Tài liệu Nghiên cứu chiết tách acid momordic và momordin trong hạt gấc thu nhận tại đà nẵng

1 Nghiên cứu chiết tách Acid Momordic và Momordin trong hạt gấc thu nhận tại Đà Nẵng MỞ ĐẦU Gấc là thứ quả có nhiều ở Việt Nam. Nó thường được dùng để nấu xôi - một món ăn truyền thống, ăn có vị rất ngon và chứa nhiều chất bổ dưỡng. Xôi gấc có màu đỏ tươi, thơm, ngọt dịu, dẻo, béo... rất ngon, mọi người thường dùng trong những dịp đặc biệt như cúng tổ tiên, hay lễ tết, hội hè. Tuy nhiên, khi ăn xôi, ta thường bỏ đi hai vị thuốc quý đó là màng bọc hạt gấc và nhân hạt gấc. Màng bọc hạt gấc có chứa một vị thuốc quý là carotene (tiền sinh tố A), có tác dụng điều trị quáng gà, làm sáng mắt, giúp trẻ con mau lớn, người già thêm cứng cáp, giúp các vết thương mau liền sẹo... Còn nhân hạt gấc là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn thương, làm vết thương mau lành. Theo bác sĩ Trần Danh Tài - Chủ tịch Hội Đông y tỉnh Lâm Đồng thì: "Tác dụng của tinh dầu hạt gấc chẳng kém gì các loại mật gấu (như gấu rừng, gấu nuôi, gấu chó, gấu mèo), nên chúng tôi hay gọi vui đây là mật gấu treo". Từ lâu, nhân dân ta đã biết cách chế dầu từ nhân hạt gấc theo phương pháp thủ công làm thuốc dùng trong gia đình, dùng được cho tất cả vết thương bị bầm dập, tụ máu, bị mụn nhọt, quai bị, viêm tuyến vú... , ngoài ra còn có tác dụng chữa trĩ, chữa chai bàn chân. Nhân hạt gấc chứa rất nhiều chất như axit béo, đường, tannin, protein, 1 số enzim…song không thể không nhắc đến 2 hợp chất có tên acid momordic và momordin, chúng là 1 trong những dưỡng chất chính tạo nên tính năng chữa bệnh đặc biệt của nhân hạt gấc. Acid momordic có mặt trong thành phần của nhiều loại thuốc bán trên thị trường, đặc biệt là các thuốc dùng để chữa trị các khối u, các nốt sưng tấy. Không những thế, các thuốc chữa bệnh tiểu đường như GLUCO-FX cũng chứa acid momordic trong thành phần của nó, acid momordic góp phần làm giảm lượng 2 đường trong máu. Momordin cũng không phải xa lạ, momordin cùng với charantin và một số dưỡng chất khác có trong thành phần của trái khổ qua đã tô điểm nên những công dụng đặc biệt của loại quả này đối với cơ thể con người, tiêu biểu nhất đó là vị thuốc chữa bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin (đái tháo đường loại 2). Ngoài ra, nó còn có những tính chất khác như chữa trĩ, mụn nhọt, lở loét, thấp khớp và hạ huyết áp. GLUCO-FX Glucose Balance Formula Product # AE-041 90 caps Ingredients per Capsule R-Alpha Lipoic Acid Chromium Poylnicotinate (50 mcg elemental) Vanadyl Sulphate (5mcg elemental) Banaba Leaf (1% Corosolic Acid) Momordica Charantia (3% Momordic acid) Gymnema Sylvestre (25% Gymnemic acid) 100mg 357mcg 16mcg 200mg 200mg 100mg Như vậy, hạt gấc chứa cả hai dưỡng chất có ích cho cơ thể là acid momordic và momordin. Song, nhân hạt gâc chủ yếu chỉ được dùng làm thuốc bôi ngoài da, ít dùng đường uống vì có độc tính. Độc tính được xác định LD50 = 92,27g bột hạt gấc/kg chuột thử nghiệm khuyên ta nên hết sức thận trọng. Qua đó, ta thấy được rằng, hạt gấc là vị thuốc quý của mọi nhà, song trên thực tế việc sử dụng vị thuốc này vẫn còn hạn chế và chưa phát huy hết tính năng đặc biệt của nó. Hạt gấc có tính độc nên chủ yếu chỉ được dùng để bôi ngoài da nhưng những dưỡng chất chứa trong thành phần của nhân hạt gấc lại có tác dụng rất lớn trong việc chữa trị một số bệnh bên trong cơ thể. Một ý tưởng nảy sinh đó là: Tại sao chúng ta không chiết tách những dưỡng chất có trong hạt gấc để mở rộng hơn phạm vi ứng dụng của nó? 3 Cho đến nay ở nước ta, việc nghiên cứu chiết tách các dưỡng chất trong nhân hạt gấc chưa được các nhà khoa học quan tâm. Với ý tưởng cùng với lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách Acid Momordic và Momordin trong hạt gấc thu nhận tại Đà Nẵng” làm đề tài tốt nghiệp cuối khoá cho mình. