưởng của các loại axit khác nhau đến hiệu suất thuỷ phân thu nhận glucosamine từ sinh khối nấm sợi 153 Bảng 3.3.18 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thủy phân thu nhận glucosamine 154 Bảng 3.3.19 Lựa chọn nhiệt độ kết tủa glucosamine bằng ethanol 95% 155 Bảng 3.3.20 Lựa chọn thời gian kết tủa glucosamine 155 Bảng 3.3.21 Lựa chọn số lần làm sạch glucosamine bằng ethanol 95% 156 Bảng 3.3.6 145 Bảng 3.3.22 Ảnh hưởng của phương pháp sấy và thời gian bảo quản đến chất lượng cảm quan của glucosamine 157 Bảng 3.3.23 Lựa chọn chất bổ sung tạo sản phẩm Glusamin dạng viên nang cứng 157 Bảng 3.3.24 Ước tính giá thành sản phẩm Glusamin từ sinh khối nấm sợi sản xuất trên thiết bị lên men dung tích 500 lít 160 Bảng 3.3.25 Danh mục các thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung Glusamin 161 Bảng 3.3.26 Một số chỉ số phân tích sản phẩm Glusamin trước khi đóng viên 162 Bảng 3.3.27 Một số chỉ số phân tích sản phẩm Glusamin 162 Bảng 3.3.28 Ảnh hưởng của Glusamin lên số cơn quặn đau của chuột gây đau bằng acid acetic 163 Bảng 3.3.29 Ảnh hưởng của Glusamin lên thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột nhắt trắng gây đau bằng phương pháp mâm nóng 163 Bảng 3.3.30 Ảnh hưởng của Glusamin lên trọng lượng u hạt 164 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS) 4 Hình 1.2 Enzim chuyển angiotensin phân cắt angiotensin I thành angiotensin II và làm vô hoạt bradykinin 4 Hình 1.3 Cơ chế gắn vào trung tâm hoạt động của ACE của Angiotensin I và Captopril 8 Hình 1.4 Cấu trúc mô phỏng của nhân tố kích thích dung nạp glucose (GTF) 19 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của glucosamine, N-acetylglucosamine và galactosamine 25 Hình 2.1 Cấu trúc vector được dùng để tách dòng (pTZ57R/T) và biểu hiện (pESC-HIS) gen 52 Hình 2.2 Mô hình nghiên cứu tác dụng của Angiohibin trên lâm sàng 57 Hình 2.3 Mô hình nghiên cứu tác dụng của Glusamin trên lâm sàng 62 Hình 2.4 Thang điểm VAS 63 Hình 2.5 Đo độ gấp duỗi của khớp gối 63 Hình 3.1.1 Đồ thị khảo sát khả năng lên men tạo ACEIPs của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường chứa protein đậu tương 67 Hình 3.1.2 So sánh hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương từ các chủng Lactobacillus DC2 và Bacillus subtilis 67 Hình 3.1.3 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương khi kết hợp B. subtilis TH2 với các chủng nấm men S. cerevisiae 68 Hình 3.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường (a), protein đậu tương (b), nhiệt độ (c), và pH (d) đến khả năng tạo peptit trong dịch lên men 69 Hình 3.1.5 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương trước và sau khi tối ưu theo thuật toán ma trận Doehlert 70 Hình 3.1.6 So sánh hoạt lực kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương trước và sau khi lọc màng 70 Hình 3.1.7 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs trên bình lên men 10 lít nuôi cấy tĩnh 75 Hình 3.1.8 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs khi nuôi cấy trong thiết bị 14 lít có khuấy định kỳ 76 Hình 3.1.9 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs khi nuôi cấy trong thiết bị 500 lít có khuấy định kỳ 76 Hình 3.1.10 Sắc ký đồ sản phẩm tinh sạch dịch lên men protein sữa bò từ L. bulgaricus Lac 9 và S. cerevisae TBS bằng sắc ký lọc gel Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamide của các mẫu chứa peptit kìm hãm ACE Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản đến hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein sữa bò 78 Hình 3.1.11 Hình 3.1.12 Hình 3.1.13 Hình 3.1.14 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm thực phẩm chức năng Angiofemin Ảnh hưởng của nhiệt độ (a), pH (b), tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian (c) đến khả năng thủy phân casein của Protease Asp 79 80 86 89 Hình 3.1.