Tài liệu Nghiên cứu chế tạo vi cảm biến điện hóa trên cơ sở polyme dẫn biến tính để ứng dụng trong y sinh và môi trường (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  Nguyễn Hải Bình NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HỆ VI CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ POLYME DẪN BIẾN TÍNH ĐỂ ỨNG DỤNG CHO Y SINH VÀ MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội - 2019 Luận án được hoàn thành tại: Phòng Vật liệu Nano y sinh, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trần Đại Lâm Phản biện 1: ..................................................... Phản biện 2: ..................................................... Phản biện 3: ..................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Cơ sở tổ chức tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi ngày tháng giờ năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Hà Nội, Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Thư viện Viện Khoa học vật liệu, Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. MỞ ĐẦU Hiện nay, cảm biến sinh học được xem như một thiết bị đầy tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: sinh học, dược phẩm, nông nghiệp, vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ môi trường và an toàn trong công nghiệp... Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các thành phần sinh học đặc trưng kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hóa chất. Vi cảm biến điện hóa có cấu trúc đơn giản, có thể thay đổi thiết kế và phát triển cấu trúc, khả năng tích hợp cao với các phần tử của vi hệ thống, chế tạo số lượng lớn nên giá thành giảm. Các điện cực làm việc, điện cực đối, điện cực so sánh đều được tích hợp trên một chip, giúp giảm thể tích và khối lượng của mẫu cần phân tích do kích thước điện cực giảm. Các phần tử của vi cảm biến điện hóa đều được chế tạo trên công nghệ planar nên dễ đóng gói, tăng độ ổn định và độ lặp lại. Trên thế giới, nhiều nhóm nghiên cứu đã phát triển các vi cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện vi cơ điện tử với các hiệu ứng vật lý – hóa học khác nhau như: khối lượng, áp suất, điện hóa… So sánh với vi cảm biến sử dụng hiệu ứng khối lượng, áp suất, vi cảm biến điện hóa có ưu điểm hơn như thiết kế chế tạo trên cùng công nghệ MEMS nên kích thước nhỏ gọn, dễ chế tạo số lượng lớn làm giảm giá thành, có cấu trúc đơn giản hơn, dễ tích hợp với hệ thống vi kênh - vi van - vi bơm hơn, dễ đóng gói hơn, dễ sử dụng các phương pháp điện hóa để kiếm tra tính chất của thiết bị. Tại Việt Nam, một số kết quả ban đầu về chế tạo và phát triển cảm biến sinh học đã được công bố bởi các đơn vị nghiên cứu trong nước. Tóm lại, hướng nghiên cứu phát triển các vi hệ thống điện hóa ứng dụng trong chẩn đoán y sinh và quan trắc môi trường đang được quan tâm và đầu tư mạnh tại nhiều quốc gia trên thế giới. Việt Nam là một quốc gia có nền kinh tế đang phát triển mạnh mẽ cùng dân số gần 90 triệu người, triển vọng về phát triển các thiết bị, các vi hệ thống điện hóa trên cơ sở ứng dụng vật liệu nano có giá trị thúc đẩy khoa học công nghệ và ý nghĩa kinh tế xã hội sâu sắc. Trên cơ sở khoa học và yêu cầu thực tiễn đó, tôi lựa chọn thực hiện luận án “Nghiên cứu chế tạo hệ vi cảm biến điện hóa trên cơ sở polyme dẫn biến tính để ứng dụng trong y-sinh và môi trường”. 