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về hợp chất Terpenoid [1], [2], [3], [4] 1.1.1. Thành phần cơ bản và tính chất chung của các loại hợp chất tecpen Tecpen là một loại hợp chất hữu cơ có nhiều trong tinh dầu của các loại cây và hoa, chúng thuộc vào số các hợp chất phổ biến nhất. Chúng có tính đa dạng về mặt cấu trúc, song các tecpen đều có nét chung thống nhất đó là phân tử tecpen được xem như sản phầm trùng hợp của izopren theo kiểu “đầu nối với đuôi”, tuy rằng izopren không phải là nguyên liệu cấu trúc ra các tecpen. đuôi đầu Isopren (C5H8) Ocimen (C10H16) Dựa vào số đơn vị isopren để chia các tecpen thành: Monotecpen (C10) số đơn vị isopren là 2 Sesquitecpen (C15) 3 Ditecpen (C20) 4 Tritecpen (C30) 6 Tetratecpen (C40) 8 4 Tecpen chỉ có một đơn vị C5 rất hiếm, chỉ gặp trong dạng hợp chất trung gian dưới dạng isopren sinh học. Mặt khác cũng không có các loại tecpen có C 25, C35 cũng do các quá trình sinh tổng hợp sinh học mà ở đây tôi không đề cập dến. Các tritecpen và tetra tecpen hình thành không phải do quá trình ankyl hoá tiếp đitecpen mà chủ yếu bằng con đường đime hoá sesquitecpen và đitecpen. Hầu hết hợp chất tecpen có cấu trúc vòng với một số nhóm chức như OH, cacbonyl. Đặc tính chung của chúng là ít tan trong nước ngoại trừ chúng kết hợp với các oza tạo thành glycozit tan trong chất béo. Về mặt hoá học, hiện tượng đồng phân trong tecpen rất phổ biến, nên có thể gặp cả 2 dạng đồng phân trong cùng một cây. Ngoài ra vì hầu hết chúng là cấu trúc vòng và vì vòng xicloankan thường là dạng ghế nên có cấu hình khác nhau tuỳ thuộc vào các nhóm thế ở quanh vòng. Cần chú ý rằng, hiện tượng đồng phân hoá và sự sắp xếplại cấu trúc trong phân tử của chúng có thể xảy ra ngay trong quá trình chiết xuất để cho ra những hợp chất “giả” vốn không có trong cây. Về mặt phân bố trong tự nhiên, tecpen có mặt trong hầu hết các lớp từ thực vật bậc thấp như tảo, nấm đến thực vật bậc cao và cả trong động vật, vi khuẩn. Nhưng mỗi nhóm tecpen có sự phân bố đặc trưng. Monotecpen là thành phần chủ yếu của tinh dầu đã tìm thấy trong hơn 60 họ thực vật, nhưng tập trung chủ yếu trong khoảng 10 họ. Sesquitecpen phân bố đặc trưng trong họ Asteraceae, các Saponin Steroid trong cây một lá mầm, trong khi saponin tecpen có chủ yếu trong cây 2 lá mầm. Glycozit tim tập trung một số chi thuộc các họ ApocynaceaeScrophulariaceae, Aselepidaceae,Moraceae… Ngoài khái niệm tecpen người ta còn dùng khái niệm terpenoid để bao hàm rộng rãi các sản phẩm thoái biến tự nhiên và các dẫn xuất tự nhiên hay tổng hợp các tecpen. Tuy nhiên khi sử dụng thì hầu như không có sự phân biệt rõ ràng về ranh giới giữa hai khái niệm này. 5 Tuy nhiên đã có khá nhiều ngoại lệ của quy luật nêu trên. Để giải thích điều này người ta dựa vào “quy tắc isopren phát sinh sinh vật” (“biogenetic isopren rule”; Ruzicka, 1953), theo quy tắc này thì các terpenoid được lắp ráp bởi các đơn vị C5 (tương tự isopren), sau đó cấu trúc được tạo thành ban đầu có thể bị biến đổi bởi emzim theo nhiều cách khác nhau để sinh ra các kiểu cấu trúc được biết. Để giải thích quá trình sinh tổng hợp các terpenoid, các nhà khoa học đã nổ lực tìm kiếm chất được gọi là “isopren hoạt động”, tức đơn vị C 5 có thể hợp nhất thành các isoprenoid. Lời giải đáp đã được tìm thấy vào năm 1956, khi axit mevalonic (MVA) được phân lập bởi Folkers và đã chứng tỏ được là có thể dễ dàng hợp nhất để tạo ra các isoprenoid. Tiếp đó là kết quả nghiên cứu của Bloch; Lynen; Conforth và Popjack, làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp axit mevalonic và cơ chế chuyển hợp chất này thành các đơn vị C5 sinh học, rồi từ đó tổng hợp thành các isoprenoid. Việc giải thích rõ qua trình sinh tổng hợp các isoprenoid có thể được coi là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của những năm sau đại chiến thứ II. 1.1.2. Một số ứng dụng của hợp chất terpenoid Các