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian phản ứng tới mức độ thủy phân casein của Nattokinase 90 Hình 3.1.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian phản ứng (B) tới khả năng thủy phân casein của Flavourzyme Kết quả chạy sắc ký lọc gel mẫu dịch thủy phân casein 90 Hình 3.1.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản đến hoạt tính kìm hãm ACE của dịch protein đậu xanh thủy phân bằng enzim Papain 97 Hình 3.1.19 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm thực phẩm chức năng Angiohibin 104 Hình 3.1.20 Kết quả giảm huyết áp theo xếp loại sau điều trị 107 Hình 3.2.1 Sự phát triển của các chủng nấm men Saccharomyces trên môi trường thạch có chứa CrCl3 110 Hình 3.2.2 Sự phát triển và tích lũy crom trong sinh khối S. cerevisiae TBS khi nuôi cấy theo mẻ (A) và theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng (B) trên thiết bị lên men 14 lít 115 Hình 3.2.3 Sự phát triển và tích lũy crom trong sinh khỗi S. cerevisiae TBS khi nuôi cấy theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng trên thiết bị lên men 500 lít 115 Hình 3.3.1 Sản phẩm PCR gen GFA1 129 Hình 3.3.2 Sản phẩm PCR tinh sạch 129 Hình 3.3.3 Điện di đồ plasmids tái tổ hợp được cắt bằng EcoRI 129 Hình 3.3.4 So sánh trình tự gen GFA1 phân lập với trình tự gen GFA1của S. cerevi siae 130 Hình 3.1.17 92 Hình 3.3.5 Điện di đồ ADN tổng số 131 Hình 3.3.5 Điện di đồ ADN tổng số 131 Hình 3.3.7 Điện di đồ sp cắt bằng enzyme EcoR1 và HindIII 131 Hình 3.3.8 Sản phẩm cắt của vector pESC-His và gen GFA1 132 Hình 3.3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pESC-His/GFA 1 134 Hình 3.3.10 Kiểm tra kết quả biến nạp vào KY 117 134 Hình 3.3.11 Kết quả biểu hiện GFA1 trong KY117 136 Hình 3.3.12 Điện di đồ sản phẩm cắt pET21a(+)/GFA1 137 Hình 3.3.13 Điện di đồ sản phẩm biểu hiện gen GFA1 trong E.coli 137 Hình 3.3.14 Điện di đồ sản phẩm cắt bằng enzymes XhoI và BamHI 139 Hình 3.3.15 Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen NagA trong pESC-His 139 Hình 3.3.16 Điện di đồ cắt kiểm tra vector biểu hiện bằng enzyme EcoR1 140 Hình 3.3.17 Kết quả biểu hiện gen NagA trong E.coli 18 142 Hình 3.3.18 Qui trình thu hồi glucosamine từ vi sinh vật tái tổ hợp 144 Hình 3.3.19 Sự thay đổi pH, nồng độ glucose, protein khi nuôi cấy theo mẻ (A), theo mẻ có bổ sung glucose (B), bổ sung glucose và cao nấm men (C) 150 Hình 3.3.20 Sự thay đổi pH, nồng độ glucose, protein khi nuôi cấy Rhizopus microsporus var. chinensis BG theo mẻ có bổ sung glucose (A) và bổ sung thêm glucose và cao nấm men (B) trên thiết bị lên men 500 lít 151 Hình 3.3.21 Phổ LC-MSD của glucosamine từ thành tế bào A. niger AN6 156 Sắc ký đồ phân tích glucosamine từ sinh khối nấm sợi R. microsporus 156 Hình 3.3.22 var. chinensis BG M ỤC L ỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. 1.2. Trang 1 3 CÁC PEPTIT KÌM HÃM ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN (ACEIPs) TỪ NGUỒN PROTEIN THỰC PHẨM 1.1.1. Enzim chuyển angiotensin (ACE) và sự tăng huyết áp 3 1.1.1.1. Cấu trúc của ACE 5 1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của ACE 5 1.1.2. Peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (ACEIPs) 6 1.