Tài liệu Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh ứng dụng cho cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VŨ QUANG KHUÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN ĐÀO TẠO QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VẬT LIỆU -----o0o----- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: KHOA HỌC VẬT LIỆU KHOA HỌC VẬT LIỆU ITIMS 2007 - 2009 HÀ NỘI 2009 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA KÊNH ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH TRÊN CƠ SỞ ĐỘ DẪN VŨ QUANG KHUÊ Hà Nội - 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN ĐÀO TẠO QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VẬT LIỆU -----o0o----- NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA KÊNH ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH TRÊN CƠ SỞ ĐỘ DẪN VŨ QUANG KHUÊ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU KHOÁ ITIMS 2007 - 2009 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Mai Anh Tuấn Hà Nội - 2009 ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian 2 năm học tập và làm việc tại Viện ITIMS - trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã giúp tôi ngày càng hoàn thiện kiến thức chuyên môn, phương pháp nghiên cứu khoa học, đồng thời trưởng thành hơn về phong cách, kinh nghiệm sống. Người đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành nhất đó là thầy giáo, Tiến sỹ Mai Anh Tuấn; Thầy đã tạo mọi điều kiện cũng như luôn luôn động viên và giải quyết mọi khó khăn để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể nhóm Biosensor, Viện ITIMS; đặt biệt là nghiên cứu sinh Trần Quang Huy, tiến sỹ Phương Đình Tâm, các anh chị và các bạn trong nhóm Biosensor - những người đã luôn khuyến khích động viên và giúp tôi về chuyên môn trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy cô và cán bộ Viện ITIMS những người đã đem lại cho tôi những kiến thức khoa học và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện tốt nhiệm vụ của mình trong 2 năm học. Tôi xin cảm ơn tới tập thể lớp ITIMS khóa 2007 - 2009, những người thường xuyên động viên, đóng góp những ý kiến và trao đổi kiến thức thực nghiệm trong thời gian chúng tôi học tập tại đây. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình và những người thân, Ban giám hiệu, cán bộ, giáo viên cơ quan nơi tôi công tác đã tạo điều kiện cho tôi cả về vật chất và tinh thần trong những thời gian tôi theo học tại Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2009 Vũ Quang Khuê iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ......................................................................................................................................... i Lời cảm ơn...............................................................................................................................................ii Mục lục ......................................................................................................................................................iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ..................................................................................v Danh mục các bảng biểu .................................................................................................................vii Danh mục các hình vẽ, đồ thị .......................................................................................................viii Mở đầu ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC ............................ 3 1.1. Cảm biến sinh học .................................................................................... 3 1.1.1. Cấu tạo, nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học ......................... 