terpenoid có rất nhiều ứng dụng trong thực tế như làm chất thơm và chất tạo hương vị, làm dược phẩm, làm chất liệu trừ sâu hại… Trong vô số terpenoid có ứng dụng và hoạt tính sinh học đáng lưu ý, có thể nêu ra một số ví dụ như p-menth1-en-8-thiol có trong nước ép vỏ quả bưởi chùm đã tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm này. Với nồng độ thấp 1mg trong 1000 tấn nước ta vẫn có thể cảm nhận được hương vị của nó. Các sesquiterpen andehit - và - sinensal chiếm khoảng 0,1% tinh dầu nhận được nhờ ép vỏ loài cam ngọt Citrus aurantium L.Var.dulcis, subsp.Snensis Gall. Chúng là những chất tạo hương vị vỏ cam rất có giá trị, - damascon xuất hiện với hàm lượng thấp trong tinh dầu hoa hồng, nhưng lại là chìa khoá quyết định loại tinh dầu đắt tiền này. Cũng như các ionon, các xeton này được xếp vào phân lớp sesquiterpenoid, chúng là các sản phẩm thoái biến của các sesquiterpenoid nguyên thuỷ tương ứng. 6 Vô số terpenoid thể hiện hoạt tính sinh học khi thử trên động vật có vú và nhiều chất trong số đó đã dùng làm dược phẩm. Campho từ gỗ cây Cinnamonum camphora L. được sử dụng từ lâu làm thuốc sát trùng, để kích thích tim và sự tuần hoàn máu. Methol từ Mentha piperita L. có tác dụng gây tê nhẹ và trị ngứa. Terpen hiđrat điều chế từ tinh dầu thông, được dùng làm thuốc long đờm. Trong số các hoạt chất được dung làm thuốc có giá trị cao phải kể đến chất sesquiterpenoid artemisinin và chất điterpenoid taxol. Artermisinin được phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 từ cây Artemisia annua L. Với hoạt tính chống lại các dòng kí sinh trùng kháng được sự điều trị thông thường bằng chloroquine và nhờ có cấu trúc lipophil đi qua được vách ngăn máu – não, artemisinin đặc biệt có hiệu quả đối với bệnh sốt rét thể não làm chết người. Taxol được phân lập từ loài thông đỏ Taxus brevifolia, đã được phép dung làm thuốc điều trị ung thư buồng trứng từ năm 1992 và ung thư vú từ năm 1993. Nhiều terpenoid thể hiện những hoạt tính sinh học đáng chú ý khác như Peyssonol từ một loài tảo Peyssonnelia sp. ức chế HIV reve transeriptaza. Một số terpenoid có hoạt tính sinh học cao đối với thực vật hoặc đóng vai trò nhất định về mặt sinh thái học. Từ loài cây Acorus calamus L. đã phân lập được một dẫn xuất acoran mới có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt rau diếp. Các pyrethrin, thí dụ pyrethrin I, chứa trong các tuyến ở lá và hoa cây Chrysanthemum cinerariaefolium có tác dụng trừ sâu tiếp xúc mạnh, nhưng lại không độc đối với người và động vật máu nóng khác. Chất axit 2,3-đihiđrofanesolic là terpen duy nhất được phân lập từ cây cà chua dại Lycospersicum hisutum, chất này kháng lại các loài động vật chân đốt ăn cỏ. Nhiều terpenoid là các pheromon, ví dụ các monoterpenoid cis- và trans – verbenol là những chất có khả năng dẫn dụ con bọ cái ở loại bọ cách cứng đục vỏ cây Ips paraconfusus. Trong phân loại tecpen không thể không nhắc đến triterpenoid (C 30) có trong nhiều nấm thực vật, dầu ôliu, dầu gan cá mập (40%), trong đó squalen là tiền tố để tổng hợp ra steroid. 7 Đặc biệt, trong nhân hạt gấc và trái khổ qua đều có chứa một hợp chất triterpenoid có tên là Acid Momordic. Chính hợp chất acid momordic này đã góp phần tô điểm thêm vai trò to lớn của 2 loại quả cùng thuộc họ bí và được xem như vị thuốc quý của mọi nhà. H HO HO H - amyrin xyclolauderol Squalen O COOH OH Acid momordic 8 1.2. Glicozit và Saponin [14], [15] 1.2.1. Glicozit Nhóm chất hữu cơ có trong các vị thuốc được gọi là hoạt chất của thuốc. Thành phần hoá học chính gồm: đường (glucozơ, ramnozơ, đigitoxozơ, ximarozơ) và thành phần không phải đường (steroit, sterol, axit mật, hocmon... gọi là aglicon hay genin). Tuỳ theo cấu tạo và tác dụng aglicon mà có các Glicozit khác nhau. Glicozit gây đắng có tác dụng kích thích tiêu hoá thường gặp ở cây bồ công anh, long đờm thảo, thạch