1 Vấn đề đặt ra cho luận án này là phải nghiên cứu chế tạo phát triển và thử nghiệm các hệ vi cảm biến sinh học điện hóa nền (platform) có chế độ hoạt động đơn giản, thời gian đáp ứng nhanh, độ chính xác cao, dễ dàng tùy biến cấu trúc, dễ dàng tích hợp linh kiện. Với mục tiêu nghiên cứu, chế tạo một số hệ vi cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở vật liệu polyme dẫn biến tính vật liệu cấu trúc nano ở điều kiện công nghệ hiện có ở trong nước, luận án đặt ra các nhiệm vụ cần phải giải quyết là: thiết kế hệ vi cảm biến điện hóa phù hợp với điều kiện công nghệ hiện có, tiến hành thực nghiệm chế tạo cảm biến, khảo sát các tính chất đặc trưng của cảm biến đã chế tạo, thử nghiệm phân tích một số chỉ tiêu trong y sinh, chất ô nhiễm môi trường và chất trong an toàn thực phẩm. Trên cơ sở đó, rút ra được những kết luận về khả năng chế tạo – phát triển và ứng dụng hệ vi cảm biến này trong những điều kiện công nghệ hiện có ở trong nước. Đối tượng nghiên cứu của luận án: Hệ vi cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở polyme dẫn (PANi và P(1,5-DAN)) được biến tính/chức năng hóa với vật liệu cấu trúc nano (CNTs, hạt nano Fe3O4 và Graphen). Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Nghiên cứu chế tạo hệ vi cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở polyme dẫn ((PANi và P(1,5-DAN)) được biến tính/chức năng hóa với vật liệu cấu trúc nano (CNTs, hạt nano Fe3O4 và Graphen). Thử nghiệm ứng dụng hệ vi cảm biến sinh học điện hóa đã chế tạo trong phân tích y sinh và môi trường. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: Nghiên cứu biến tính/chức năng hóa các vật liệu polyme dẫn sử dụng các vật liệu cấu trúc nano (CNTs, hạt nano Fe3O4, Graphen) để phát triển các cảm biến sinh học điện hóa và thử nghiệm ứng dụng các cảm biến sinh học điện hóa trong phân tích y sinh và môi trường. Phương pháp nghiên cứu: Luận án được tiến hành bằng phương pháp thực nghiệm. Các vi điện cực điện điện hóa tích hợp được chế tạo bằng công nghệ Vi điện tử/Vi cơ điện tử. Cấu trúc bề mặt của các màng compozít trên cơ sở polyme dẫn biến tính/chức năng hóa vật liệu nano được khảo sát bằng các kỹ thuật: phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ Raman, ảnh hiển 2 vi điện tử quét, ảnh hiển vi lực nguyên tử. Tính chất điện hóa của các màng compozít được đánh giá bằng các kỹ thuật phân tích điện hóa: Vôn-Ampe tuần hoàn, Vôn-Ampe xung sóng vuông, phổ tổng trở điện hóa. Các thử nghiệm phân tích y sinh, môi trường của cảm biến sinh học điện hóa được thực hiện bằng các kỹ thuật điện hóa: Vôn-Ampe tuần hoàn, đo dòng thời gian thực, Vôn-Ampe xung sóng vuông trên thiết bị điện hóa đa năng Autolab PGS/TAT 30A (EcoChimie, Hà Lan). Nội dung nghiên cứu của luận án: - Nghiên cứu trùng hợp điện hóa màng compozít trên cơ sở vật liệu polyme dẫn (PANi, P(1,5-DAN)) biến tính/chức năng hóa bởi vật liệu cấu trúc nano (CNTs, hạt nano Fe3O4, Graphen). - Nghiên cứu cấu trúc bề mặt, tính chất điện hóa của màng compozít trên bề mặt hệ vi điện cực điện hóa tích hợp. - Nghiên cứu đánh giá đặc trưng của cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở màng compozít (PANi, P(1,5-DAN)) và thử nghiệm ứng dụng phân tích y sinh, môi trường. Bố cục của luận án: Nội dung chính của luận án được trình bày trong 4 chương. Chương I là phần tổng quan về cảm biến sinh học điện hóa, các vật liệu polyme dẫn (PANi, P(1,5-DAN), vật liệu cấu trúc nano và ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa. Chương II trình bày các quy trình công nghệ và thực nghiệm để chế tạo hệ vi điện cực điện hóa tích hợp, tổng hợp điện hóa màng compozít, các kỹ thuật phân tích. Chương III đưa ra các kết quả nghiên cứu tính chất màng compozít trên cơ sở polyme dẫn (PANi và P(1,5DAN)). Chương IV trình bày các kết quả nghiên cứu thử nghiệm hệ vi cảm biến sinh học điện hóa trong phân tích y sinh, môi trường. Các kết quả nghiên cứu của luận án được công bố trong 10 công trình khoa học, bao gồm 04 bài báo đăng trên tạp chí quốc tế (ISI), 02 bài báo đăng trên tạp chí quốc tế (Scopus) và 04 bài đăng trên tạp chí quốc gia. Kết quả chính của luận án: Đã nghiên cứu chế tạo thành công hệ vi điện cực điện hóa tích hợp bằng công nghệ Vi điện tử/Vi cơ điện tử. Đã nghiên cứu trùng hợp điện hóa thành công màng compozít trên cơ sở polyme dẫn được biến tính/chức năng hóa bằng các vật liệu cấu trúc nano. Đã nghiên cứu tính chất cấu trúc và điện hóa của màng compozít trên bề mặt hệ vi điện cực điện hóa. Đã phát triển thành công cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở polyme dẫn (PANi, P(1,5-DAN)) và ứng dụng trong phân tích y sinh, môi trường. 