ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BK
TP HCM
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH
ENZYME α-AMYLASE
SVTH :
NGUYỄN THỊ VÂN LINH
MSSV :
60601261
GVHD :
TS. TRẦN BÍCH LAM
TP Hồ Chí Minh, 1/2011
i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày
ii
tháng
năm 2011
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày
iii
tháng
năm 2011
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt khoảng thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Bách Khoa, nhờ
sự tận tình dạy bảo, giúp đỡ và dìu dắt của quý thầy cô, em đã trưởng thành hơn rất nhiều
trong học tập, trong công việc và trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất
đến tất cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa và đặc biệt là các thầy cô
trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, những người đã dạy em những kiến thức nền tảng
vững vàng nhất để trở thành một kỹ sư trẻ trong tương lai.
Em cũng xin gửi lời chân thành và sâu sắc đến cô TS. Trần Bích Lam, người cô
đáng kính có ảnh hưởng sâu sắc đến em trong quá trình học tập, vì sự tận tình chỉ bảo và
hướng dẫn em trong suốt khoảng thời gian học tập và làm luận văn, giúp em hoàn thành
tốt nhất luận văn của mình.
Con xin cảm ơn nội và ba luôn ở bên cạnh con, hết lòng yêu thương, chăm sóc và
cổ vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua được những giai đoạn khó khăn nhất trong
công việc cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè tôi và các bạn lớp HC06TP, những người đã ở
bên cạnh động viên giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hiểu được giá trị tình bạn chân thành, đẹp
đẽ.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 1 năm 2011
Nguyễn Thị Vân Linh
iv
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.
2
CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME)...........2
1.1.1.
Endo-enzyme
1.1.2.
Exoamylase 5
1.1.3.
α-1,6 enzymes
1.1.4.
Isomerases
1.1.5.
Cyclodextrin Glycosyltransferase 8
1.2.
4
6
7
ENZYME CỐ ĐỊNH..............................................................................................9
1.2.1.
Lịch sử nghiên cứu và phát triển 9
1.2.2.
Định nghĩa
1.2.3.
Đặc điểm của enzyme cố định
1.2.4.
Ưu và nhược điểm của enzyme cố định 11
1.2.5.
Một số phương pháp cố định enzyme
1.2.6.
Những yếu tố ảnh hưởng
1.3.
10
10
11
15
NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AMYLASE CỐ ĐỊNH.........................................16
1.3.1.
α-amylase cố định 16
1.3.2.
β-amylase cố định 17
1.3.3.
Glucosamylase cố định
1.3.4.
Pullulanase cố định 21
1.3.5.
Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase. 22
19
v
1.4.
CHITOSAN..........................................................................................................22
1.4.1.
Giới thiệu về chitosan
22
1.4.2.
Tính chất của chitosan:
23
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.
24
NGUYÊN LIỆU...................................................................................................24
2.1.1.
Enzyme α-amylase 24
2.1.2.
Chitosan
24
2.2.
HÓA CHẤT SỬ DỤNG.......................................................................................24
2.3.
DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU..............................25
2.4.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................25
2.4.1.
Sơ đồ nghiên cứu
25
2.4.2.
Phương pháp cố định enzyme
2.4.3.
Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme
26
30
2.4.4.
Tối ưu hóa quá trình cố định
31
2.4.5.
Xác định tính chất enzyme cố định
2.4.6.
Xác định thông số động học của enzyme cố định
2.4.7.
Xác định hiệu suất cố định enzyme
2.4.8.
Xác định hoạt tính enzyme 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
33
34
34
40
3.1.
CHẾ PHẨM ENZYME α-AMYLASE TỰ DO..................................................40
3.2.
CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME..................................................40
vi
3.3.
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU
SUẤT CỐ ĐỊNH..................................................................................................42
3.3.1.
Khảo sát lượng enzyme sử dụng 42
3.3.2.
Khảo sát thời gian cố định 45
3.3.3.
Khảo sát vận tốc lắc đảo
3.3.4.
Khảo sát kích thước chitosan
3.3.5.
Khảo sát nồng độ glutaradehyde 51
47
49
3.4.
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH..............................................................54
3.5.
KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA α-AMYLASE CỐ ĐỊNH...............................58
3.5.1.
Ảnh hưởng của pH 58
3.5.2.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
3.6.