3 1.1.2. Phân loại cảm biến sinh học ............................................................... 4 1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học ............................................................. 13 1.2.1. Trong y tế dự phòng ........................................................................... 13 1.2.2. Phát hiện chuyển đổi gen trong thực phẩm ........................................ 14 1.2.3. Quan trắc môi trường ......................................................................... 14 1.3. Các thiết bị đo cho cảm biến sinh học .................................................... 15 1.4. Nguyên lý hệ đo và xử lý tín hiệu của cảm biến miễn dịch đa kênh ....... 22 1.4.1. Cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn ............................................... 22 1.4.2. Nguyên lý của hệ đo cho cảm biến miễn dịch đa kênh...................... 24 Chương 2. NGHIÊN CỨU, CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA KÊNH ......... 28 2.1. Vi cảm biến độ dẫn đa kênh ..................................................................... 28 2.2. Đóng gói và chức năng hóa cảm biến ...................................................... 33 2.2.1. Đóng gói cảm biến đa kênh................................................................ 33 iv 2.2.2. Chức năng hóa cảm biến đa kênh ...................................................... 35 2.3. Thiết kế chế tạo hệ đo đa kênh cho cảm biến miễn dịch ........................ 37 2.3.1. Thiết kế và chế tạo hệ đo đa kênh ...................................................... 37 2.3.1. Khối nguồn ......................................................................................... 39 2.3.2. Khối phát tín hiệu ............................................................................... 39 2.3.3. Khối tách sóng biên độ....................................................................... 41 2.3.4. Khối xử lý tín hiệu và giao tiếp máy tính .......................................... 42 2.3.5. Khối bàn phím .................................................................................... 45 2.3.6. Khối hiển thị kết quả .......................................................................... 46 2.3.2. Phát triển phần mềm hiển thị số liệu và kết quả đo ........................... 47 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 49 3.1. Đóng gói cảm biến .................................................................................. 50 3.1.1. Thông số của đế và cảm biến sau khi chế tạo .................................... 50 3.1.2. Hàn và đóng gói cảm biến.................................................................. 51 3.2. Các đặc tuyến của thiết bị đo và phần mềm hiển thị số liệu .................... 54 3.2.1. Các đặc tuyến của thiết bị .................................................................. 54 3.2.2. Giao diện người dùng của phần mềm ................................................ 60 3.2.3 Đóng gói thiết bị.................................................................................. 63 3.3. Xác định Vi rút H5N1 gây bệnh ............................................................. 64 3.4. Thảo luận .................................................................................................. 70 3.5. Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài .................................................... 72 Kết luận chung ................................................................................................ 