Tài liệu Nghiên cứu chọn tạo, hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò (pleurotus sp.) và nấm chân dài (clitocybe sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ XUÂN NGHIỄN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO, HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM SÒ (PLEUROTUS SP.) VÀ NẤM CHÂN DÀI (CLITOCYBE SP.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TSKH. Trịnh Tam Kiệt 2. PGS.TS. Đặng Trọng Lƣơng Hà Nội, 2017 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình ― Nghiên cứu chọn tạo, hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò (Pleurotus sp.) và nấm chân dài (Clitocybe sp.) đã được tập thể tác giả đồng ý cho phép nghiên cứu sinh sử dụng bảo vệ luận án tiến sĩ. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chưa hề được sử dụng bảo vệ một học vị của tác giả nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều được chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn. Hà Nội, ngày .... tháng ..... năm 2017 Tác giả Ngô Xuân Nghiễn i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận án này, bên cạnh sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các cá nhân, tập thể và đơn vị khác. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt và PGS.TS Đặng Trọng Lương, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Cố GS.TS Nguyễn Hữu Đống, cử nhân Đinh Xuân Linh, cử nhân Nguyễn Thị Sơn là người thầy, người anh/chị đã giúp đỡ tôi trong những chặng đường đầu tiên đến với nghề nấm. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và phát triển nấm, Trung tâm Nấm Văn Giang đã đồng hành cùng tôi trong phần lớn quá trình nghiên cứu. Tôi gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ quý báu của Lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền và các phòng ban chức năng của Viện. Tập thể cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cộng tác, giúp đỡ tôi trong việc thực hiện đề tài nghiên cứu. Lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tập thể các thầy cô trong Ban đào tạo Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học và các phòng ban chức năng của Học viện đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi về thời gian, cơ sở vật chất, học thuật và nhân lực. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình, đã luôn ở bên, chăm lo, động viên tôi về vật chất, tinh thần và TS. Nguyễn Thị Bích Thùy cùng toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày .... tháng ..... năm 2017 Tác giả Ngô Xuân Nghiễn ii MỤC LỤC Lời cam đoan ....................................................................................................................... i Lời cảm ơn .......................................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................................. iii Danh mục chữ viết tắt ........................................................................................................ vi Danh mục bảng ................................................................................................................. vii Danh mục hình .................................................................................................................... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 2 4. Phạm vi nghiên cứu của đề tài. ............................................................................. 2 4.1. Nấm sò .................................................................................................................. 2 4.2. Nấm chân dài ........................................................................................................ 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................. 3 5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 3 5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................... 3 5.3. Tính mới của luận án ............................................................................................ 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 5 1.1. Nấm lớn và giá trị dinh dưỡng của nấm lớn ......................................................... 5 1.1.1. Giá trị dinh dưỡng của nấm ăn ............................................................................. 5 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng cụ thể của một số một số loài nấm ăn .................................. 5 1.1.3. Giá trị dinh dưỡng, dược học của một số loài nấm sò, nấm chân dài. ...................... 8 1.2. Vị trí phân loại, phân bố, đa dạng, chu trình sống của nấm sò, nấm chân dài ........... 18 1.2.1. Vị trí phân loại .................................................................................................... 18 1.2.2. Chu trình sống của nấm đảm (nấm sò, nấm chân dài) ........................................ 20 1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm ............................................................... 22 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm trên thế giới........................................... 22 1.3.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm ở Việt Nam ........................................... 31 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của sợi nấm và quả thể (nấm sò, nấm chân dài) ...................................................................................................... 