xương bồ, vỏ cam quýt. Glicozit trợ tim, làm tăng cường hoạt động của tim người bệnh, có trong lá trúc đào, hạt thông thiên, hạt đay, hạt cây sừng dê. Glicozit gây tăng nhu động ruột (làm co cơ trơn thành ruột) đó là antraglicozit khi dùng liều nhỏ làm ăn ngon, tiêu hoá dễ dàng, dùng với liều vừa phải thì nhuận tràng, liều cao gây tẩy mạnh. Những cây có antraglicozit là chút chít, muồng trâu, lô hội, thảo quyết minh... Glicozit gây màu là flavon và flavonozit gặp ở cây bồ hoàng, hoàng cầm, hoa hoè, vỏ cam và một vài cây khác. Glicozit gây bọt là những chất saponin. Saponin có tác dụng phá huyết mạnh, là chất độc cho cá. Các loài cây cỏ có Glicozit gây bọt là bồ kết, viễn chi, cát cánh, cam thảo. Glicozit gây chát là những chất tanin, gây táo bón, cầm máu và bổ, có ở các cây ngũ bội tử, búp ổi, lá chè, kim anh, lá sen, hạt vải. 1.2.2. Saponin Saponin là một glicozit tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng, và thực tế thường gặp từ "saponification" có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động 9 vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải sâm, cá sao. Các saponin đều là các chất hoạt quang. Thường các steroid saponin thì tả truyền còn triterpenoid saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axít loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucoza, Dgalactoza, L-arabinoza, axít galactunoic, axít D-glucuronic... Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsterod hoặc sapogenintritecpen dạng -amirin (axit olenoic), dạng α-amirin (axit asiatic), dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng. Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoid saponin, steroit saponin và glicoancaloid dạng steroid. Saponin có loại axít, trung tính hoặc kiềm. Trong đó, triterpenoid saponin thường là trung tính hoặc axít (phân tử có nhóm –COOH). Steroid saponin nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloid thuộc loại kiềm. Đã có hơn 10 saponin được phân lập từ rễ gấc, trong đó không thể không nhắc đến các chất momordin thuộc nhóm saponin triterpenoid. Momordin là một trong những dưỡng chất có lợi cho cơ thể, không chỉ có trong rễ gấc mà còn có trong thành phần của hạt gấc và trái khổ qua. 10 COOH COOH O OH O OH OH Momordin Ib COOH COOH OH O OH O O O OH OH OH Momordin I Cả hai saponin này đều có trong thành phần của rễ gấc, đều có hoạt tính kháng mạnh vi khuẩn E.coli, B.subtillis và S.aureus. Ngoài ra, trong vô số các dưỡng chất chứa trong thành phần của trái khổ qua, momordin và charantin là 2 trong số các thành phần chính có tác dụng hạ đường máu và những tác dụng khác có lợi cho việc điều trị bệnh đái tháo đường. Charantin là hỗn hợp của những glycosid steroid, bao gồm beta – sitosterol – beta – D – glucosid và 5,25 stigmadien – 3 – beta – ol – glycosid. 11 1.3. Cây gấc, quả gấc và một số ứng dụng của nó [5], [6], [7], [8], [9], [10] 1.3.1. Đặc điểm sinh thái của cây gấc Cây gấc có tên khoa học là Momordica Cochinchinensis (Lour) Spreng, chi Momordicae thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), bộ Violales. Phân bố ở châu Á: Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, bán đảo Mã Lai. Cây gấc trồng ở nước ta có nhiều giống, tuy nhiên trong sản xuất hiện nay chỉ phân biệt hai loại gấc sau đây: - Gấc nếp trái to có vỏ mỏng nhiều hạt, vỏ trái có màu xanh gai to, it gai, khi chín chuyển sang màu đỏ cam, bổ tái ra bên trong trái có màu đỏ tươi rất đậm. - Gấc tẻ (gấc sẽ) trái nhỏ hoặc trung bình vỏ dày tương đối có ít hạt, gai nhọn, trái bổ ra bên trong có màu vàng nhạt và màng đỏ bao bọc hạt thường có màu đỏ nhạt hoặc màu hồng không được đỏ tươi đậm như gấc nếp. Thời vụ trồng gấc tốt nhất ở miền Nam là đầu hoặc cuối mùa mưa, ở miền Bắc thời vụ thường vào đầu tháng hai dương lịch lúc trời có mưa xuân. 1.3.2. Ứng dụng Cây gấc có nhiều ứng dụng, cụ thể: 12 • Rễ gấc: còn gọi là phong kỷ nam sao vàng, tán mỏng, dùng uống chữa tê thấp sưng chân. • Lá gấc: Viện đông y dùng lá gấc với lá tầm gửi đắp ngoài da làm thuốc tiêu sưng tấy. • Màng gấc: dùng để đồ xôi, ăn cả xôi và màng gấc. • Dầu gấc: có tác dụng như những thuốc có vitamin A, dung bôi lên các vết thương, vết loét, vết bỏng làm cho chóng lành, lên da. Uống dầu gấc người bệnh chóng lên cân, tăng sức chống đỡ bệnh tật của cơ thể. • Hạt gấc: Đông y gọi là mộc miết tử (con ba ba gỗ) vì nó dẹt, hình gần như tròn, vỏ cứng, mép có răng cưa, hai mặt có những đường vân lõm xuống, trông tựa như con ba ba nhỏ. Hạt có vị đắng, hơi ngọt, tính ẩm, có độc dùng chữa các chứng bệnh ung thũng, mụn nhọt độc, tràng hạt, eczema, viêm da thần kinh, trĩ, phụ nữ sưng vú. Có thể chế thuốc viên hay tán bột uống. Liều uống từ 0,8 – 1,2 g. Nhưng thường dùng đắp ngoài da đồ mụn nhọt. Nhân dân ta còn dùng để đắp chữa chai bàn chân. Trong nhân dân, nhiều gia đình có thói quen để dành hạt gấc sống hoặc đã qua đồ xôi. Khi cần đến thì chặt đôi đem mài với ít rượu hoặc giấm thanh để bôi chỗ sưng tấy do mụn nhọt, sưng quai bị; bôi nhiều lần trong ngày, cứ khô lại bôi, rất mau khỏi. Có người giã nhân hạt gấc với một ít rượu, đắp lên chỗ vú sưng, đắp liên tục, ngày thay thuốc 1 lần, rất chóng khỏi. Để chữa trĩ, có thể dùng hạt gấc giã nát, thêm một ít giấm thanh, gói bằng vải, đắp vào hậu môn để suốt đêm. Mỗi đêm đắp thuốc một lần. Nó được dùng trong những trường hợp ngã, bị thương, sang độc, phụ nữ sưng vú, hậu môn sưng thũng. Hạt gấc có thể dùng uống (ngày 1 nhân nướng chín) nhưng chủ yếu là dùng bôi ngoài, không kể liều lượng. 1.4. Các phương pháp chiết tách hợp chất thiên nhiên [11], [12], [13], [4] 13 Các hợp chất thiên nhiên khi mới được tách thường ở đươi dạng không tinh khiết, vì vậy muốn nghiên cứu, phân tích chúng thì trước tiên phải tách chúng thành từng chất riêng biệt ở dạng tương đối tinh khiết. 1.4.1. Phương pháp hoà tan trong dung môi hữu cơ Phương pháp hoà tan trong dung môi hữu cơ được dùng để tách và tinh chế các chất hữu cơ rắn, dựa trên nguyên tắc là các chất khác nhau có độ hoà tan khác nhau trong cùng một dung môi. Dung môi thích hợp để lựa chọn thường là dung môi trong đó có độ hoà tan của chất rắn cần tinh chế thay đổi nhiều theo nhiệt độ. Bằng cách tạo dung dịch bão hoà ở nhiệt độ cao (thường là nhiệt độ sôi của dung môi), các tạp chất sẽ ở lại trong dung dịch. Bằng cách kết tinh lại một số lần trong cùng một dung môi, hoặc trong các dung môi khác nhau, người ta có thể thu được tinh thể chất cần tinh chế ở dạng khá tinh khiết. Cũng có khi người ta dùng một dung môi có độ hoà tan với tạp chất nhiều hơn để loại tạp chất ra khỏi chất rắn cần tinh chế. Dung môi thường là nước, ancol etylic, ancol metylic, axeton, axit axetic băng, ete, ben zen, cloroform, etyl axetat, n- hexan, ete dầu hoả… hoặc đôi khi là hỗn hợp giữa chúng. Khi cần tách hai hay nhiều chất chứa trong hỗn hợp với những lượng tương đương nhau, người ta dùng phương pháp kết tinh phân đoạn. 1.4.2. Các phương pháp chưng cất 1.4.2.1. Chưng cất đơn giản Trong trường hợp cần tinh chế một chất lỏng, tách nó ra khỏi tạp chất rắn không bay hơi hoặc bay hơi có điểm sôi cao hoặc thấp không đáng kể (khoảng 800C) so với chất phân tích, ta chỉ cần tiến hành chưng cất thường (chưng cất đơn giản), nghĩa là chuyển chúng sang pha hơi trong một bình cất có nhánh rồi ngưng tụ hơi của nó bằng ống sinh hàn vào một bình hứng khác. Thường được áp dụng để tinh chế các chất thô. Đối với những chất sôi cao nằm trong khoảng 150 0C < Đs < 14 3000C cần tiến hành cất dưới áp suất giảm để tránh phân huỷ nhiệt (thông thường khi áp suất hơi bên ngoài giảm một nửa thì nhiệt độ sôi giảm khoảng 150C). 