3 Chương I. TỔNG QUAN I. Giới thiệu về cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học điện hóa là một loại cảm biến sinh học trong đó nguyên lý hoạt động dựa trên các hiện tượng điện hóa xảy ra khi cho dòng điện đi qua bình điện phân hoặc do quá trình ôxy hóa – khử trên các điện cực, các hiện tượng trên phụ thuộc vào các tính chất của điện cực và bản chất, nồng độ của các dung dịch. Vi cảm biến điện hóa là hệ cảm biến điện hóa có điện cực làm việc với một trong các kích thước nhỏ hơn 1mm (tương tự như định nghĩa của vi hệ thống cơ điện tử - MEMS). Vi cảm biến sinh học điện hóa cho phép chuyển đổi trực tiếp tín hiệu sinh hóa là kết quả tương tác protein-protein, kháng nguyên-kháng thể, ADN dò-ADN đích, enzym-cơ chất thành các tín hiệu điện. II. Vật liệu polyme dẫn sử dụng trong cảm biến sinh học điện hóa Hai loại polyme dẫn điện tử (PANi và PDAN) đã được nghiên cứu trùng hợp và biến tính để phát triển cảm biến sinh học điện hóa nhờ các ưu điểm của chúng: độ dẫn tốt, dễ dàng gia công, giá thành rẻ, có nhóm chức -NH2 trong cấu trúc polyme để tạo liên kết với phần tử sinh học, độ ổn định và độ bền tốt. Bên cạnh đó, nhằm tăng cường tính chất dẫn, độ hoạt động điện hóa của chúng, các vật liệu cấu trúc nano (như ống nano cácbon, Graphen, hạt nano từ Fe3O4) cũng sẽ được sử dụng để pha tạp/biến tính với các polyme dẫn trong chế tạo – phát triển các vi cảm biến sinh học điện hóa. III. Ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học điện hóa có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khỏe (theo dõi hàm lượng glucôzơ cholesterol trong máu, xác định chuỗi DNA của virút HPV), trong quan trắc môi trường (xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật Atrazin), trong kiểm soát an toàn thực phẩm (xác định hàm lượng Aflatoxin M1 trong sữa, xác định hàm lượng lactôzơ trong sữa) Chương II. THỰC NGHIỆM CHẾ TẠO VI CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA Trong chương này, các quy trình thực nghiệm trong chế tạo – phát triển và thử nghiệm cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở vật liệu polyme dẫn được pha tạp/biến tính với các vật liệu cấu trúc nano (hạt nano Fe3O4, ống nano cácbon, vật liệu graphen…) được trình bày cụ thể. Mô hình sơ đồ các bước thực nghiệm được thể hiện trong Hình II.1 dưới đây. 4 CHẾ TẠO HỆ VI ĐIỆN CỰC TÍCH HỢP CỐ ĐỊNH PHÂN TỬ ĐẦU DÒ SINH HỌC TỔNG HỢP MÀNG POLYME DẪN CHỨC NĂNG HÓA ĐO ĐẠC, PHÂN TÍCH, THỬ NGHIỆM Hình II.1. Sơ đồ các bước thực nghiệm chế tạo – thử nghiệm cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở polyme dẫn I. Chế tạo các vi điện cực điện hóa Trong khuôn khổ thực nghiệm của luận án này, chúng tôi thực hiện chế tạo hệ vi điện cực điện hóa tích hợp trên 1 chíp gồm: điện cực làm việc (Pt), điện cực đối (Pt) và điện cực so sánh (Ag/AgCl) trên phiến Si/SiO2 (được mua từ công ty Wafernet Inc, Mỹ) (trong đó đế Si p<100> có chiều dày ~50 m và lớp SiO2 có chiều dày 1 m) có sử dụng lớp lót Crôm (Cr) để tăng độ bám dính của các lớp vật liệu trên đế. Vi điện cực điện hóa tích hợp được chế tạo trên cơ sở công nghệ vi điện tử bằng kỹ thuật quang khắc (UV-photolithography), lắng đọng màng mỏng pha hơi vật lý (PVD – Physical Vapor Deposition), lift-off... tại Viện Khoa học vật liệu (IMS), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) và tại một số Phòng thí nghiệm nước ngoài (Viện Điện tử cơ bản, Đại học Paris 11, Pháp và Khoa Khoa học Hệ thống