35 1.4. Vai trò của trồng nấm trong sự phát triển nông nghiệp bền vững ...................... 40 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 42 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 42 iii 2.1.1. Giống nấm: ......................................................................................................... 42 2.1.2. Vật tư hóa chất .................................................................................................... 43 2.1.3. Các điều kiện, trang thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm ................... 44 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 45 2.2.1. Thu thập, lai tạo và tuyển chọn chủng nấm sò mới. ........................................... 45 2.2.2. Thu thập, tuyển chọn chủng nấm chân dài nhập nội. ......................................... 48 2.2.3. Phương pháp RAPD - PCR kết hợp với đặc điểm hình thái để nhận diện các chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội và nấm chân dài. .................................. 49 2.2.4. Nghiên cứu quy trình công nghệ nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm sò lai và nấm chân dài có triển vọng trong nghiên cứu ................ 50 2.2.5. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng chủng nấm sò lai, nấm chân dài có triển vọng ................................................................................. 52 2.3. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện thí nghiệm ............................... 55 2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................... 56 2.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 58 2.6. Địa điểm và thời gian thí nghiệm ....................................................................... 58 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 59 3.1. Thu thập, lai tạo và tuyển chọn chủng nấm sò mới. ........................................... 59 3.1.1. Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm sò thương phẩm hiện có ở trong nước và nhập nội ................................................................................................. 59 3.1.2. Kết quả lai tạo nấm sò từ nguồn bố mẹ là một số chủng nấm thương phẩm nhập nội có các đặc tính ưu việt đã được nuôi trồng ở Việt Nam ............ 61 3.1.3. Kết quả Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm sò lai tạo. ........................... 65 3.2. Thu thập, tuyển chọn chủng nấm chân dài nhập nội. ......................................... 75 3.2.1. Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm chân dài Clitocybe maxima (Gantn.ex Mey.Fr.) nhập nội .............................................................................. 75 3.2.2. Một số đặc điểm sinh học cơ bản của chủng nấm chân dài (Bi), (Bi0) nhập nội............................................................................................................... 78 3.3. Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội và nấm chân dài bằng chỉ thị RAPD - PCR .................................... 84 3.3.1. Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội bằng chỉ thị phân tử RAPD - PCR................................................... 84 3.3.2. Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm chân dài nhập nội bằng chỉ thị phân tử.............................................................................. 96 iv 3.4. Nghiên cứu quy trình công nghệ nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm sò lai (P7) và nấm chân dài (Bi) có triển vọng ............ 103 3.4.1. Kết quả nghiên cứu công nghệ nhân giống cấp 1 nấm chân dài, nấm sò lai dạng dịch thể ................................................................................................ 103 3.4.2. Kết quả nghiên cứu nhân giống nấm sò lai và nấm chân dài dạng dịch thể cấp trung gian (cấp 2) ................................................................................. 110 3.5. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng chủng nấm sò lai P7, nấm chân dài Bi ......................................................................... 118 3.5.1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò lai P7 và nấm chân dài Bi trên cơ chất tổng hợp bằng giống nấm trên cơ chất hạt (công nghệ cũ) ..................................................................................................................... 118 3.5.2 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò lai P7 và nấm chân dài Bi trên cơ chất tổng hợp bằng giống nấm trên môi trường dịch thể (công nghệ mới) ................................................................................................ 128 3.6 Tóm tắt quy trình công nghệ nhân giống, nuôi trồng một số chủng nấm có triển vọng ..................................................................................................... 134 3.7.1. Quy trình công nghệ nhân giống nấm sò lai P7 dạng dịch thể ......................... 134 3.6.2. Quy trình công nghệ nhân giống nấm chân dài Bi dạng dịch thể ..................... 135 3.6.3. Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm sò lai P7 trên cơ chất tổng hợp ............. 136 3.6.4 Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm chân dài Bi trên cơ chất tổng hợp .......... 138 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 140 Kết luận .......................................................................................................................... 