73 Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 75 Phụ lục 1 Phụ lục 2 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Kí hiệu 1 2 3 4 APTS PBS PCR ELISA 5 6 7 DNA, RNA ISFET 8 MOSFET 9 EDC 10 MIA 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 AcChE BSA Ig ECL USB LCD UDC UAC IgM Psoc ADC HID Viết tắt cho Aminopropyltriethoxysilane Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Enzyme-Linked-Immuno Sorbent Assay Deoxyribo Nucleic Axit Ribonucleic Acid Ion Sensitive Field Effect Transistor Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor Ethy-3-(3-dimethyl aminopropyl)Carbodiimide N - methyl - imidazole Acetyl-Cholinesterase Bovine Serum Albumin Immunoglobulin Electrochemiluminescence Universal Serial Bus Liquid Crystal Display Direct Current Alternating Current Immunoglobulin M Programmable System on Chip Analog-to-Digital Converter Human Interface Devices Nghĩa tiếng việt Chất APTS Dung dịch đệm PBS Phản ứng chuỗi polyme Miễn dịch đánh dấu enzyme Axit nucleic Axit ribonucleic Bóng bán dẫn hiệu ứng trường nhạy ion Bóng bán dẫn cấu trúc ôxít kim loại Chất EDC Chất MIA Chất AcChE Chất BSA Globulin miễn dịch Phản ứng ECL Giao tiếp USB Hiển thị tinh thể lỏng Điện áp một chiều Điện áp xoay chiều Kháng thể loại Muy Hệ thống khả trình trên chip Chuyển đổi số tương tự Chuẩn giao tiếp HID vi 23 24 25 26 LED VB S/N ROM Light Emitting Diode Visual Basic Signal / Noise Programmable Read-Only Memory Điốt phát quang Ngôn ngữ Visual Basic Tín hiệu / Nhiễu Bộ nhớ chỉ đọc vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU TT Tên Tiêu đề bảng Trang 1 Bảng 1 Tính chất của các kháng thể 10 2 Bảng 2.1 Các thông số của cảm biến đa kênh 29 3 Bảng 2.2 Các thông số khi hàn cảm biến 35 4 Bảng 3.1 Các thông số của cảm biến và đế cảm biến 51 5 Bảng 3.2a Bảng thông số quá trình đo xác định kháng 66 nguyên vi rút H5N1 lần 1 6 Bảng 3.2b Bảng thông số quá trình đo xác định kháng nguyên vi rút H5N1 lần 2 67 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT Tiêu đề hình vẽ Tên Trang 1 Hình 1.1 Cấu tạo của cảm biến sinh học 3 2 Hình 1.2 Cấu tạo của cảm biến (A) và hệ đo (B) ISFET 6 3 Hình 1.3 Cấu tạo của cảm biến vi điện cực 7 4 Hình 1.4 Cảm biến và thiết bị đo nồng độ thuốc trừ sâu 15 5 Hình 1.5. Xác định nồng độ thuốc trừ sâu ở dạng vi dòng 16 6 Hình 1.6 Mô hình thiết bị đo xác định nồng độ chất Lactate 18 7 Hình 1.7 Cảm biến đa kênh với 16 điện cực làm việc 19 8 Hình 1.8 So sánh độ ổn định làm việc của điện cực chế tạo 20 bằng vàng và cacbon 9 Hình 1.9 Mô hình thiết bị xác định cúm gia cầm dựa trên cảm 21 biến quang Cấu trúc cảm biến vi điên cực 10 Hình 1.10 22 11 Hình 1.11 Sơ đồ thiết lập hệ đo cho cảm biến đa kênh 24 12 Hình 1.12 Sơ đồ điện tương đương cho cảm biến miễn dịch 25 13 Hình 2.1 Mặt nạ chế tạo cảm biến đa kênh 28 14 Hình 2.2 a Kích thước của cảm biến đa kênh 29 15 Hình 2.2 b Thông số chi tiết 01/01của cảm biến 30 16 Hình 2.3 Quy trình chế tạo cảm biến đa kênh 30 17 Hình 2.4 Cảm biến sau khi cắt ra từ phiến Silicon 32 18 Hình 2.5 a Đế cảm biến đa kênh thiết kế cho mặt trên 33 19 Hình 2.5 b Đế cảm biến đa kênh thiết kế cho mặt dưới 33 20 Hình 2.6 Quy trình gia nhiệt cho đế hàn 34 21 Hình 2.7 Quy trình cố định kháng thể vi rút H5N1 lên bề mặt 35 ix cảm biến 22 Hình 2.8 Sơ đồ khối của thiết bị đo đa kênh 38 23 Hình 2.9 Sơ đồ nguyên lý của khối nguồn 39 24 Hình 2.10 a. Sơ đồ khối phát tín hiệu điều chỉnh tần số, b. Điều 40 chỉnh biên độ. 25 Hình 2.11 Sơ đồ mạch chỉnh lưu nhạy pha và dạng tín hiệu 42 26 Hình 2.12 Các môđun của PSoC được sử dụng trong thiết bị đa 43 kênh 27 Hình 2.13 Thiết lập phần cứng và phân bố chức năng chân cho 43 CY8C24894 28 Hình 2.14 Ghép nối USB với chíp Psoc CY8C24894 44 29 Hình 2.15 Các chế độ thiết lập cho USB trong phần mềm 45 Designer 4.4 30 Hình 2.16 Hình ảnh bàn phím và thiết lập chế độ hoạt động 46 31 Hình 2.17 a. Môđun LCD và b. Thiết lập thống số hoạt động 47 32 Hình 2.18 Cửa sổ thiết lập trong Visual Basic của phần mềm 48 hiển thị 33 Hình 3.1 Cảm biến sau khi được chế tạo, cắt thành từng chip 50 34 Hình 3.2 Đế cảm biến sau khi được chế