60
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH...........63
3.6.1.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
3.6.2.
Xác định hệ số phương trình động học Michaelis – Menten
3.7.
63
64
KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH..............65
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67
4.1.
KẾT LUẬN...........................................................................................................67
4.2.
KIẾN NGHỊ..........................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
69
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và
cyclodextrins
3
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase 20
Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố 32
Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do
40
Bảng 3.2: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thể
tích enzyme sử dụng khác nhau
44
Bảng 3.3: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thời
gian cố định khác nhau
46
Bảng 3.4: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những vận
tốc lắc đảo khác nhau 48
Bảng 3.5: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những kích
thước chitosan khác nhau
50
Bảng 3.6: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những nồng
độ glutaraldehyde khác nhau
52
Bảng 3.7: Bảng mã hóa các thông số ảnh hưởng cần khảo sát
55
Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm với ma trận trực giao cấp 2
55
Bảng 3.9: Các hệ số phương trình hồi quy Y và kết quả kiểm định Student
56
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định 59
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định 61
Bảng 3.12: Các phương pháp cố định và chất mang dùng để cố định α-amylase
62
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột
2
Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột 4
Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan 7
Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose
8
Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin
glycosyltransferases. 8
Hình 2.1: Đường chuẩn albumin
36
Hình 2.2: Đường chuẩn glucose 38
Hình 3.1: So sánh hiệu quả các phương pháp cố định
40
Hình 3.2: Cố định enzyme bằng phương pháp liên kết hóa trị
41
Hình 3.3: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme 41
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định43
Hình 3.5: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên lượng enzyme gắn vào
chitosan 43
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định enzyme
45
Hình 3.7: Ảnh hưởng của vận tốc lắc đảo lên hiệu suất cố định enzyme 47
Hình 3.8: Ảnh hưởng của kích thước chitosan lên hiệu suất cố định enzyme
50
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ Glutaraldehyde lên hiệu suất cố định enzyme
52
Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích enzyme và thời gian cố định lên hiệu suất cố định
57
Hình 3.11: Đồ thị vòng dự đoán kết quả quy hoạch thực nghiệm 57
Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định 59
ix
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của α-amylase tự do và cố định
60
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc thủy phân
Hình 3.15: Mối liên hệ giữa 1/V và 1/[S]
64
64
Hình 3.16: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định
x
66
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
MỞ ĐẦU
Amylase rất quan trọng trong quá trình đường hóa tinh bột, đồng thời amylase
cũng có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm như: sản xuất syrup glucose, syrup
giàu fructose, syrup maltose, giảm độ nhớt của sugar syrup, hòa tan và đường hóa tinh bột
để lên men cồn trong công nghiệp rượu bia…Trong hầu hết các trường hợp, quá trình sử
dụng enzyme bị ức chế khi nồng độ cơ chất, sản phẩm cao và khi sử dụng enzyme nhiều
lần hoặc lâu cũng làm enzyme mất ổn định. Chính vì thế quá trình cố định enzyme rất
quan trọng để sử dụng enzyme liên tục và tái sử dụng nhiều lần trong công nghiệp, và dễ
dàng tách enzyme ra khỏi sản phẩm. Điều này rất quan trọng trong việc phát triển thiết bị
phản ứng sinh học có tính khả thi về kinh tế dùng trong công nghiệp thủy phân tinh bột.
Trong thời gian qua, trên thế giới và Việt Nam đã thực hiện nhiều công trình
nghiên cứu cố định α-amylase trên các chất mang khác nhau. Tuy nhiên quá trình thực
hiện khá phức tạp, hạn chế khi ứng dụng trong công nghiệp. Để đáp ứng cho mục tiêu ứng
dụng thuận tiện trong công nghiệp, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu cố định
α-amylase trên chitosan. Từ trước đến nay, chitosan chỉ được hoạt hóa xử lý ở dạng dung
dịch, do đó cần thêm quá trình tạo hạt hoặc tạo màng, nhưng ở đây chúng tôi tiến hành sử
dụng chitosan ở dạng rắn để thuận tiện tạo cột thủy phân tinh bột. Chitosan là chất mang
được ưu tiên chọn lựa vì chitosan là một polymer có cấu trúc siêu lỗ dễ dàng hấp phụ
enzyme đồng thời trong phân tử chitosan có các nhóm amino hoạt động dễ dàng liên kết
cộng hóa trị với một nhóm aldehyde của glutaraldehyde, tạo cầu nối để liên kết cộng hóa
trị với nhóm amino của enzyme.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ xác định điều kiện để cố định α-amylase và
khảo sát tính chất của α-amylase cố định. Nội dung nghiên cứu gồm có:
Khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định.