140 Kiến nghị......................................................................................................................... 141 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ....................................................................................................................... 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 143 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt CT Công thức CNM Cao nấm men [CO2 ] Nồng độ CO2 CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide ĐC Đối chứng ĐK Đường kính dNTPs Deroxyribonucleotide Triphotphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid KLC Khuẩn lạc cầu PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân bản gen) PGA Potato glucose agar PĐ/C Phương pháp ủ nguyên liệu đối chứng ppm Part per milion PTN Phương pháp ủ nguyên liệu thí nghiệm PSK Polysaccharide krestin RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (dùng đoạn ngẫu nhiên Oligonucleotid DNA trong PCR) SK Sinh khối T Thời gian TB Trung bình TE Tris EDTA THT Thời gian hình thành TXH Thời gian xuất hiện UV Ultra violet ray V/N/M Lít không khí/lít môi trường/phút FPLC Fast protein liquid chromatography LSD0,05 Kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% CV% Hệ số biến thiên vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân tích dinh dưỡng của các loài nấm ăn khác nhau .......................................... 6 Bảng 1.2 Hàm lượng chất khoáng (mg/100g) trong một số loài nấm ăn khác nhau ..................... 6 Bảng 1.3 Các chất kháng dinh dưỡng (mg/g) trong các loài nấm ăn khác nhau......................... 7 Bảng 1.4 Hoạt tính enzyme thủy phân ngoại bào (mm) ở các loài nấm ăn khác nhau ........ 7 Bảng 1.5 Hàm lượng chất khô (g/100g lượng chất tươi), thành phần gần đúng (g/100g lượng chất khô) và năng lượng (kcal/kg lượng chất tươi) .................... 11 Bảng 1.6 Tỷ lệ axit amin thiết yếu (% của tổng số axit amin) trong các protein nấm nuôi trồng ........................................................................................................... 12 Bảng 1.7 Tỷ lệ axit béo chủ yếu (% trong tổng số axit béo) ............................................. 13 Bảng 1.8 Hàm lượng đường hòa tan và polyol (g/100g chất khô) ................................... 14 Bảng 1.9 Tỷ trọng chất xơ tổng số (TDF, % chất khô) và thành phần monosaccharide trong tổng lượng chất xơ (% polysaccharide tổng số) ở nấm sò nâu Pleurotus sajor-caju ....................................................................... 15 Bảng 1.10 Hàm lượng một số nguyên tố khoáng chính (mg/100g chất khô) trong một số loài nấm tự nhiên .................................................................................... 15 Bảng 1.11 Sự biến đổi của 3 chất khoáng chính của nấm Clitocybe nebularis (mg/100g chất khô) ............................................................................................ 15 Bảng 1.12 Hàm lượng provitamin ergosterol (mg/100g chất khô) và tocopherol (μg/100g chất khô)hòa tan trong chất béo ......................................................... 16 Bảng 1.13 Hàm lượng vitamin tan trong nước ở nấm sò Pleurotus ostreatus nuôi trồng (mg hay μg/100gchất khô) ........................................................................ 16 Bảng 1.14 Kết quả phân tích chủng nấm sò lai trắng Pl1................................................... 17 Bảng 1.15 Kết quả phân tích hàm lượng một số thành phần dinh dưỡng của nấm chân dài Bi (Tính theo chất khô tuyệt đối) ........................................................ 17 Bảng 2.1. Nguồn giống nấm sò, nấm chân dài .................................................................. 42 Bảng 2.2 Danh sách mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu các chủng nấm sò, nấm chân dài .............................................................................................................. 43 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái hệ sợi, quả thê và năng suất của các giống nấm sò thương phẩm, nhập nội ...................................................................................... 59 Bảng 3.2 Danh sách dòng đơn bội của các chủng nấm sò khác nhau ................................ 61 Bảng 3.3 Danh sách các con lai tạo ra ............................................................................... 63 vii Bảng 3.4 Sự sinh trưởng, phát triển của nấm sò lai trong pha sợi .................................... 65 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thành quả thể của các chủng nấm sò lai ..................................... 67 Bảng 3.6 Năng suất thu hái một số chủng nấm sò lai ........................................................ 69 Bảng 3.7 Nguồn vật liệu nấm sò đánh giá trong nuôi trồng. ............................................. 70 Bảng 3.8 Tốc độ sinh trưởng, phát triển hệ sợi các chủng nấm sò trên giá thể nuôi trồng ................................................................................................................... 70 Bảng 3.9 Đặc điểm hình thái hệ sợi, tỷ lệ nhiễm của các chủng nấm sò trên giá thể nuôi trồng ........................................................................................................... 72 Bảng 3.10 Đặc điểm hình thành quả thể của các chủng nấm sò ........................................ 