và Kỹ thuật, Đại học Quốc gia Thanh Hoa, Đài Loan). Vi điện cực điện hóa tích hợp có kích thước: đường kính điện cực làm việc 100/200/500 m, bề rộng điện cực đối/điện cực so sánh là 100/200 m, khoảng cách giữa các điện cực là 100/200 m với chân cắm ra được thiết kế theo cấu hình USB. II. Trùng hợp điện hóa các màng polyme dẫn II.1. Trùng hợp điện hóa màng polyanilin Dung dịch tiến hành điện phân gồm có monome ANi 0,1 M trong H2SO4 0,5 M có chứa MWCNTs-COOH (hoặc Fe3O4-COOH) 1 % khối lượng (so với Anilin). Quá trình trùng hợp áp dụng phương pháp quét thế vòng (CV) trong dải thế từ 0,0 ÷ 0,9 V (vs Ag/AgCl), tốc độ quét 50 mV/s với bước thế 10 mV trong 20 chu kỳ. Quá trình tổng hợp PANi trong cùng điều kiện cũng được tiến hành để so sánh. II.2. Trùng hợp điện hóa màng polydiaminonaphthalen Màng P (1,5-DAN) pha tạp Fe3O4 phủ trên vi điện cực làm việc (Pt) được trùng hợp trong dung dịch 1,5-diaminonapthalene (DAN) 5mM trong HClO4 1 M và dung dịch Fe3O4 (10mg/ml) với tỉ lệ 0,5 % khối lượng so với DAN theo phương pháp tổng hợp 5 điện hóa quét Vôn-Ampe tuần hoàn (CV) trong khoảng thế từ -0,02 ÷ +0,95 V, tốc độ 50 mV/s, 10 chu kỳ, bước thế 10 mV. Màng PDAN cũng được tổng hợp trong cùng điểu kiện để so sánh tính chất. III. Cố định các phần tử sinh học trên vi điện cực điện hóa tích hợp Sau khi các màng compozít trên cơ sở màng polyme dẫn đa chức năng (được biến tính bằng vật liệu cấu trúc nano) được trùng hợp điện hóa trên bề mặt vi điện cực làm việc (của hệ vi điện cực tích hợp), các phần tử sinh học (đầu dò sinh học như: enzym, aptamer, chuỗi ADN hoặc kháng thể đơn dòng…) cần được cố định lên bề mặt màng compozít để phát triển cảm biến sinh học điện hóa. Các đầu dò sinh học được cố định lên bề mặt màng compozít thông qua các liên kết hóa học (-NH-COO-) bằng kỹ thuật sinh học. Các đầu dò sinh học được sử dụng trong luận án này là các đầu dò sinh học có độ đặc hiệu cao như: enzym (Glucose oxidase, Cholesterol oxidase…), kháng thể đơn dòng, chuỗi ADN, chuỗi aptamer. IV. Các phương pháp phân tích điện hóa Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng nhiều phương pháp phân tích điện hóa khác nhau để khảo sát tính chất của màng compozít (trên cơ sở PANi và PDAN) và xác định hàm lượng chất cần phân tích trong dung dịch như: Vôn-Ampe tuần hoàn, xung sóng vuông, đo dòng, phổ tổng trở điện hóa. Các thực nghiệm điện hóa được thực hiện trên thiết bị điện hóa đa năng Autolab PGS/TAT 30 (Ecochimie, Hà Lan) tại Viện Khoa học vật liệu (VAST), Viện Kỹ thuật nhiệt đới (VAST), Trung tâm CETASD (Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội). V. Các kỹ thuật phân tích bề mặt và cấu trúc màng Các kỹ thuật phân tích bề mặt và cấu trúc như phương pháp hiển vi điện tử quét (FE-SEM), phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (HRTEM) phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM), phổ hấp thụ hồng ngoại (FT-IR), phổ Raman được sử dụng trong nghiên cứu khảo sát tính chất bề mặt của các màng vật liệu trong vi cảm biến sinh học điện hóa Chương III. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VI CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU POLYME DẪN I. Phát triển vi cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở polyme dẫn - polyanilin I.1. Pha tạp màng PANi bằng ống nano cácbon (CNTs) 6 Phổ CV thu được trong cả hai trường hợp được trình bày trên hình III.1 có hình dáng tương tự như nhau, đây chính là phổ CV đặc trưng của quá trình tổng hợp điện hóa màng PANi. Tuy nhiên một điều rất lý thú là cường độ dòng điện thu được của màng PANi/MWCNTs lớn hơn cỡ gần 10 lần so với màng PANi. Như vậy với sự pha tạp MWCNTs trong màng có thể đã làm tăng : (i) độ dẫn điện của màng và/hoặc (ii) bề mặt tiếp xúc giữa màng với dung dịch chứa monome. Hình III.1. Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV của màng PANi (a) và màng PANi/MWCNTs (b) tại chu kỳ thứ 20 trên vi điện cực tích hợp I.2. Pha tạp màng PANi bằng hạt nano Fe3O4 Phổ tổng hợp điện hóa của màng PANi pha tạp Fe3O4 được thể hiện trong Hình III.2. Ta quan sát thấy sự tăng cường độ dòng điện hóa của màng PANi có pha tạp Fe3O4 (đường liền nét) khi so sánh với màng PANi (đường đứt nét) (như trong Hình III.3); điều đó có nghĩa là hạt nano Fe3O4 có thể đã làm tăng cường độ dòng của màng PANi trong cùng điều kiện thực nghiệm (thiết kế của điện cực và tính chất màng PANi như nhau), chứng tỏ sự pha tạp Fe3O4 vào màng PANi làm tăng độ hoạt động điện hóa hoặc bề mặt tiếp xúc giữa màng với dung dịch chứa monome; điều đó dẫn đến việc tăng khả năng truyền điện tử trong cấu hình của vi cảm biến điện hóa 7 1000 1000 800 800 600 600 400 400 I / A I /A Fe3O4/PANi 200 0 PANi 200 0 -200 -200 -400 -400 -600 -800 -600 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 -0,2 1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 E /V vs. Ag/AgCl E /V vs. Ag/AgCl Hình III.2: Phổ trùng hợp điện hóa CV của Hình III.3. So sánh phổ trùng hợp điện hóa màng PANi pha tạp Fe3O4 của màng PANi-Fe3O4 và PANi I.3 Nghiên cứu phát triển vi cảm biến điện hóa sử dụng cấu trúc lớp PANi/Graphen Chiều dày và cấu trúc cũng như nhóm chức của màng PANi/Graphen được đánh giá bằng phổ Raman (như Hình III.4). Sự biến đổi về cấu trúc của màng Graphen trước và sau khi chuyển lên bề mặt điện cực làm việc Pt/PANi được quan sát rõ ràng trong phổ Raman thông qua việc so sánh với phổ Raman của màng PANi và màng Graphen. Phổ Raman của màng PANi/Graphen (đường đen) thể hiện các dải phổ được tạo thành từ PANi và graphene, điều đó chứng tỏ sự tồn tại đồng thời cả hai vật liệu trong màng. Vấn đề cần nghiên cứu là màng graphen đã tạo liên kết hóa học với màng PANi hay là màng graphen chỉ gắn tạm thời trên màng PANi. Trong luận án này, ta thấy vân tại vị trí 1507 cm-1 (liên kết N-H, lưỡng cực) đã bị che chắn cùng lúc đó vân tại vị trí 1612 cm-1 (liên kết C-C, vòng benzenoid) đã dịch chuyển về phía đỏ tới vị trí 1597cm-1. Các kết quả này chứng tỏ sự tăng nồng độ của các cấu trúc benzenoid, hay nói cách khác là sự xuất hiện của liên kết hóa học giữa PANi và graphen. Đây là liên kết π-π giữa vòng quinoid của PANi với graphen. Các liên kết này tạo kênh truyền điện tích giữa Graphen và PANi do đó làm tăng khả năng truyền dẫn điện tích-hạt mang điện của vật liệu PANi/Graphen. Từ đó chúng làm tăng độ dẫn của vật liệu, giảm thời gian truyền tín hiệu của cảm biến sử dụng vật liệu PANi/Graphen. 8 Hình III.4. Phổ Raman của các màng graphen, PANi và PANi/Graphen Ảnh hưởng của glutaraldehít lên tính chất điện hóa của màng PANi/Graphen được thể hiện trong Hình III.5. 40 20 I /A 0 -20 -40 -60 -80 PANi/Graphen PANi/Graphen/Glutaraldehyde -100 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 E /V vs. Ag/AgCl Hình III.5. Phổ điện hóa của màng PANi/Graphen trước và sau khi ủ glutaraldehít trong dung dịch HCl 0,1M (dải thế quét: -0,2 ÷ +0,8 V, tốc độ quét: 50 mV/s, bước thế 10 mV) 9 Hình dạng của phổ CV không thay đổi (trong đó, hai cặp đỉnh ôxy hóa-khử tại thế 0,25V/0,2 V và 0,65V/0,57V đặc trưng cho tính chất điện hóa của lớp polyaniline, lớp vật liệu graphen không có đỉnh điện hóa đặc trưng) nhưng cường độ dòng đã giảm; điều này chứng tỏ glutaraldehít đã được cố định và ảnh hưởng đến độ hoạt động điện hóa của cảm ứng. I.4 Nghiên cứu chế tạo vi cảm biến điện hóa cấu trúc lớp PANi-Fe3O4/Graphen Cấu trúc bề mặt màng compozít PANi-Fe3O4/Graphen được đánh giá bằng thiết bị hiển vi điện tử quét (FESEM S-4800, Hitachi) tại Viện Khoa học vật liệu (như thể hiện trong Hình III.6) Graphen PANi Fe3O4 Hình III.6. Ảnh FESEM của màng PANi-Fe3O4/Graphen Từ ảnh FESEM, ta quan sát thấy lớp