1.4.2.2. Chưng cất phân đoạn Phương pháp chưng cất phân đoạn dùng để tách hai hay nhiều chất lỏng có nhiệt độ sôi gần nhau tan lẫn hoàn toàn trong nhau, dựa trên nguyên tắc có sự phân bố khác nhau về thành phần các cấu tử giữa pha lỏng và pha hơi ở trạng thái cân bằng (ở cùng nhiệt độ). Như vậy, bằng cách lặp đi lặp lại nhiều lần quá trình bay hơi- ngưng tụ; bay hơi- ngưng tụ lại…ta dần dần có thể thu được cấu tử A có nhiệt độ sôi thấp hơn ở dạng gần tinh khiết. Vì vậy người ta dùng phương pháp tinh luyện bằng cách lắp trên bình chưng cất một cột cao có nhiều đĩa (cột Vigrơ) giúp cho việc tái tạo quá trình bay hơi ngưng tụ trên. Nhờ vậy chất lỏng A dễ bay hơi dần dần thoát lên trên, ở trạng thái ngày càng tinh khiết, còn chất lỏng B có nhiệt độ sôi cao hơn, ngưng tụ trở lại bình chưng. Có thể người ta dùng loại cột lấp đầy các mảnh hoặc ống thuỷ tinh hay các mảnh sứ thay cho cột Vigrơ và hiệu quả của cột được tính bằng “ số đĩa lý thuyết”. 1.4.2.3. Chưng cất dưới áp suất thấp Khi cần chưng cất một chất lỏng dễ phân huỷ ở nhiệt độ cao, người ta phải dùng phương pháp chưng cất dưới áp suất thấp, tức là dùng bơm hút để giảm áp suất trên bề mặt chất lỏng. Vì chất lỏng sẽ sôi khi áp suất riêng phần đạt đến áp suất khí quyển, nên bằng cách này người ta có thể giảm được nhiệt độ sôi của nó một cách đáng kể, tránh được hiện tượng phân huỷ hay cháy nổ. Phương pháp cất đơn hay cất phân đoạn dưới áp suất giảm ngày nay được sử dụng khá phổ biến để đuổi nhanh những lượng dung môi lớn mà không gây mất mất mát và ảnh hưởng tới chất phân tích, nhất là khi phân tích lượng vết và chất kém bền nhiệt. Nhờ phương trình Claparon- Clausius, người ta có thể tính được sự phụ thuộc của áp suất hơi của một chất vào nhiệt độ. Tuy nhiên, có thể áp dụng quy luật thực nghiệm gần đúng như 15 sau: Khi áp suất khí quyển trên bề mặt chất lỏng giảm đi một nữa, thì nhiệt độ sôi của nó hạ thấp đi khoảng 150C. 1.4.2.4. Chưng cất lôi cuốn hơi nước Ta có thể tinh chế một chất lỏng không hoà tan trong nước bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước để hạ điểm sôi của nó. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: Khi hai hay nhiều chất lỏng không trộn lẫn với nhau nằm trong một hỗn hợp, áp suất chung của chúng bằng tổng áp suất riêng phần p 1 + p2, nghĩa là nó luôn luôn lớn hơn áp suất riêng phần của bất kì cấu tử nào. Do đó nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ thấp hơn nhiệt độ sôi của cấu tử có nhiệt độ sôi thấp nhất. Tỷ lệ hơi cất sang bình ngưng (về số mol) sẽ bằng tỷ lệ áp suất hơi riêng phần của chúng ở nhiệt độ sôi của hổn hợp. Nhờ vậy ta có thể tính toán được lượng nước cần thiết để lôi cuốn hết chất cần tinh chế. Sau khi đã dùng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, thường ta phải chiết tách các chất cần tinh chế ra khỏi nước bằng một dung môi thích hợp, rồi lại tiến hành chưng cất phân đoạn để tách dung môi. Cuối cùng chưng cất lấy tinh khiết bằng bình chưng cất có gắn nhiệt kế dưới áp suất thấp, với sự kiểm tra nhiệt độ của chất cần tinh chế. 1.4.3. Phương pháp chiết 1.4.3.1. Giới thiệu chung Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hoà tan chất đang cần tách và tinh chế để tách chất đó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác. Thường người ta dùng một dung môi sôi thấp và ít tan trong nước (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thường ít tan trong nước), chất đó sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phểu để tách riêng dung dịch thu được ra khỏi nước. Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp. 16 Người ta cũng thường chiết một chất từ hổn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết Soxhlet. Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hổn hợp cần chiết tách (thường gói trong giấy lọc), nó sẽ hoà tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục được cất lên. Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quả tương đối cao. 1.4.3.2. Kỹ thuật chiết Soxhlet • Nguyên tắc Chiết Soxhlet là một kiểu chiết liên tục đặc biệt thực hiện nhờ một trang bị riêng của nó. Kiểu chiết này cũng như kiểu chiết lỏng- lỏng nên về bản chất của sự chiết vẫn là định luật phân bố chất trong hai pha không trộn vào nhau. Song ở đây pha mẫu là ở trạng thái lỏng, bột, hoặc dạng mảnh hoặc dạng lá. Còn dung môi chiết (chất hữu cơ) là dạng lỏng. Ví dụ chiết lấy dầu melton từ lá cây bạc hà bằng dung môi hữu cơ nhexan hay benzen. Chiết các thuốc trừ sâu hoặc bảo vệ thực vật trong mẫu rau quả, mẫu đất bằng n- hexan. Vì thế đây là kiểu chiết của hệ chiết có thể là cả đồng thể và dị thể, mà chất phân tích nằm trong mẫu rắn, bột, lá, sợi… • Các trang thiết bị và ví dụ Trang thiết bị của kỹ thuật chiết Soxhlet gồm hai loại: 1. Hệ Soxhlet thường và đơn giản. 2. Hệ Soxhlet tự động (Auto- Soxhlet) Cách chiết theo hệ (1) là đơn giản vận hành bằng tay, còn cách (2) là vận hành một cách tự động. Kỹ thuật này chủ yếu sử dụng để chiết tách chất hữu cơ nằm trong pha rắn hay bột hay mảnh nhỏ, hay các vật liệu khô (lá cây), vì thế nên nó là hệ chiết dị thể. Ví dụ: Chiết Soxhlet thường lấy một số hoá chất bảo vệ thực vật từ mẫu rau quả: Lấy 10 g mẫu đã được nghiền nhỏ và trộn đều vào cốc chiết của hệ chiết. 17 Thêm 25- 30 g Na2SO4 khan, 30 ml dung môi chiết n- hexan có 20% Cl 2H2. Sau đó tiến hành chiết trong 180 phút. Kỹ thuật chiết này có ưu điểm là chiết triệt để, song các điều kiện chiết phải nghiêm ngặt thì mới có kết quả tốt. Vì thế hệ thống vận hành chiết tự động cho kết quả tốt hơn nhưng phải có hệ thống trang bị hoàn chỉnh. Nó thích hợp chiết các chất hữu cơ từ các đối tượng mẫu khác nhau. Chất phân tích có trong mẫu rắn, bột, vật mẫu xốp khô (lá cây)… kỹ thuật này được ứng dụng chủ yếu để tách các hợp chất hữu cơ từ các mẫu cây lá, rau quả hoặc mẫu đất như ví dụ trên. 1.4.4. Các phương pháp sắc kí Phương pháp sắc kí được Xvét phát minh ra để tách các chất bằng hấp phụ từ đầu thế kỷ 20 (1903). Đến nay đã trở thành một phương pháp tinh chế, định tính, định lượng rất quan trọng trong hoá học nói chung và trong nghành hoá học hữu cơ nói riêng, được phát triển rất mạnh và được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc kí như sau: Hỗn hợp chất nghiên cứu ở pha lỏng (dung dịch) hay pha khí được cho qua bề mặt chất hấp phụ ở pha rắn hay pha lỏng khó bay hơi. Do khả năng tương tác với pha tĩnh khác nhau nên các chất khác nhau trong hỗn hợp nghiên cứu chuyển động với vận tốc khác nhau và dần được phân tách ra từng cấu tử riêng biệt. Người ta phân chia ra làm các loại sắc kí khác nhau. 1.4.4.1. Sắc kí cột (sắc kí hấp phụ) Trong phương pháp sắc kí cột, người ta dùng các cột thuỷ tinh hay đôi khi bằng kim loại, có kích thước thông thường là 15 × 1; 25 × 2; 40 × 3 hoặc 60 × 4 cm; dùng các chất hấp phụ dạng bột thường là nhôm oxit, siliccagel, tinh bột hoặc barisunphat… hoặc một chất bất kỳ khác không tương tác với dung môi. Hỗn hợp chất nghiên cứu được hoà tan trong một dung môi trơ thích hợp và cho chảy qua cột. Các chất trong hỗn hợp nghiên cứu dần dần tách ra khỏi chúng và chúng chiếm 18 các vị trí khác nhau trên cột hấp phụ. Vì lúc đầu người ta tiến hành trên cột thí nghiệm với các chất màu, khi chúng tách ra tạo thành các khoang màu khác nhau trên ống hấp phụ nên phương pháp này gọi là phương pháp sắc kí. Sau đó người ta tách riêng từng chất hoặc bằng cách cắt cột hấp phụ thành từng đoạn ứng với từng chất, hoặc liên tục đổ thêm dung môi, các chất sẽ lần lượt được rửa trôi và thoát ra bình hứng ở các thời điểm khác nhau. Đơn giản bằng sơ đồ hoá như sau: Bình đựng dung dịch Cột chứa chất hấp phụ Bình hứng Có thể dùng phương pháp này để tách các chất không có màu, nhưng phải dùng các chất chỉ thị hay thuốc thử thích hợp để nhận biết khi nào chúng bắt đầu thoát ra bình hứng. 1.4.4.2. Sắc kí giấy 19 Sắc kí giấy là một dạng đặc biệt