73 Bảng 3.11 Năng suất thu hái một số chủng nấm sò lai, nhập nội qua nuôi trồng thử nghiệm ................................................................................................................ 74 Bảng 3.12. Phân tích chất lượng chủng nấm sò lai P7 với chủng đối chứng Pl1 .............. 75 Bảng 3.13 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các chủng nấm chân dài ........................ 76 Bảng 3.14 Đặc điểm cấu thành năng suất của các giống nấm chân dài............................ 77 Bảng 3.15 Đánh giá năng suất và chất lượng nấm chân dài .............................................. 77 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 trong môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi nấm chân dài ..................................................................................... 80 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của quá trình khử trùng đến pH môi trường .................................. 81 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển sợi nấm chân dài .......................... 82 Bảng 3.26 Bảng tổng hợp số băng xuất hiện trên từng mồi, loại băng và số băng cá biệt có mặt của từng mẫu nấm nghiên cứu ....................................................... 93 Bảng 3.27 Hệ số tương đồng di truyền của 10 mẫu nấm nghiên cứu ................................ 94 Bảng 3.28 Bảng tổng hợp số băng xuất hiện trên từng mồi, loại băng và số băng cá biệt có mặt của từng mẫu nấm nghiên cứu ...................................................... 101 Bảng 3.29 Hệ số tương đồng di truyền của các mẫu nấm nghiên cứu............................. 102 Bảng 3.30 Sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai trong môi trường dịch thể ................................................................................................. 105 Bảng 3.31 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm sò lai và giống nấm chân dài cấp 1 ....................................................................... 107 Bảng 3.32 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai .......................................................................................... 108 viii Bảng 3.33 Sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai trong môi trường dịch thể cấp trung gian ......................................................................... 110 Bảng 3.34 Ảnh hưởng của cường độ sục khí đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi giống sò lai và chân dài cấp trung gian ...................................................................... 113 Bảng 3.35 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng, phát triển của giống nấm sò lai và chân dài cấp trung gian .............................................................. 115 Bảng 3.36. Ảnh hưởng của thời gian nuôi sợi tới sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai trong môi trường dịch thể cấp trung gian ................ 117 Bảng 3.37 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn, phương pháp ủ đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm chân dài (Bi); nấm sò lai lai P7 ................... 119 Bảng 3.38 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn, phương pháp ủ nguyên liệu đến tỷ lệ nhiễm mốc bề mặt bịch nấm chân dài, nấm sò lai trong giai đoạn nuôi sợi ............................................................................................................. 122 Bảng 3.39 Ảnh hưởng của phương pháp ủ nguyên liệu, thành phần cơ chất phối trộn đến năng suất nấm chân dài, nấm sò lai ........................................................... 123 Bảng 3.340 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng bịch nguyên liệu tới sự sinh trưởng, phát triển, tỷ lệ nhiễm nấm mốc bề mặt bịch và năng suất thu hoạch.................. 127 Bảng 3.41 Ảnh hưởng của nguồn giống, thành phần môi trường đến sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm sò lai và nấm chân dài ............................................. 129 Bảng 3.42. Ảnh hưởng của nguồn giống, thành phần môi trường đến phát triển quả thể và năng suất thu hoạch nấm sò lai và nấm chân dài .................................. 131 Bảng 3.43 Ảnh hưởng của tuổi giống dịch thể đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của nấm sò lai và nấm chân dài ............................................................... 132 Bảng 3.44. Ảnh hưởng của lượng giống dịch thể đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của nấm sò lai và nấm chân dài ............................................................... 133 ix DANH MỤC HÌNH Hinh 1.1 Một số loài nấm sò điển hình thuộc chi: Pleurotus ......................................... 18 Hinh1.2 Nấm chân dài (Clitocybe maxima)....................................................................... 19 Hinh1.3 Clitocybe clavipes ................................................................................................ 19 Hinh1.4 Clitocybe maxima ................................................................................................ 19 Hinh1.5 Clitocybe bba ....................................................................................................... 19 Hinh1.6 Clitocybe subconnexa .......................................................................................... 19 Hinh1.7 Clitocybe gigantea ........................................................................................... 