Tối ưu hóa 2 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến quá trình cố định.
Khảo sát tính chất của enzyme cố địnhvà xác định hiệu quả sử dụng enzyme cố
định.
1
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.
CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME)
[3, 13, 15]
Có 5 nhóm enzyme cơ bản tham gia thủy phân tinh bột:
Nhóm endoamylase và exoamylase thủy phân chủ yếu ở liên kết α–1,4
glycoside.
Nhóm enzyme cắt mạch nhánh (debranching enzyme) thủy phân liên kết α–1,6
glycoside.
Nhóm isomerase xúc tác phản ứng chuyển đồng phân hóa từ glucose thành
fructose, được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất syrup fructose từ syrup
glucose.
Nhóm cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân tinh bột đồng thời xúc tác
quá trình tạo vòng cyclodextrin.
Các enzyme chuyển hóa tinh bột
α–1,4–glucanases
Endo–
Exo–
α–amylase
β–amylase
Glucoamylase
Isopullulanase
α–glucosidase
α–1,6–glucanases
Endo–
Pullulanase
Isoamylase
Exo–
Exopullulanase
Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột
2
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1: Các enzyme thủy phân tinh bột
3
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và
cyclodextrins[15]
Loại
Endoamylase
Exoamylase
α-1,6-amylase
Exo-α-amylase
Isomerase
pHopt
Topt (oC)
α-1,4-glycoside
6,0
65 – 70
B. licheniformis
α-1,4-glycoside
5,0 – 7,0
90
Aspergillus oryzae
α-1,4-glycoside
4,5
50 – 60
α-1,4-glycoside
4,0 – 5,0
60
Nguồn
Vị trí xúc tác
Bacillus subtilis
A.niger
α-1,6-glycoside
Bacillus sp.
α-1,4-glycoside
5,0
55 – 60
Clostridium sp.
α-1,4-glycoside
5,5 – 6,0
75 – 85
Klebsiella aerogenes
α-1,6-maltotrioside
5,0
60
Pseudomonas sp.
α-1,6-heptasacch
4,0
50 – 55
Streptomyces griseus
α-1,4-glycoside
–
–
B.subtilis
α-1,4-glycoside
–
–
B.circulans
α-1,4-glycoside
–
–
Pseudomonas stutzeri
α-1,4-glycoside
–
–
Pseudomonas sp.
α-1,4-glycoside
–
–
B.subtils
α-1,4-glycoside
–
–
B.circulans
α-1,4-glycoside
–
–
8,2
65
Aldo/keto pentose
B.circulans
Aldo/keto hexose
B.macerans
α-1,4-glycoside
5,0
50
Thermoanaerobacter
sp.
α-1,4-glycoside
4,5
90
Endo/Exocellulase
Trichoderma reesei
β-1,4-glycoside
–
–
Endoprotease
B.licheniformis
6,5
90
Glucanotransferas
e
–
4
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột
Chú thích:
A: α-amylase.
O: gốc glucose.
D: Enzyme cắt mạch nhánh.
O-O: liên kết α-1,4.
B: β-amylase.
→O: liên kết α-1,6.
G: glucoamylase.
Ø, đầu tận cùng khử.
1.1.1. Endo-enzyme
Cơ chế tác dụng: Endo-enzyme thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong amylose,
amylopectin, và các polysaccharide tương tự nhưng không thủy phân liên kết α-1,6
glycoside trong amylopectin. Sản phẩm thủy phân là các oligosaccharide có độ dài chuỗi
khác nhau và có cấu tạo α trên carbon C1 của nhóm khử trong phân tử glucose.
Có hai endoamylase khác nhau (EC 3.2.1.1): bền nhiệt và không bền nhiệt.
α-Amylase bền nhiệt có nguồn gốc vi khuẩn và thu nhận từ chủng Bacillus. Hiện nay, hai
loại α-amylase thương mại quan trọng là:
Amylase từ B.subtilis nếu có mặt ion Ca2+ thì enzyme này sẽ có nhiệt độ tối ưu
trong khoảng từ 65 đến 70oC.