màng graphen phẳng và trong suốt trên bề mặt điện cực, nó sẽ làm tăng độ dẫn điện tử và khả năng cố định phân tử sinh học thông qua các nhóm chức –CO trên bề mặt. Từ đó chúng làm tăng độ nhạy, giảm thời gian đáp ứng của cảm biến. Phổ CV của màng PANi-Fe3O4/Graphen thể hiện đầy đủ các cặp đỉnh oxi hóa-khử của màng PANi (như Hình III.7), tuy nhiên cường độ dòng ra của màng PANiFe3O4/Graphen (cường độ dòng tại đỉnh +0,25 V đạt ~ 380 A) lớn hơn nhiều (khoảng 8 lần) so với màng PANi thuần; hạt nano Fe3O4 (đóng vai trò như chất tăng cường hoạt 10 động điện hóa) được pha tạp với nồng độ nhỏ không làm thay đổi dạng phổ nhưng đã tăng cường độ hoạt động điện hóa của màng compozít, màng graphen đã tăng độ dẫn của màng nên ta thấy cường độ dòng tại các píc (Ipa và Ipc) của màng compozít lớn hơn (khoảng 8 lần) so với cường độ píc của màng PANi thuần. 400 (1) PANi/Fe3O4/Graphene films (1) 300 (2) PANi films I / A 200 100 (2) 0 -100 -200 -300 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 E /V vs. Ag/AgCl Hình III.7. Tính chất điện hóa của màng PANi-Fe3O4/Graphen II. PHÁT TRIỂN VI CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ MÀNG P(1,5-DAN) II.1 Tổng hợp điện hóa màng P(1,5-DAN) pha tạp hạt nano Fe3O4 Khi pha tạp hạt nano Fe3O4 vào màng PDAN trong quá trình trùng hợp điện hóa insitu, hạt nano từ Fe3O4 đã liên kết với monome DAN thông qua cầu liên kết [Fe3O4]COO-NH-[DAN] và làm tăng độ hoạt động điện hóa (electroactivity) của màng vật liệu. Sau 20 chu kỳ, cường độ dòng của màng PDAN/Fe3O4 đạt ~ 120 A trong khi đó, cường độ dòng của màng PDAN chỉ đạt ~ 8 A, như vậy cường độ dòng của màng PDAN/Fe3O4 đã tăng rất lớn so với màng PDAN thông thường. Độ hoạt động điện hóa của màng PDAN/Fe3O4 được khảo sát và so sánh với màng PDAN bằng phổ điện hóa Von-Ampe tuần hoàn (hình III.8). Phổ điện hóa của polyme PDAN-Fe3O4 không có sự thay đổi về hình dạng nhưng cường độ tín hiệu tăng lên rõ 11 rệt, diện tích phổ cũng tăng lên (thể hiện sự tăng cường về độ dẫn điện hóa của màng) khoảng 10 lần. Do độ dẫn điện hóa của màng PDAN/Fe3O4 nên tín hiệu ra của cảm biến điện hóa cũng tăng tương ứng, từ đó, độ nhạy của cảm biến cũng tăng lên.. 60 40 I /A 20 0 -20 -40 P1,5-DAN P1,5-DAN/Fe3O4 -60 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 E /V vs. Ag/AgCl Hình III.8. So sánh hoạt động điện hóa của các màng PDAN pha tạp/không pha tạp Fe3O4 II.2 Chế tạo vi cảm biến điện hóa Graphen/PDAN Độ hoạt động điện hóa của màng Graphen/PDAN được khảo sát và so sánh với màng PDAN bằng phổ điện hóa Von-Ampe tuần hoàn (Hình III.9 dưới đây). 150 100 I / A 50 0 -50 Pt/Gr/P(1,5-DAN) Pt/P(1,5-DAN) -100 -150 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E /V vs. Ag/AgCl Hình III.9. So sánh hoạt động điện hóa của các màng Pt/PDAN và Pt/Graphen/PDAN So với màng PDAN thuần, phổ điện hóa của màng polyme Graphen/PDAN không 12 có sự thay đổi về hình dạng nhưng cường độ tín hiệu tăng lên rõ rệt, diện tích phổ cũng tăng lên (thể hiện sự tăng cường về độ dẫn điện hóa của màng) khoảng 15 lần. Do độ dẫn điện hóa của màng Graphen/PDAN nên tín hiệu ra của cảm biến điện hóa cũng tăng tương ứng, từ đó, độ nhạy của cảm biến cũng tăng lên. Sự tăng độ dẫn điện hóa của màng PDAN trên vật liệu Graphen có thể do tương tác của nhóm NH2-Graphen đã làm thay đổi vùng cấm của vật liệu dẫn đến tăng khả năng dẫn truyền điện tử của vật liệu. Chương 4. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC VI CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRONG PHÂN TÍCH I. ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH Y-SINH I.1 Xác định hàm lượng glucôzơ trong dung dịch I.1.1 Xác định hàm lượng glucôzơ bằng vi cảm biến sinh học điện hóa PANi/CNTs Đường đặc trưng dòng đáp ứng của vi cảm biến trên cơ sở màng nanocompozíte PANi/CNTs/GOx (với tỷ lệ pha tạp CNTs là 1,0 % khối lượng) được chỉ ra trong hình IV.1 dưới đây. Đường chuẩn của vi cảm biến trên cơ sở màng composite PANi/CNTs có pha tạp 1,0%CNTs 0,4 ∆i (μA) 0,3 0,2 y = 0,0371x + 0,0074 R² = 0,9962 0,1 0 0 2 4 6 Nồng độ (mM) 8 10 Hình IV.1. Đường đặc tuyến dòng đáp ứng Hình IV.2. Đường chuẩn của vi cảm biến của vi cảm biến PANi/CNTs/GOx khi thêm PANi/CNTs/GOx với dải nồng độ 1-9 mM glucôzơ vào hệ điện hóa (E = 0,7V) Có thể thấy rằng cường độ dòng khi đo trong dung dịch PBS (10 mM, pH = 7) đạt ổn định sau khoảng 200 s. Khi thêm dung dịch glucôzơ vào thì cường độ dòng tăng nhanh và đạt ổn định sau khoảng 30-40 s. Tuy nhiên khi nồng độ glucôzơ vượt giá trị 9mM thì sự tăng cường độ dòng là rất yếu, thậm chí bị giảm. Điều này có thể do lượng enzym GOx cố định trên điện cực chưa nhiều và hoạt tính thấp (20 kU). 13 Đường chuẩn mô tả mối quan hệ giữa chênh lệch cường độ dòng đáp ứng ΔI (A) và nồng độ glucôzơ C (mM) đã thêm vào bình điện hóa được đưa ra tại hình IV.2. Phương trình hồi quy có dạng ΔI (A) = 0,0074 + 0,0371*C (mM). Hệ số tương quan của phương trình hồi quy đạt R2 = 0,9962. I.1.2 Xác định hàm lượng Glucôzơ bằng vi cảm biến PANi-Fe3O4 Cường độ dòng của quá trình ôxy hóa của glucôzơ trên vi cảm biến PANi/Fe3O4/GOx tăng theo nồng độ glucôzơ trong dung dịch được thể hiện trong Hình IV.3. Hình IV.3. Đáp ứng dòng của vi cảm biến Hình IV.4. Đường chuẩn của cảm biến sinh học PANi/Fe3O4/GOx và PANi/GOx tại PANi/Fe3O4/GOx điện thế +0,7 V trong dung dịch PBS (pH=7) khi thêm liên tiếp 0,5mM glucôzơ sau mỗi 50s Từ kết quả trên Hình IV.3, ta xác định được độ nhạy của vi cảm biến đạt 10 A.mM−1.cm−2 và thời gian đáp ứng nhỏ hơn 10 s. Từ đường chuẩn của cảm biến (Hình IV.4), khoảng tuyến tính của vi cảm biến PANi/Fe3O4/GOx được xác định là 0,5 đến 3,5 mM với R2 = 0,9992, LOD = 0,25 mM. Phương trình hồi qui có dạng: I (A) = 0,33021*C (mM) + 0,04503. I.1.3 Xác định hàm lượng glucôzơ bằng vi cảm biến điện hóa PANiFe3O4/Graphen/GOx Đường đáp ứng thời gian thực của cảm biến PANi-Fe3O4/Graphen/GOx đối với nồng độ glucôzơ trong dung dịch được thể hiện trong Hình IV.5 dưới đây (mỗi lần thêm 3 mM glucôzơ vào dung dịch, nhiệt độ phòng, không có khuấy, dung dịch đệm 50 mM PBS 1x). 14 Hình IV.5. Đáp ứng dòng ra của vi cảm biến Hình IV.6. Đường chuẩn của vi cảm biến PANi-Fe3O4/Graphen/GOx khi thêm liên PANi-Fe3O4/Graphen/GOx theo nồng độ tiếp các nồng độ của glucôzơ (E = 0,7V, glucôzơ nhiệt độ phòng, không có khuấy, dung dịch đệm 50 mM PBS 1x) Ta thấy cảm biến có thời gian đáp ứng ngắn đối với sự thay đổi nồng độ của glucozơ trong dung dịch, tđáp ứng ~ 10-15 s, cường độ dòng đáp ứng của cảm biến có độ ổn định tốt tại các nồng độ của glucôzơ. Dựa trên đường đáp ứng của cảm biến, ta xác định đường đặc tuyến của cảm biến theo phương trình hồi quy như sau: I (A) = 1,484*C (mM) + 6,764. Từ đó, ta xác định cảm biến có độ sai số tương đối là R2 = 0,9969 trong dải nồng độ từ 2,9 ÷ 23 mM (như trong Hình IV.6). Từ đường chuẩn của cảm biến, ta xác định được độ nhạy của cảm biến là 47 A.mM1 .cm-2, LOD = 1,5 mM; độ nhạy này lớn hơn đối với cảm biến không có màng graphen đã được chúng tôi phát triển trước đây (khoảng 10 ÷ 30 A.mM-1.cm-2). I.2. Xác định hàm lượng cholesterol trong dung dịch I.2.1. Xác định hàm lượng cholesterol bằng vi cảm biến PANi/CNTs Đường đặc trưng đáp ứng dòng của vi cảm biến PANi/CNTs/ChOx với sự có mặt của hợp chất trung gian K3[Fe(CN)6] tại điện áp E= -0,3V được đưa ra tại hình IV.7. Nồng độ cholesterol là nồng độ đã được pha loãng (coi sự thay đổi thể tích là không đáng kể). 