20 Hinh1.8 Clitocybe nuda ................................................................................................... 20 Hình 1.9 Chu trình sống của nấm sò (bên trái) và nấm chân dài (bên phải) Hinh1.11: A- sợi nấm bao quanh sợi nấm khác B- sợi nấm hình thành ranh giới Csợi nấm hình thành vách ngăn cách (Mohammadi Goltapeh E. và Cộng sự, 2007) ............................................................................................................ 27 Hinh 3.1 chủng nấm sò Quốc gia ( Pl1) ................................................................................. 59 Hinh 3.2 chủng nấm sò P11 ................................................................................................ 59 Hinh 3.3 chủng nấm sò (P12).............................................................................................. 60 Hinh 3.4 chủng nấm sò( Sdl) ............................................................................................. 60 Hinh 3.5 chủng nấm sò CP ................................................................................................ 60 Hinh 3.6 Các bào tử chủng nấm thương phẩm Pl1 (bên trái); nhập nội CP (bên phải) nảy mầm trong môi trường PGA. ............................................................. 62 Hinh 3.7 Sợi đơn nhân chủng Pl1 sau khi tách và nuôi cấy trên môi trường PGA có tốc độ mọc và mật độ hệ sợi khác nhau. ....................................................... 62 Hinh 3.8 Sợi đơn nhân chủng CP sau khi tách và nuôi cấy trên môi trường PGA có tốc độ mọc và mật độ hệ sợi khác nhau. ....................................................... 62 Hinh 3.9 Các kiểu hình thái nơi bắt cặp của các dòng đơn nhân ....................................... 63 Hinh 3.10 Sợi nấm song nhân trên kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 1.500 lần (bên trái) và 15.000 lần (bên phải). .............................................................. 64 Hình 3.11: 07 con lai được lựa chọn để nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo ................. 64 Hinh 3.12 Con lai A11 x B12 ............................................................................................ 65 Hình 3.13 Khả năng sinh trưởng, phát triển của các con lai khác nhau trong môi trường cấp 1 ........................................................................................................ 66 x Hình 3.14 Khả năng sinh trưởng, phát triển của các con lai khác nhau trong môi trường cấp 2 ........................................................................................................ 66 Hình 3.15 Hình thái quả thể, bào tử nảy mầm của chủng sò lai P7(bên trái) và đối chứng Pl1(bên phải) ........................................................................................... 68 Hình 3.16 Hình thái chủng nấm sò bố mẹ và con lai ......................................................... 69 Hình 3.17 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi các chủng nấm sò trên giá thể nuôi trồng ...................... 71 Hình 3.18 chủng (Bi).......................................................................................................... 76 Hình 3.19 chủng (Bi0)........................................................................................................ 76 Hình 3.20 chủng (Bi1)........................................................................................................ 76 Hình 3.21 chủng (Bi2)........................................................................................................ 76 Hinh 3.22 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sinh trưởng của sợi nấm chân dài ...................................................................................................................... 78 Hinh 3.23 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton trong môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi nấm chân dài ..................................................................................... 79 Hình 3.24 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối sợi nấm chân dài ...................... 81 Hinh 3.25 Sợi nấm chân dài nuôi ở nhiệt độ 20- 220C ...................................................... 83 Hinh 3.26 Sợi nấm chân dài nuôi ở nhiệt độ 24- 260C ...................................................... 83 Hinh 3.27 Sợi nấm chân dài nuôi ở nhiệt độ 28- 300 C ..................................................... 83 Hình 3.28 Điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số (M: DNA 25nM) ......................... 84 Hình 3.29 – bảng3.19: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi OPA2; (M: Marker 1Kb) ............................................................................ 85 Hình 3.30 – bảng 3.20: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi OPA18; (M: Marker 1Kb) .................................................................... 86 Hình 3.31 – bảng 3.21: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi OPN5; (M: Marker 1Kb) ...................................................................... 87 Hình 3.32– bảng 3.22: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi S208; (M: Marker 1Kb) .............................................................................. 