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ACEIPs 6 1.1.2.2. Cơ chế tác dụng của ACEIPs 7 1.1.2.3. Tính chất và ứng dụng của ACEIPs 8 1.1.3. Công nghệ sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein thực phẩm 9 1.1.3.1. Sản xuất ACEIPs bằng phương pháp enzim 10 1.1.3.2. Sản xuất ACEIPs bằng phương pháp lên men 11 1.1.4. Thử nghiệm và ứng dụng ACEIPs từ protein thực phẩm 13 3 PROTEIN CHỨC NĂNG TỪ SINH KHỐI NẤM MEN CÓ CHỨA CROM HỮU CƠ 1.2.1. Giới thiệu về bệnh tiểu đường 15 1.2.1.1. Định nghĩa 15 1.2.1.2. Phân loại 15 1.2.1.3. Biến chứng của bệnh tiểu đường, biện pháp phòng chống và điều trị 16 1.2.2. Crom và protein chức năng chứa crom hữu cơ từ nấm men 17 1.2.2.1. Crom – vai trò và chức năng đối với dinh dưỡng và sức khoẻ con người 18 1.2.2.2. Crom và nhân tố kích thích dung nạp glucose (GTF) 18 1.2.2.3. Ứng dụng của crom đối với sức khỏe con người 20 1.2.3. Công nghệ sản xuất protein giàu crom hữu cơ từ nấm men 21 15 1.3. GLUCOSAMINE TỪ VI SINH VẬT CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM XƯƠNG KHỚP 25 1.3.1. Vai trò và ứng dụng của glucosamine 25 1.3.1.1. Vai trò của glucosamine trong cơ thể 25 1.3.1.2. Sinh tổng hợp glucosamine trong cơ thể 25 1.3.1.3 Ứng dụng của glucosamine 27 1.3.2. Công nghệ sản xuất glucosamine 29 1.3.2.1. Sản xuất glucosamine từ vỏ các loài giáp xác 30 1.3.2.2. Nghiên cứu, sản xuất glucosamine từ sinh khối nấm sợi 31 1.3.2.3. Nghiên cứu tổng hợp glucosamine bằng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp tạo chủng vi sinh vật biến đổi gen tổng hợp glucosamine cao 35 1. 3. 4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng glucosamine 38 1.3.4.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng glucosamine trên thế giới 38 1.3.4.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng glucosamine ở Việt Nam 39 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 40 2.1. 40 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất 40 2.1.2. Vi sinh vật và phương pháp nuôi cấy 40 2.1.2.1. Vi sinh vật 40 2.1.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm men 41 2.1.2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn 42 2.1.2.4. Môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm sợi 42 2.1.3. Hoá chất, thuốc thử, động vật, thiết bị dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý trên động vật thực nghiệm 43 2.1.4. Dụng cụ, máy móc, thiết bị: 44 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.2.1. 44 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn lactic 2.3. 2.2.2. Định tên các chủng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp giải trình tự rADN đoạn gen ITS-D1D2 44 2.2.3. Phương pháp sàng lọc các chủng nấm men có khả năng chống chịu ion kim loại bằng test thử khuếch tán trên đĩa thạch 45 2.2.4. Phương pháp thu nhận protein đậu xanh 45 2.2.5. Thu nhận các peptit kìm hãm ACE từ protein thực phẩm 46 2.2.6. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng ma trận Doehlert 46 2.2.7. Phương pháp tách và tinh sạch ACEIPs2.2.8. Thu nhận, xử lý sinh khối nấm men chứa crom 46 2.2.8. Thu nhận, xử lý sinh khối nấm men chứa crom 47 2.2.9. Thu nhận sinh khối nấm sợi nấm và tách chiết chitosan, glucosamine 47 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE 48 2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng peptit, protein 48 2.3.3. Phương pháp xác định độ bền của các peptit kìm hãm ACE với nhiệt độ, pH, enzim tiêu hóa pepsin, trypsin và thời gian bảo quản 49 2.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 49 2.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng crom 49 2.3.6. Phân tích hàm lượng glucosamine bằng phương pháp đo quang 50 2.3.7. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hoá, lý, vệ sinh an toàn thực phẩm 50 2.3.8. Phương pháp tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất glucosamine 50 2.3.9. Phương pháp xác định độc tính cấp 53 2.3.10. Phương pháp xác định độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm theo đường uống 53 2.3.11. Xác định tác dụng dược lý của sản phẩm trên động vật thực nghiệm 54 2.3.12. Phương pháp thử nghiệm tác dụng của sản phẩm trên lâm sàng 56 48 Chương 3: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 66 3.1. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THƯC PHẨM CHỨC NĂNG BỔ SUNG CHỨA PEPTIT CÓ HOẠT TÍNH KÌM HÃM ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN TỪ VI SINH VẬT CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG BỆNH CAO HUYẾT ÁP, TIM MẠCH 66 3.1.1. Nghiên cứu sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (ACEIPs) từ protein đậu tương bằng phương pháp lên men 66 3.1.1.1. Khảo sát và lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tổng hợp ACEIPs trên môi trường có chứa protein đậu tương 66 3.1.1.3. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu 68 3.1.1.3. Tinh sạch ACEIPs từ dịch lên men có chứa protein đậu tương 70 3.1.1.4. Tạo sản phẩm dạng bột chứa ACEIPs từ protein đậu tương theo phương pháp lên men 71 3.1.2. Nghiên cứu công nghệ sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển angioten sin (ACEIPs) từ protein sữa bò bằng phương pháp lên men 71 3.1.2.1. Nghiên cứu lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tổng hợp ACEIPs từ protein sữa bò 71 3.1.2.2. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất lên men tổng hợp ACEIPs từ protein sữa bò bằng Lb. bulgaricus Lac9 và S. cerevisae TBS 73 3.1.2.3. Nghiên cứu thu nhận, làm sạch và phân tích các peptit kìm hãm ACE từ protein sữa bò theo phương pháp lên men 77 3.1.2.4. Nghiên cứu tạo sản phẩm thực phẩm chức năng giàu peptit ức chế enzim chuyển angiotensin từ nguồn protein sữa bò. 81 3.1.2.5. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết áp 81 3.1.2.6. Phân tích thành phần, chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm, độc tính và tác dụng dược lý của sản phẩm chứa ACEIPs từ protein sữa bò lên men 85 3.1.3. Nghiên cứu sản xuất (ACEIPs) từ casein bằng phương pháp enzim 89 3.1.3.1. Nghiên cứu lựa chọn enzim thủy phân casein 3.1.3.2. Xác định hoạt tính kìm hãm ACE của các phân đoạn peptit từ 89 91 dịch thủy phân casein 3.2. 3.1.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein 92 3.1.3.4 Thu nhận sản phẩm dạng bột chứa ACEIPs từ casein thủy phân 93 3.1.4. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu xanh theo phương pháp enzim 94 3.1.4.1. Lựa chọn nguyên liệu protein đậu xanh cho nghiên cứu, sản xuất 94 3.1.4.2. Nghiên cứu lựa chọn enzim protease và điều kiện thủy phân protein đậu xanh tách vỏ để thu nhận ACEIPs 95 3.1.4.3. Nghiên cứu xác định một số tính chất của ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân bằng Papain. 97 3.1.4.4. Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị sản xuất thực phẩm chức năng chứa ACEIPs từ protein đậu xanh bằng phương pháp enzim quy mô xưởng thực nghiệm 98 3.1.4.5. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung chứa peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 99 3.1.4.6. Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, tác dụng dược lý của sản phẩm chứa ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 102 3.1.4.7. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của thực phẩm chức năng bổ sung Angiohibin trên người bệnh cao huyết áp 106 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA PROTEIN GIÀU CROM HỮU CƠ TỪ NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TYP 2 3.2.1. Khảo sát và lựa chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy crom cao 109 109 3.2.1.1. Khảo sát và lựa chọn các chủng nấm men chống chịu cao với nồng độ ion crom hóa trị 3 (Cr3+) trên đĩa thạch 109 3.2.1.2. Nghiên cứu lựa chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy Cr3+ từ môi trường lên men chìm 110 3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp để nâng cao khả năng hấp thụ crom của hai chủng S. carlsbergensis BQN và S. cerevisiae TBS 112 3.2.2. Nghiên cứu công nghệ lên men, thu nhận protein chức năng giàu crom từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm 114 3.2.2.1. Nghiên cứu động học quá trình lên men, tích lũy crom trong sinh khối tế bào nấm men trên thiết bị 14 lít 114 3.2.2.2. Kết quả lên men, thu nhận nấm men giàu crom trên thiết bị 500 lít 114 3.2.2.3. Nghiên cứu thu nhận nấm men giàu crom từ sinh khối nấm men sau sản xuất bia 116 3.2.3. Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tách chiết, làm sạch hợp chất chứa crom hữu cơ từ sinh khối nấm men giàu crom 117 3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ, thiết bị để thu nhận sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung chứa protein chức năng giàu crom 119 3.2.5. Hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung có chứa crom hữu cơ từ nấm men 119 3.2.6. Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh tiểu đường typ 2. Phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý trên động vật thử nghiệm 124 3.2.6.1. Kiểm tra phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm 124 3.2.6.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của sản phẩm Chromen, Chromin trên động vật thực nghiệm 125 3.3. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BỔ SUNG CHỨA GLUCOSAMINE TỪ VI SINH VẬT CÓ TÁC DỤNG HÕ TRỢ PHÒNG CHỐNG BỆNH VIÊM XƯƠNG KHỚP 128 3.3.1. Nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ các chủng vi sinh vật tái tổ hợp 128 3.3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự gen GFA1 và NagA 128 3.3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen GFA1, NagA 131 3.3.1.3. Nghiên cứu thu hồi glucosamine từ vi sinh vật tái tổ hợp 143 3.3.2. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa glucosamine từ sinh khối nấm sợi 145 3.3.2.1. Nghiên cứu khảo sát, lựa chọn các chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp sinh khối hệ sợi chứa các hợp chất chitin, chitosan cao để thu nhận glucosamine 145 3.3.2.2. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối hệ sợi để tách chiết glucosamine từ các chủng nấm sợi Rhizopus microsporus var. chinensis BG và A. niger AN6 quy mô PTN, XTN 148 3.3.2.3. Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tách chiết, làm sạch và thu glucosamine từ sinh khối nấm sợi 152 3.3.2.4. Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tạo sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung chứa glucosamine từ sinh khối nấm sợi 156 3.3.2.5. Hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot và sản xuất thực nghiệm 158 3.3.2.6. Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của sản phẩm thực phẩm chức năng Glusamin chứa glucosamine sinh khối nấm sợi 161 3.3.2.7 Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của thực phẩm chức năng Glusamin 164 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 167 TÀI LIỆU THAM KHẢO 171 PHỤ LỤC 187
- Xem thêm -