5
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Amylase từ B.licheniformis hoạt động và ổn định trong dung dịch tinh bột ở
nhiệt độ trên 90oC, sự ổn định tương đối độc lập với ion Ca 2+, và enzyme này
hoạt động tốt hơn với khoảng pH rộng.
1.1.2. Exoamylase
Cơ chế tác dụng: Một số có thể cắt liên kết α-1,6 glycoside (hình 1.2), nhưng tốc
độ phản ứng chậm hơn so với khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside. Exoamylase hoạt
động trên các liên kết bên ngoài từ đầu tận cùng không khử và tạo ra các sản phẩm khối
lượng phân tử thấp.
Hai loại exoenzyme quan trọng trong thủy phân tinh bột được ứng dụng trong công
nghiệp là: glucoamylase và β-amylase.
2.
Glucoamylase
Glucoamylase (EC 3.2.1.3) có nguồn gốc từ nấm. Enzyme này thủy phân liên kết
α-1,4 glycoside từ đầu tận cùng không khử, giải phóng ra phân tử ᴅ-glucose cấu hình β.
Glucoamylase cắt phân tử ᴅ-glucose ở đầu nhánh phân tử amylopectin, bắt đầu thủy phân
ở liên kết α-1,6 glycoside, nhưng chậm hơn nhiều khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside.
Enzyme này là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng đã được ứng dụng rộng
rãi trên thế giới. Glucoamylase sử dụng quan trọng nhất là sản xuất syrup giàu glucose
(96 – 98% glucose) và syrup giàu fructose (55% fructose).
Ở nồng độ glucose cao, glucoamylase tái tổng hợp các phân tử glucose hình thành
maltose và isomaltose. Hiện tượng này xảy ra rõ hơn ở nồng độ cơ chất cao và nồng độ
enzyme cao. Trong dung dịch glucoamylase thô thường có mặt transglucosidase (EC
2.4.1.24), enzyme này cũng có khả năng trùng hợp glucose.
3.
β-amylase
Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2), có nguồn gốc thực vật. Lúa mạch, lúa mì, khoai
tây và đậu nành là những nguồn phổ biến để thu nhận β-amylase. Tuy nhiên, β-amylase
cũng tồn tại như một enzyme ngoại bào trong Bacillus sp. và Pseudomonas sp.
6
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
β-amylase hoạt động theo kiểu exo, thủy phân từ đầu tận cùng không khử của
chuỗi bên ngoài phân tử tinh bột hoặc polysaccharide tương tự, và mạch ngắn dần tạo βmaltose. Amylose được chuyển hoàn toàn thành maltose, ngược lại amylopectin và các
polymer mạch nhánh khác được thủy phân thành nhiều sản phẩm khác nhau phụ thuộc
vào mức độ phân nhánh, kết quả quá trình thủy phân này khoảng 50 – 60% chuyển thành
maltose. Kết quả này là do β-amylase không thể thủy phân liên kết α-1,6 glycoside.
Enzyme β-amylase đạt hoạt tính cao nhất ở pH 5. Nhiệt độ tối ưu trong khoảng giữa 55 và
60oC.
3.1.1. α-1,6 enzymes
Các enzyme α-1,6 (hay còn gọi là các enzyme cắt nhánh - debranching enzyme),
vài thập niên qua đã được biết đến nhưng chưa phổ biến, như pullulanase (EC 3.2.1.41)
và isoamylase (EC 3.2.1.68). Gần đây các enzyme này thu hút nhiều sự chú ý, do có thể
cải thiện hiệu suất thủy phân khi có mặt một enzyme cắt nhánh trong hệ thống.
Các enzyme cắt nhánh có 2 nhóm, có hoạt tính endo có thể thủy phân liên kết α-1,6
glycoside ở điểm nhánh của amylose, glycogen, pullulan và các oligosaccharide tương tự:
Nhóm đầu tiên là pullulanase, thủy phân đặc hiệu liên kết α-1,6 glycoside, giải
phóng các oligosaccharide mạch thẳng gồm các nhóm glucose liên kết bằng
liên kết α-1,4 glycoside.