88 Hình 3.33 – bảng 3.23: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi S216; (M: Marker 1Kb). ............................................................................. 89 Hình 3.34 – bảng 3.24: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi S285; (M: Marker 1Kb) .............................................................................. 90 xi Hình 3.35 – bảng3.25: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 10 mẫu nấm với mồi S300; (M: Marker 1Kb)..................................................................................... 91 Hình 3.36 Sơ đồ về mối quan hệ di truyền của 10 mẫu nấm nghiên cứu ............................ 95 Hình 3.37 Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số(M: DNA 25nM) ..................... 96 Hình 3.38: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR và bảng thống kê của 4 mẫu nấm với đoạn mồi OPA18; (M: Marker 1Kb)........................................................ 96 Hình 3.39: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi OPO15; (M: Marker 1Kb) ........................................................................................ 97 Hình 3.40: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi OPO18; (M: Marker 1Kb) ........................................................................................ 97 Hình 3.41: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi S279; (M: Marker 1Kb) ..................................................................................... 98 Hình 3.42: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi S239; (M: Marker 1Kb) ..................................................................................... 98 Hình 3.43: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi S300; (M: Marker 1Kb) ..................................................................................... 99 Hình 3.44: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 4 mẫu nấm với đoạn mồi S285; (M: Marker 1Kb) ..................................................................................... 99 Hình 3.45 Sơ đồ về mối quan hệ di truyền của 4 mẫu nấm nghiên cứu .......................... 102 Hình 3.46 Hệ sợi nấm sò lai (bên trái), nấm chân dài (bên phải) nuôi theo phương pháp cũ (môi trường Agar) .............................................................................. 104 Hình 3.47 KLC nấm sò lai (bên trái), nấm chân dài (bên phải) cấp 1 trên các công thức môi trường khác nhau .............................................................................. 106 Hình 3.48 Hệ sợi nấm sò lai (bên trái), nấm chân dài (bên phải) trong môi trường dịch thể, ở các khoảng thời gian nuôi khác nhau. ........................................... 109 Hình 3.49 Kiểm tra sự mọc của KLC nấm chân dài ở các khoảng thời gian nuôi khác nhau trên môi trường thạch ..................................................................... 109 Hình 3.50 Hệ sợi nấm sò lai (bên trái), nấm chân dài (bên phải) nuôi trên các công thức môi trường khác nhau trong bình 5 lít có sục khí ........................... 111 Hình 3.51 Hệ sợi nấm sò lai (bên trái), nấm chân dài (bên phải) cấp trung gian nuôi ở các chế độ cấp khí khác nhau ............................................................... 114 xii Hình 3.52 Công thức (CT2) với 2 phương pháp ủ (PTN) và (PĐ/C) trong giai đoạn nuôi sợi nấm sò ................................................................................................ 121 Hình 3.53 Công thức CT3 với 2 phương pháp ủ (PTN) và (PĐ/C) trong giai đoạn nuôi sợi chủng Bi ............................................................................................ 121 Hình 3.54 Công thức CT2 với phương pháp ủ dài (PTN) trong giai đoạn ra quả thể nấm sò lai P7 .................................................................................................... 126 Hình 3.55 Công thức CT2 với phương pháp ủ nhanh (PĐ/C) trong giai đoạn ra quả thể nấm sò lai P7 .............................................................................................. 126 Hình 3.56 Công thức CT3 với phương pháp ủ dài (PTN) trong giai đoạn ra quả thể chủng Bi ........................................................................................................... 126 Hình 3.57 Công thức CT3 với phương pháp ủ ngắn (PĐ/C) trong giai đoạn ra quả thể chủng Bi .............................................................................................. 126 Hình 3.58 Sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................................. 134 Hình 3.59 Sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................................. 135 Hình 3.60 Sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................................. 136 Hình 3.61 Sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................................. 