15 Hình IV.7. Đặc trưng đáp ứng dòng theo thời gian của vi cảm Hình IV.8. Đường chuẩn của vi cảm biến biến PANi/MWCNTs/ChOx PANi/MWCNTs/ChOx khi thêm liên tiếp cholesterol vào dung dịch PBS 50mM (pH=7,0) tại điện áp -0,3V Vi cảm biến PANi/CNTs/ChOx đạt ổn định dòng (~ 2,8 A) trong dung dịch đệm PBS 50 mM (pH = 7) sau khoảng 400 s. Dựa vào sự chênh lệch cường độ dòng đáp ứng của vi cảm biến PANi/CNTs/ChOx và tổng nồng độ cholesterol đã được thêm vào sẽ xây dựng được đường chuẩn xác định cholesterol tại điện áp -0,3V (so với Ag/AgCl) với sự có mặt của K3[Fe(CN)6]. Phương trình hồi quy có dạng ΔI (A) = 0,0174 + 4,3014 * C (mM). Hệ số tương quan của phương trình hồi quy: R2 = 0,9985. I.2.2 Xác định nồng độ cholesterol bằng cảm biến PANi/Fe3O4 Đường đặc tuyến đáp ứng dòng của vi cảm biến PANi/Fe3O4/ChOx-Fe3O4 được trình bày trong hình IV.23 dưới đây. Kết quả cho thấy cảm biến cho đáp ứng dòng tốt (tuyến tính) trong khoảng nồng độ cholesterol từ 0,196 ÷ 1,803 mM. Ở các nồng độ cholesterol lớn hơn, khi thêm vào bình điện phân, tín hiệu bị nhiễu, đáp ứng dòng kém; điều này là do ChOx khi xúc tác cho phản ứng thủy phhân cơ chất choleterol không phục hồi kịp với tốc độ thêm vào của cơ chất. Với các kết quả trong đồ thị đường chuẩn của cảm biến (hình IV.10), phương trình hồi qui của đường chuẩn sẽ có dạng: I (µA) = (21,45 ± 1,271)×C (mM) + (-0,8352 ± 1,1474), hệ số tương quan của phương trình hồi quy đạt R2 = 0,9929. Độ nhạy trung bình của vi cảm biến PANi-Fe3O4/ChOx-Fe3O4 là S = 21,44 A.mM-1.cm-2. 16 Hình IV.9. Đặc tuyến đáp ứng dòng với các Hình IV.10. Đường chuẩn của vi cảm nồng độ cholesterol (0,19 mM) được thêm biến sinh học điện hóa PANi/Fe3O4/ChOxvào của vi cảm biến sinh học điện hóa PANi- Fe3O4 Fe3O4/ChOx-Fe3O4 I.2.3 Xác định hàm lượng cholesterol bằng vi cảm biến PANi-Fe3O4/Graphen Tương tự như cảm biến glucôzơ, cảm biến xác định cholesterol cũng được chế tạo ứng dụng trên cơ sở cấu trúc điện cực PANi-Fe3O4/Graphen với phần tử đầu dò sinh học là enzym Cholesterol oxidase. Đường đáp ứng thời gian thực của cảm biến Cholesterol được trình bày trong Hình IV.11 dưới đây (trong điều kiện thực nghiệm: mỗi lần thêm 2mM cơ chất Cholesterol vào dung dịch chứa 50mM đệm PBS 1x, nhiệt độ phòng, không có khuấy). Từ Hình IV.11, ta thấy cảm biến cholesterol có thời gian đáp ứng rất ngắn đối với sự thay đổi nồng độ cholesterol (< 5s). Đường đặc tuyến của cảm biến là tuyến tính trong dải nồng độ từ 2 mM đến 20mM (và đáp ứng được yêu cầu phân tích trong y sinh với dải nồng độ từ 3 ÷ 10mM). Phương trình hồi quy của cảm biến có dạng I (µA) = (2,15 ± 0,13)*C (mM) với R2= 0,9986 (hình IV.11 nhỏ), giới hạn phân tích của cảm biến đạt 0,25mM. Với cảm biến có đường kính điện cực làm việc là 250 µm, độ nhạy của cảm biến cholesterol là 1095, 54 AmM-1cm-2 (lớn gấp 2 lần so với cảm biến cholesterol sử dụng vật liệu PANi-CNT đã chế tạo). 17 Hình IV.11. Đường đáp ứng dòng của vi cảm biến sinh học điện hóa PANiFe3O4/Graphen/ChOx (hình nhỏ: đường đặc tuyến của cảm biến cholesterol) I.3. Xác định chuỗi ADN của virút HPV Đồ thị phân tích SWV được ghi lại sau từng quá trình (hoạt hóa với EDC/NHS, trước I /A và sau khi gắn aptamer, kháng nguyên HPV), được trình bày trong Hình IV.12. 3,5x10 -4 3,0x10 -4 2,5x10 -4 2,0x10 -4 1,5x10 -4 1,0x10 -4 5,0x10 -5 (1) + EDC/NHS (2) + HPV-16-L1 (3) + 10nM anti-HPV (4) + 20nM anti-HPV (5) + 30nM anti-HPV (6) + 40nM anti-HPV (7) + 50nM anti-HPV (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 0,0 -5,0x10 -5 -1,0x10 -4 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 E /V vs. Ag/AgCl Hình IV.12. Đồ thị SWV khi xử lí với Hình IV.13. Đường chuẩn của vi cảm biến sinh EDC/NHS (đường 1), khi gắn với aptamer học điện hóa PANi/MWCNTs theo nồng độ HPV HPV-16-L1 với nồng độ 5x10-8 M (đường 2) trong dải 10-80 nM và khi hình thành phức hợp HPV-16-L1 với kháng nguyên HPV (đường 3- 7) (thông số: tần số = 12,5 Hz, tốc độ quét = 50 mV/s, bước thế = 10 mV, biên độ xung = 5 mV, dải thế = -0,6÷ 0,5V trong dung dịch HCl 0,1 M) 18