Nhóm thứ hai là neopullulanase và amylopullulanase, có hoạt tính nhắm vào cả
liên kết α-1,6 và α-1,4 glycoside.
4.
Pullulanase
Pullulanse được phát hiện đầu tiên vào năm 1961 và thu hút sự chú ý vì nó hoạt
động đặc hiệu trên liên kết α-1,6 glycoside của pullulan (pullulan là một polymer ᴅglucose mạch thẳng bản chất gồm các đơn phân maltotriosyl liên kết với nhau bằng liền
kết α-1,6 glycoside), tinh bột, amylopectin, và các oligosaccharide tương tự.
Pullulanase thủy phân tinh bột tạo các sản phẩm có DP trung bình thay đổi từ 115
đến 2300. Enzyme này thường dùng kết hợp với glucoamylase, α- hoặc β-amylase.
7
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan
Chú thích:
O: gốc glucose.
O-O: liên kết α-1,4.
→O: liên kết α-1,6.
5.
Isoamylase
Isoamylase được phát hiện vào năm 1949, được thu nhận ở phòng thí nghiệm từ
một số vi sinh vật như K. aerogenes và Pseudomonas sp. Enzyme này thủy phân liên kết
α-1,6 glycoside trong amylopectin và có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính trên
pullulan.
Trong phản ứng thủy phân tinh bột, khi sử dụng isoamylase trước glucoamylase,
phần amylopectin được tách khỏi polymer nhanh chóng và vì thế rất dễ bị hồ hóa. Thời
điểm cho isoamylase vào hệ thống thủy phân rất quan trọng.
5.1.1. Isomerases
Glucose isomerase (EC 5.3.1.5) được ứng dụng quan trọng nhất trong công nghiệp
thực phẩm là dùng để chuyển glucose thành fructose (hình 1.4).
Cobalt được biết đến là chất hoạt hóa glucose isomerase, nhưng glucose isomerase
từ một số nguồn lại không cần ion cobalt. Magnesium là một chất hoạt hóa khác của
những enzyme này. Ngược lại, calcium và oxygen có tác động ức chế, tác động ức chế
của calcium có thể khắc phục bằng cách cho magnesium vào, ngược lại tác động của
oxygen được khắc phục nhờ quá trình nhiệt. Vì thế, việc tinh sạch cơ chất (glucose syrup)
rất quan trọng để enzyme ổn định.
8
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
Glucose
isomerase
Glucose
Fructose
Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose
5.1.2. Cyclodextrin Glycosyltransferase
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) thủy phân một loạt đầu
không khử cyclomaltooligosaccharides chuyển thành cyclodextrin, gồm 6, 7 hoặc 8 nhóm
ᴅ-glucopyranol. Các enzyme cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân cắt mạch nhánh
của tinh bột và xúc tác tạo vòng.
α-cyclodextrin
β-cyclodextrin
Phân tử tinh bột
γ-cyclodextrin
Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin glycosyltransferases.
Chú thích:
→, vị trí thủy phân
O-O, liên kết α-1,4.
O, gốc glucose.
→O, liên kết α-1,6..
CGTase được sản xuất chủ yếu bởi giống Bacillus. CGTase từ B. macerans khi
thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra α-cyclodextrin, ngược lại CGTase bền nhiệt từ B.
9
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase
GVHD: TS. Trần Bích Lam
stearothermophilus khi thủy phân tinh bột sản xuất cả α- và β-cyclodextrin và B. subtilis
CGTase thì tạo ra chủ yếu là γ-cyclodextrin.
5.2.
ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 9, 16, 31, 32]
5.2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển
Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và thấy rằng enzyme invertase của nấm men
khi hấp phụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose.
Năm 1949, Micheal và Iuers đã sử dụng phương pháp azide hóa carboxymethyl
cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính.
Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzyme như carboxy
peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa
trị và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot.
Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme để chống
lại dị ứng khi đưa enzyme vào cơ thể.
Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công khi nhốt các enzyme như
amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide.
Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định
carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này, Chang đã triển khai
phương pháp tạo vi nang để nhốt enzyme carbonic anhydrase.
Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất
glucose bằng glucoamylase cố định. Cũng trong năm này, Chibata và các cộng sự đã thực
hiện thành công áp dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp.
Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzyme: β-galactosidase,
hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex.
10
- Xem thêm -