của sắc kí phân bố do Consden, Gordon, và Martin phát minh ra năm 1944. Pha tĩnh ở đây là nước thấm trên giấy lọc đặc biệt (xenluloza tinh khiết). Dung dịch chất nghiên cứu được chấm trên một đầu của giải giấy (cách mép giấy chừng 2,5 cm) và mỗi giọt cách nhau chừng 2cm. Người ta thường nhỏ đồng thời cả dung dịch mẫu so sánh đã biết so sánh. Sau đó đầu giấy lọc được nhúng trong một dung môi hay hỗn hợp dung môi thích hợp đã bão hoà nước. Do lực mao dẫn, dung môi sẽ thấm lên giấy sắc kí, kéo theo chất nghiên cứu chuyển động lên phía trên và tạo thành vết trên giấy mà người ta có thể nhận biết được bằng mắt hoặc bằng chất chỉ thị. Tỷ số R f giữa độ dịch chuyển của chất nghiên cứu và dung môi được gọi là hằng số sắc kí, hằng số sắc kí, hằng số này là đại lượng quan trọng đặc trưng cho từng chất. Để thu được kết quả tách tốt hơn, người ta có thể lặp lại thao tác trên với một dung môi khác và theo chiều thẳng góc với chiều chạy lần trước (sắc kí phân bố hai chiều). Sắc kí giấy thường dùng để định tính các chất, nhưng cũng có thể dùng để định lượng sơ bộ dựa vào độ đậm và tiết diện của vết chất nghiên cứu. 1.4.4.3. Sắc kí lớp mỏng Phương pháp này được Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển và hoàn thiện năm 1955, khiến nó có ứng dụng rộng rãi. Người ta tráng một lớp mỏng chất hấp phụ có thể là Al2O3 hoặc silicagel, lên một tấm kính kích thước 10× 12 hoặc 20 × 20 cm, chấm một giọt chất nghiên cứu hay hỗn hợp nghiên cứu lên một đầu bản (cách mép khoảng 2 cm) rồi cho dung môi chạy như sắc kí giấy. Phương pháp sắc kí lớp mỏng thường cho hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được sử dụng để định tính và tách các chất thiên nhiên. Nó cũng được các nhà tổng hợp hoá học sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được sau phản ứng. 20 1.4.4.4. Sắc kí khí lỏng Những năm gần đây sắc kí khí lỏng (còn được gọi là sắc kí khí) được phát triển mạnh mẽ, mở ra khả năng lớn trong phân tích và tách các hợp chất dễ bay hơi. Phương pháp thông thường là cho vài giọt Microlit chất lỏng phân tích vào thiết bị bay hơi rồi dùng dòng khí mang (thường là Heli) lôi cuốn hơi của chúng qua một ống dài nung nóng nạp đầy một chất rắn xốp (ví dụ gạch chịu lửa tán nhỏ, nhôm oxit, silicagel, than hoạt tính…) được tẩm bằng chất lỏng khó bay hơi như dầu silicon, polyetylen glycol, các este sôi cao… Khi đó xảy ra sự phân bố các chất giữa pha lỏng và pha khí, đồng thời chỉ cần sự khác nhau nhỏ trong sự phân bố này giữa các cấu tử trong hỗn hợp cũng đủ để phân tách hoàn toàn các chất lỏng trong hỗn hợp, vì nó được lặp đi lặp lại trong ống dài. Người ta thường nhận biết từng chất thoát ra ở cuối ống bằng cách đo sự thay đổi độ dẫn điện của khí thoát ra. Tuy nhiên việc phát hiện một pic trong sơ đồ sắc kí mới là điều kiện cần, nhưng chưa đủ về độ tinh khiết của một chất, phương pháp sắc kí khí vẫn rất hữu ích khi phân tích một lượng nhỏ hỗn hợp cũng như để tách và tinh chế các chất. Cần nhấn mạnh rằng, trong phương pháp sắc kí nói chung cấu trúc phân tử của các hợp chất có ảnh hưởng lớn đến cân bằng hấp phụ, cũng như hệ số phân bố của chúng giữa các pha, do đó liên quan chặt chẽ đến hằng số Rf. Vì vậy kết qủa phân tích sắc kí cũng cho ta thấy những thông tin bổ ích về cấu trúc của hợp chất. Sau quá trình tinh chế, ta cần kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất thu được bằng cách đo nhiệt độ nóng chảy (đối với chất rắn) hoặc nhiệt độ sôi (đối với chất lỏng) hoặc đo tỷ khối, chỉ số khúc xạ, chụp phổ… 1.4.4.5. Sắc kí lỏng cao áp Sắc kí lỏng cao áp (phương pháp sắc kí lỏng có hiệu quả cao) là một dạng của sắc kí lỏng dạng cột. Trong phương pháp này cột sắc kí thường được chế tạo bằng thép không gỉ, có đường kính trong khoảng 2- 6 mm và dài 10- 25 cm, mặt trong phải được đánh bóng. Chất hấp phụ được bơm vào dưới dạng huyền phù trong dung