138 xiii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Nấm lớn (Marco Fungi) có ý nghĩa quan trọng trong đời sống, kinh tế xã hội và trong nghiên cứu khoa học. Nhiều loài được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, loãng xương… Trên thế giới đã xác định được ít nhất 14.000 loài (Trịnh Tam Kiệt, 2013), trong số đó có khoảng 2000 loài nấm có thể ăn và dùng làm thuốc. Ngoài nguồn thu hái từ tự nhiên, người ta đã trồng được hơn 80 loại theo phương pháp nhân tạo (công nghiệp, bán công nghiệp) cho năng suất cao. Nấm sò (Pleurotus spp.) được công nhận là một chi quan trọng về mặt kinh tế trong các loài nấm lớn trên toàn thế giới, do nó có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện sinh thái khác nhau và thích hợp với nhiều điều kiện dinh dưỡng (Hassan et al., 2010). Tại Mỹ, trồng nấm sò bắt đầu từ đầu năm 1980 (Rodriguez & Royse, 2008). Nấm sò là loại nấm đứng thứ ba thế giới về sản lượng sau nấm Mỡ (Agaricus bisporus) và nấm Hương (Lentinula edodes). Ở Việt Nam nấm sò là một trong năm loại nấm được phát triển hàng hóa lớn với sản lượng trên 60.000 tấn/năm ( Báo cáo của Cục trồng trọt tại Hội nghị phát triển nấm các tỉnh phía Bắc, Đồ Sơn - Hải Phòng 22/9/2011) Nấm chân dài (Clitocybe maxima) có chứa nhiều axit amin và nguyên tố khoáng có lợi cho sức khỏe con người như: Molipdenum, Cobalt, kẽm, và nguyên tố khác. Trong thành phần isoleucine và leucine nằm ở phần mũ nấm và thành phần protein cũng giống như loài (Lentinula edodes) hay (Flammulina velutipes). Đây là loại nấm ăn rất có triển vọng phát triển. Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do có nguồn phế phụ phẩm từ nông, lâm nghiệp (rơm, rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô…) đạt mức trên 40 triệu tấn/năm, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm. Bên cạnh đó, điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm…) của nước ta rất phù hợp với việc trồng nhiều loài nấm. Hiện nay việc nuôi trồng nấm đang được đẩy mạnh ở các địa phương trong cả nước và là nguồn thu nhập đáng kể trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp, nông thôn. Nhận định trên đã được đánh giá cụ thể tại báo cáo (thực trạng và giải pháp phát triển nấm tại các tỉnh phía Bắc - Hội nghị phát triển nấm các tỉnh phía Bắc, Đồ Sơn - Hải Phòng 22/9/2011). Đặc biệt Thủ tướng Chính phủ ra Quyết định số 439/QĐ-TTg ngày 1 16/4/2012 phê duyệt Danh mục sản phẩm quốc gia thực hiện từ năm 2012 thuộc Chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 trong đó sản phẩm nấm ăn và nấm dược liệu là một trong chín sản phẩm được ưu tiên phát triển. Thực tế sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu ở Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn về công nghệ và lựa chọn chủng nấm ăn thích hợp đặc biệt chúng ta chưa chú trọng vào hướng chọn tạo giống nấm mới. Kết quả Đề tài: “Nghiên cứu chọn tạo, hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò (Pleurotus sp.) và nấm chân dài (Clitocybe sp.)” góp phần làm đa dạng chủng loại nấm nuôi trồng, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng và thúc đẩy hơn nữa nghề trồng nấm ở nước ta phát triển. 2. Mục tiêu của đề tài Lai tạo và tuyển chọn được các chủng nấm sò, nấm chân dài sinh trưởng và phát triển tốt, có năng suất và chất lượng cao đồng thời xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng thích hợp nhằm phát triển các chủng nấm mới có triển vọng trong sản xuất. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Thu thập, lai tạo và tuyển chọn chủng nấm sò mới. 3.2. Thu thập, tuyển chọn chủng nấm chân dài nhập nội. 3.3. Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội và nấm chân dài bằng chỉ thị RAPD - PCR 3.4. Nghiên cứu quy trình công nghệ nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm sò lai và nấm chân dài có triển vọng trong nghiên cứu 3.5. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng chủng nấm sò lai, nấm chân dài có triển vọng. 4. Phạm vi nghiên cứu của đề tài. 4.1. Nấm sò - Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm sò thương phẩm hiện có ở trong nước và nhập nội. - Lai tạo các chủng nấm sò thương phẩm nhập nội đang được nuôi trồng ở Việt Nam. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng nấm sò lai. 2 - Đánh giá, tuyển chọn một số chủng nấm sò có triển vọng thông qua nuôi trồng thực nghiệm. - Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội bằng chỉ thị RAPD – PCR - Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) chủng nấm sò lai có triển vọng. - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm sò lai có triển vọng trên cơ chất tổng hợp. 4.2. Nấm chân dài - Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm chân dài nhập nội - Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm chân dài nhập nội. - Đánh giá sự khác biệt di truyền và nhận diện các chủng nấm chân dài bằng chỉ thị RAPD – PCR - Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm chân dài có triển vọng. - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm chân dài có triển vọng. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học về các chỉ tiêu sinh trưởng cơ bản cho giống nấm mới được chọn tạo cũng như nhu cầu về dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh tối ưu cho sinh trưởng, phát triển của nấm sò lai và nấm chân dài làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ nhân giống, nuôi trồng trên môi trường nuôi cấy dịch thể và giá thể xốp. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt về mặt di truyền của các chủng nấm nhập nội, thu thập trong nước và lai tạo đang lưu giữ và mối tương quan với các đặc điểm hình thái, sinh học trong nuôi cấy, làm cơ sở cho nghiên cứu chọn tạo giống. Kết quả nghiên cứu cũng là tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác nghiên cứu ứng dụng và phát triển sản xuất nấm ở Việt Nam. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 Kết quả nghiên cứu của đề tài đã giới thiệu cho sản xuất 01 chủng nấm sò lai và 01 chủng nấm chân dài cho năng suất, chất lượng cao và ổn định, thích hợp với điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam. Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng thích hợp cho từng chủng giống nấm. Quy trình kỹ thuật này có tính khả thi cao, ứng dụng trong sản xuất nấm ở qui mô công nghiệp. Góp phần làm đa dạng chủng loại nấm nuôi trồng, thúc đẩy phát triển nghề trồng nấm ở nước ta. 5.3. Tính mới của luận án Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ thu thập nguồn gen, lai tạo, tuyển chọn đến xác định các chỉ tiêu cơ bản cho một giống nấm đạt năng suất, chất lượng cao. Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng nấm sò lai, nấm chân dài được tuyển chọn trên môi trường dịch thể và cơ chất nuôi trồng tổng hợp nhằm rút ngắn thời gian nuôi cấy, tăng năng suất nấm, nâng cao hiệu quả kinh tế cho sản xuất. Bước đầu đưa hướng nghiên cứu chọn tạo giống nấm bằng phương pháp lai sợi đơn nhân tại Việt Nam. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm lớn và giá trị dinh dƣỡng của nấm lớn 1.1.1. Giá trị dinh dưỡng của nấm ăn Giá trị dinh dưỡng của một số loài nấm ăn quý đã và đang được nuôi trồng hiện nay nhìn chung nấm tươi chứa khoảng 90% nước, còn nấm khô chứa 10 – 12%. Hàm lượng protein chứa trong nấm thay đổi tùy theo loài nấm, thấp nhất ở các loài mộc nhĩ (4 – 9%) và cao nhất ở nấm mỡ lên tới 44%( tính theo trọng lượng khô). Lượng protein chứa trong nấm còn thay đổi phụ thuộc vào từng chủng nấm của ngay trong một loài, ví dụ như Agaricus bisporus là từ 24 44%. Nấm có chứa hầu hết các axít amin. Trong tổng lượng axit amin, thì 25 40% được bao gồm từ các axit amin không thay thế; 25 - 35% là các axit amin tự do. Lượng chất béo chứa trong nấm thấp nhất chỉ dưới 1% cho tới cao nhất chiếm 15 – 20% trọng lượng khô. Tính riêng ở nấm mỡ, biến động từ 2 - 8%. Nấm tươi chứa một lượng khá cao các chất hydrat cacbon (3 - 28%) và chất xơ (3 - 32%), trong đó có đường pentose (xylose, ribose), methylpentose (rhamnose, fucose), hexose (glucose, galactose và manose), disacrose (saccharose. Giá trị đặc biệt nữa đáng chú ý trong thành phần dinh dưỡng của nấm là giàu vitamin và muối khoáng. Ngoại trừ vitamin A rất hiếm thấy ở nấm, hay dưới dạng pro-vitamin A, còn lại xuất hiện các vitamin (B, B1, B2, B6, B12, D, D2, H, PP, C…) với hàm lượng khá cao, đặc biệt một số vắng mặt hoàn toàn trong các loại rau. Ngoài ra trong nấm rất giàu muối khoáng, trong đó đáng chú ý nhất là hai nguyên tố K và P luôn luôn hiện diện với một lượng khá lớn. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng cụ thể của một số một số loài nấm ăn (Gaur. T et al., 2016) đã tiến hành nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng và kháng dinh dưỡng của một số loài nấm ăn, trong đó có 2 chủng nấm Macrocybe gigantea (MA1 và MA2), nấm mỡ Agaricus bisporus, nấm milky Calocybe indica, nấm hương Lentinula edodes và nấm phễu Lentinus sajor-caju, các thành phần nghiên cứu bao gồm hàm lượng nước, đường tổng số, đường khử, hàm lượng protein, các enzyme ngoại bào (amylase, lipase và protease), chất khoáng, tanin và axit phytic; các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng tất cả các loài đều chứa một số lượng đáng kể của tất cả các thành phần dinh dưỡng và chứa một lượng nhỏ các thành phần kháng dinh dưỡng; hàm lượng carbohydrate tổng số đạt từ 38,66 - 47,73 5 mg/g, đường khử đạt từ 9,02-17,77 mg/g, hàm lượng tro tổng số đạt từ 6,50 - 9,66 mg/g; hàm lượng protein đạt thấp nhất ở L. sajor-caju (6,43 g/100g trọng lượng khô), cao nhất ở nấm hương L. edodes (26,2 g/100g trọng lượng khô) (bảng 1.1) Bảng 1.1 Phân tích dinh dƣỡng của các loài nấm ăn khác nhau Hàm lượng nước (%) Đường tổng số (mg/g) Đường khử (mg/g) Hàm lượng tro (mg/g) Protein (g/100g trọng lượng khô) Agaricus bisporus 90.9±0.39c 47.7±0.46f 16.0±0.34c 9.66±0.05d 14.0±1.30b Calocybe indica 89.4±0.32d 42.6±0.20d 7.08±0.56a 6.50±0.10b 16.8±0.08c Lentinula edodes 85.7±0.60b 40.8±0.60c 9.02±0.60b 5.73±0.11a 26.2±1.70d Lentinus sajor-caju 88.7±0.02c 39.5±0.70b 15.5±0.64c 6.43±0.32b 6.43±0.60a Macrocybe gigantea 82.6±0.05a 38.6±0.30a 8.41±0.79b 6.23±0.05b 16.4±0.36c Macrocybe gigantea 89.2±0.04cd 43.5±0.23c 17.7±0.41d 7.36±0.05 15.3±1.38bc Loài nấm (Gaur. T et al., 2016) Đối với hàm lượng chất khoáng, photpho có trong tất cả các loài nghiên cứu và cao nhất ở chủng M. gigantea MA2 (944,5 mg/100g), các nguyên tố đa lượng và vi lượng khác nhau ở các loài, các yếu tố độc như As, Hg hay Pb đều không tìm thấy trong tất cả các loài nghiên cứu (bảng 1.2). Bảng 1.2 Hàm lượng chất khoáng (mg/100g) trong một số loài nấm ăn khác nhau Chất khoáng P Cu Zn Cr Fe Ca Mn Mg Co As Pb Hg Agaricus bisporus 345.8±0.15a 15.9±0.15d 28.2±0.32f 1.2±0.01c 46.1±0.10f 39.5±0.40e 3.7±0.15d 28.2±0.40e 0.03±0.28a - Calocybe indica 56.36±0.32d 1.3±0.01a 9.6±0.1b 0.1±0.005a 19.2±0.32b 21.8±0.1a l.l±0.01a 6.4±0.05a 0.03±0.02a - Lentinula edodes 465.4±0.51c 1.41±0.005a 7.70±0.2a 0.14±0.01a 19.7±0.11d 68.8±0.05f 3.06±0.05c 45.6±0.35f 0.04±0.01a - 6 Lentinus sajor-caju 412.0±0.45b 9.52±0.35c 18.1±0.15e 2.13±0.05d 27.0±0.02e 24.0±0.02b 3.16±0.11c 19.5±0.11d 0.004±0.001a - Macrocybe Macrocybe gigantea gigantea e 601.5±0.30 944.5±0.10f 2.08±0.07b 2.24±0.13b 13.3± 0.20c 14.5±0.41d 0.24±0.04b 0.24±0.02b 17.6±0.43b 14.5±0.26a 26.4±0.10c 27.2±0.09d 2.23±0.15b 2.33±0.15b 10.7±0.26b 15.73±0.28c 0.39±0.08c 0.26±0.07b (Gaur. T et al., 2016)