tạo, gia công 51 35 Hình 3.3 Hình ảnh cảm biến sau khi được hàn và đóng gói 52 36 Hình 3.4 Cảm biến giao tiếp với bản mạch chính thông qua 53 socket 37 Hình 3.4 Sơ đồ chân cảm biến miễn dịch đa kênh 53 38 Hình 3.5 Tín hiệu đưa vào cảm biến miễn dịch 100 mV, 50 54 kHz x 39 Hình 3.6 Khối phát tín hiệu cho cảm biến đa kênh 55 40 Hình 3.7 Khối nguồn nuôi cho bảng mạch chính 55 41 Hình 3.8 Khối tách sóng biên độ 56 42 Hình 3.9 Tín hiệu VHaft sau khi ra từ khối tách sóng biên độ 56 43 Hình 3.10 Hình ảnh khối xử lý, giao tiếp USB, RS-232 58 44 Hình 3.11 Bản mạch chính của thiết bị đo đa kênh 59 45 Hình 3.12 Giao diện người sử dụng phần mềm BS 2.0 61 46 Hình 3.13 Giao diện thống kê số lần đo 62 47 Hình 3.14 Hình ảnh thiết bị phát hiện vi rút đa kênh ghép nối 64 máy tính 48 Hình 3.15 Kết quả đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 10µl 65 49 Hình 3.16 Kết quả đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 20µl 66 50 Hình 3.17 Đồ thị đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 10µl trên 68 phần mềm BS 2.0 51 Hình 3.18 Đồ thị đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 20µl trên phần mềm BS 2.0 68 -1- MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, sự phát triển của công nghệ vi điện tử và công nghệ sinh học đã góp phần to lớn vào vấn đề phát hiện sớm, nhanh và chữa khỏi một số bệnh lây nhiễm trong đời sống, sinh hoạt của con người, làm rõ hơn cơ chế sinh lý phức tạp trong cơ thể sống. Việc ứng dụng cảm biến sinh học và thiết bị đi kèm giúp chúng ta chẩn đoán xác định, điều trị bệnh một cách dễ dàng và nhanh chóng hơn, nghiên cứu và bào chế thuốc, kiểm tra chất lượng thức ăn hoặc xác định việc chuyển đổi gen trong động, thực vật, đặc biệt thời gian gần đây dịch bệnh do vi rút gây nên đối với sức khoẻ con người ngày càng gia tăng. Điều nguy hiểm là ở chỗ, chúng có khả năng biến chủng nhanh chóng. Khống chế và ngăn chặn kịp thời các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết không chỉ đối ngành y tế mà còn với tất cả các ngành nghề khác nhằm giảm thiểu nguy cơ liên quan tới sức khỏe và những thiệt hại về mặt kinh tế xã hội. Chính vì vậy, phát hiện nhanh, nhạy và sàng lọc mầm bệnh truyền nhiễm là mấu chốt để ngăn chặn quá trình lây nhiễm, có biện pháp cách ly hay điều trị kịp thời, khống chế và ngăn chặn dịch bệnh bùng phát. Có nhiều phương pháp đang được áp dụng tương đối rộng rãi trong phòng thí nghiệm để xác định các tác nhân gây bệnh như: phân lập; nuôi cấy; huyết thanh học; ELISA; PCR,... Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này thường mất hàng giờ tới hàng tuần để biết được kết quả. Đề tài “Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh ứng dụng cho cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn” được tác giả lựa chọn mục đích xác định nhanh vi rút H5N1 gây bệnh, có khả năng bổ trợ cho những phương pháp nghiên cứu xác định vi rút trước đây. Điều đặt biệt là thiết bị có thể xác định vi rút ở mọi nơi khi cần di chuyển hoặc ở tại các vùng sâu, vùng xa nơi thiếu cả điều kiện máy móc và nhân viên y tế cao cấp. Thiết bị đo đa kênh bao Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -2- gồm một bộ biến năng / chuyển đổi (transducer) đã được cố định các phần tử sinh học là kháng thể của vi rút H5N1, hệ mạch đo, phần mềm thu thập và xử lý số liệu. Hệ thống có thể hoạt động và chỉ thị kết quả độc lập hoặc ghép nối, điều khiển thông qua máy tính cá nhân. Luận văn này mô tả chi tiết quá trình phát triển mạch đo và xây dựng phần mềm. Luận văn gồm 3 chương: Chương 1. Tổng quan về cảm biến sinh học Trong chương này tác giả mô tả tổng quan về cấu tạo, nguyên lý hoạt động và phân loại cảm biến sinh học. Khái quát các phần tử cả nhận sinh học và kháng thể được cố định lên bề mặt cảm biến. Tóm tắt tổng thể các thiết bị đo ứng dụng cho cảm biến sinh học được nghiên cứu ứng dụng ở trong nước và trên thế giới trong những năm gần đây. Bênh cạnh đó, tác giả mô tả nội dung về nguyên lý và xử lý tín hiệu của hệ đo cho cảm biến miễn dịch đa kênh. Chương 2. Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh Chương 2 tập trung vào việc mô tả các quá trình thực nghiệm như: Nghiên cứu và cùng tham gia chế tạo, cố định chức năng hóa cho cảm biến miễn dịch đa kênh. Thiết kế, xây dựng quy trình đóng gói cho cảm biến đa kênh. Tạo bộ socket cho phép cảm biến giao tiếp với bản mạch chính xử lý tín hiệu của thiết bị. Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh và nâng cấp phần mềm thu thập, xử lý tín hiệu kết quả đo. Chương 3. Kết quả và thảo luận Trong chương này, bên cạnh những lập luận khoa học của kết quả thu thập được. Tác giả cũng đưa thêm vào những nhận xét, bàn luận làm cơ sở cho việc phát triển các luận văn sau. Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -3- Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC 1.1. Cảm biến sinh học 1.1.1. Cấu tạo, nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học Cấu tạo của cảm biến sinh học: Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng cung cấp những thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng, gồm 02 thành phần chính: Phần tử nhận biết sinh học và bộ chuyển đổi tín hiệu [15]. Phần tử nhận biết thực chất là các lượng chất sinh học hoặc các thực thể sinh học, hoạt động như một yếu tố nhận biết, được liên kết với bộ chuyển đổi một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Phần tử sinh học được sử dụng chủ yếu là enzim, ADN, ARN, kháng thể [21]. Bộ chuyển đổi thực hiện nhiệm vụ chuyển đổi các tín hiệu không điện do các phản ứng hoá học sinh ra thành tín hiệu điện, quang, cơ, nhiệt [21]. Hình 1.1. Cấu tạo của cảm biến sinh học Nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học: Sự tương tác giữa phần tử cảm nhận sinh học và đối tượng phân tích sẽ làm thay đổi các tính chất sinh, hóa. Sự thay đổi này được nhận biết bằng bộ chuyển đổi của cảm biến và chuyển thành tín hiệu điện [3]. Mỗi phần tử nhận biết sinh học khác Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -4- nhau chỉ cho phép nhận biết được một loại đối tượng phân tích theo nguyên tắc khóa - chìa. Nếu không có đối tượng phân tích phù hợp với thành phần cảm nhận sinh học thì không có sự thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến hoặc chỉ đơn thuần là đóng góp các ồn trong quá trình đo. Chính vì vậy mà cảm biến sinh học có độ chọn lọc rất cao [17]. 1.1.2. Phân loại cảm biến sinh học Dựa trên những thành phần cảm nhận sinh học và phần tử chuyển đổi người ta phân loại ra loại các cảm biến sinh học khác nhau: Phân loại theo phần tử chuyển đổi: Dựa trên bộ phận chuyển đổi có thể chia cảm biến sinh học thành: Cảm biến quang trên cơ sở phép đo huỳnh quang [6], cảm biến cơ dựa trên cơ sở thay đổi khối lượng ở bề mặt cảm biến sẽ làm thay đổi tần số trong vi cân của tinh thể thạch anh [16], chuyển đổi điện hóa [21], hiệu ứng trường nhạy ion, bộ chuyển đổi nhiệt và bộ chuyển đổi từ [2]. Cảm biến ADN quang học dựa trên cộng hưởng Plasma bề mặt: Loại cảm biến này không đòi hỏi phải đánh dấu chuỗi ADN, kết quả của phép đo được hiển thị ngay trong quá trình đo [17]. Hệ thống này dựa trên sự thay đổi góc cộng hưởng của ánh sáng phản xạ ở bề mặt cảm biến, khi có sự lai hóa của chuỗi ADN dò và ADN đích trong dung dịch. Sự thay đổi phần tử cảm nhận sinh học do lai hóa ADN sẽ tương ứng với sự thay đổi khối lượng phân tử trên bề mặt cảm biến. Loại cảm biến này được sử dụng trong việc xác định đột biến gen [4], nghiên cứu tương tác kháng thể - kháng nguyên trong lúa mì [7], phân tích trong quá trình bào chế thuốc [9]. Cảm biến có bộ chuyển đổi cơ học trên cơ sở vi cân tinh thể thạch anh: Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -5- Cảm biến vi cân tinh thể thạch anh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó việc sử dụng vật liệu này làm bộ chuyển đổi tín hiệu trong cảm biến sinh học nhằm ứng dụng trong lĩnh vực y, sinh học để xác định các loại vi rút, vi khuẩn gây bệnh. Ưu điểm của loại cảm biến này là có độ nhạy rất cao, khả năng đo sự thay đổi khối lượng ở mức nanogam, quá trình xác định không cần đánh dấu, kết quả có thể định tính hoặc định lượng. Nhược điểm của loại cảm biến này là hoạt động ở tần số cao, đóng góp ồn của môi trường làm ảnh hưởng tới quá trình xử lý tín hiệu [5]. Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hoá: Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hoá có cấu trúc đơn giản, quá trình nhận biết không phức tạp do những phản ứng điện hoá sẽ cho tín hiệu điện trực tiếp, độ nhạy tương đối cao, thời gian đáp ứng nhanh, kích thước nhỏ, thích hợp cho việc xác định nhanh các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm bệnh [11], hoặc ứng dụng để kiểm tra môi trường... Để nhận biết sự phản ứng của phần tử sinh học với chất cần phân tích, bề mặt cảm biến phải được cố định kháng thể, enzim, chuỗi ADN dò, sau đó đưa vào dung dịch mẫu cần phân tích tương ứng như kháng nguyên, cơ chất, ADN đích. Khi có phản ứng kháng nguyên - kháng thể, lai hóa ADN, phản ứng ức chế enzim, xẩy ra sẽ làm thay đổi độ dẫn giữa các điện cực, gây lên thay đổi điện áp ở đầu ra [21]. Cảm biến sinh học dựa trên bóng bán dẫn nhạy ion hiệu ứng trường ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor): Bóng bán dẫn nhạy ion hiệu ứng trường là một loại điện cực được sử dụng để thay thế các điện cực thuỷ tinh đo pH hoặc nồng độ ion trong kim loại. Loại linh kiện này được cải tiến từ MOSFET (Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor) với sự thay thế của lớp oxít cực cổng bằng một lớp màng nhạy hoá học Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -6- và một điện cực chuẩn. Nếu phủ một lớp màng cảm nhận sinh học lên cực cổng của ISFET, nó trở thành cảm biến sinh học. Các loại cảm biến này được phủ bởi màng enzim lên cực cổng nhạy ion của ISFET, sự đáp ứng tín hiệu ra được xác định bằng sự thay đổi điện áp trong kênh dẫn. Loại cảm biến này có kích thước nhỏ, độ nhạy cao [2]. Phép đo dòng Hiển thị Keithley4200 1. 2. 3. Hộp tấm chắn Cảm biến ISFET Hệ đo cảm biến Hình 1.2. Cấu tạo của cảm biến (A) và hệ đo (B) ISFET Cảm biến sinh học trên cơ sở vi điện cực độ dẫn: Cảm biến vi điện cực độ dẫn đã được sử dụng phổ biến với những ưu điểm vượt trội như: giá thành thấp, cấu trúc đơn giản, độ ổn định cao, tin cậy khi làm việc, phân tích nhanh và dễ dàng trên cơ sở phép đo độ dẫn, quy trình chế tạo đơn giản. Đây là loại cảm biến dựa trên sự thay đổi độ dẫn điện ở lân cận bề mặt cảm biến Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -7- khi có sự thay đổi về tính chất vật lý, hóa học hoặc sinh học trong dung dịch phân tích. Khi đó, sẽ làm thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến. Cảm biến vi điện cực có nhiều cấu hình, kích thước khác nhau. Chúng có thể được chế tạo bằng cách sử dụng dây kim loại hoặc các bon làm điện cực trong một ống thuỷ tinh. Hiện nay vi điện cực được ứng dụng dùng làm cảm biến sinh học là những vi điện cực có dạng hình tròn và đặc biệt là các vi điện cực Planar có cấu trúc dạng răng lược đan xen hoặc cấu trúc mảng [21]. Quy trình chế tạo loại cảm biến này được tác giả trình bày chi tiết trong chương 2 của luận văn. 5mm 5mm Hình 1.3. Cấu tạo của cảm biến vi điện cực Cũng như các loại cảm biến sinh học khác, để xác định kháng nguyên, trên bề mặt cảm biến miễn dịch dựa trên vi điện cực độ dẫn cần được cố định kháng thể. Quá trình xảy ra phản ứng kháng nguyên - kháng thể (phản ứng miễn dịch) sẽ gây lên sự thay đổi độ dẫn trên bề mặt cảm biến và làm thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến. Những loại cảm biến này thường được ứng dụng để xác định loại khuẩn Salmonella - một loại khuẩn gây nhiễm độc trong sữa với thời gian nhanh gấp nhiều lần so với các phương pháp xác định khác [8], xác định vi rút viên gam C [16], xác định vi rút gây bệnh H5N1 [21]. Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -8- Phân loại theo thành phần cảm nhận sinh học: Thực tế có khá nhiều phần tử sinh học được sử dụng làm thành phần cảm nhận sinh học. Tuy nhiên các chất thường được sử dụng trong các công trình và sản phẩm là: ADN, ARN, kháng thể, enzim. Phần tử cảm nhận là chuỗi ADN: Cấu trúc, tính chất của các ADN được trình bày chi tiết trong [21]. Có nhiều phương pháp để cố định ADN lên bề mặt cảm biến nhưng phương pháp cố định ADN dò lên bề mặt cảm biến sử dụng APTS và ống nanocacbon là được sử dụng phổ biến và có nhiều ưu điểm [21]. Quy trình cố định ban đầu cảm biến được xử lý sạch bề mặt để tẩy bỏ chất bẩn và ion kim loại gây lên khi chế tạo và đóng gói cảm biến, tiếp đó hydrát hoá bề mặt cảm biến bằng CH3OH/HCl tỷ lệ 1:1, Phủ APTS và cố định ADN dò lên bề mặt cảm biến dung dịch APTS/C2H5OH tỷ lệ 3:7 cùng với đó là quá trình hoạt hóa chuỗi ADN bằng EDC và MIA, phủ ADN hoạt hóa lên bề mặt cảm biến và đem ủ ở 37 0C trong 18 giờ [19]. Khi trong mẫu cần xác định có ADN đích sẽ có sự lai hóa ADN dò và ADN đích làm cho mật độ điện tích trên bề mặt cảm biến tăng lên khi đó độ dẫn của điện cực làm việc sẽ tăng hơn so với điện cực chuẩn. Đây là cơ sở để nhận biết quá trình làm việc của cảm biến ADN. Phần tử cảm nhận là enzim: Đối với cảm biến cố định bằng màng enzim thường được ứng dụng trong quan trắc môi trường và công nghệ thực phẩm. Trước khi cố định, bề mặt cảm biến được làm sạch bằng dung dịch K2Cr2O7 trong H2SO4 98% sau đó cho enzim lên bề mặt vi điện cực của cảm biến. Chức năng hóa bề mặt cảm biến để xác định nồng độ thuốc trừ sâu trong nước, điện cực cố định enzim được phủ 1mg AcChE (AcetylCholinesterase) và 1mg BSA (Bovine Serum Albumin) trộn với dung dịch đệm KH2PO4 20 mM, pH = 7,5 và 10% Glycerol. Điện cực chuẩn được phủ hỗn hợp Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009 -9- 2mg BSA với 10 µl chất đệm KH2PO4 20 mM, pH = 7,5 với 10% Glycerol. Khi có nồng độ thuốc trừ sâu - carbonsulfan C20H32N2O3S trong nước làm cho Acetylcholinesrase phân tách thành acetic và choline khi đó proton sinh ra là nguyên nhân làm thay đổi độ dẫn, lúc này độ dẫn trên màng enzim của điện cực làm việc giảm so với điện cực chuẩn và tạo sự chênh lệnh tín hiệu điện trên đầu ra của cảm biến [23]. Phần tử cảm nhận là kháng thể: Kháng thể bản chất là một loại glycoprotein do kháng nguyên kích thích tạo ra và có thể kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên ấy. Kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là Ig vì khi chạy điện di miễn dịch thì kháng thể nằm ở vùng globulin [20]. Cấu trúc của kháng thể là một phần tử đối xứng, cấu tạo bởi 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ giống nhau đôi một. Chuỗi nhẹ L (light): Mỗi chuỗi nhẹ là một chuỗi polypeptid cấu tạo khoảng 214 axit amin, được đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành 2 vùng. Vùng định hằng C (constant) nằm ở sau, có loại và trình tự axit amin không thay đổi, vùng thay đổi V (variable) nằm ở phía trước có loại và trình tự axit amin thay đổi tùy theo từng loại kháng thể. Có hai chuỗi nhẹ chuỗi kappa và chuỗi lamda. Chuỗi nặng H (heavy): Có cấu tạo tương tự như chuỗi nhẹ, chuỗi polypeptid gồm 440 axit amin, đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành 3 hoặc 4 vùng tùy theo từng chuỗi nặng. Vùng C gồm CH1, CH2, CH3, CH4, vùng V và vùng siêu biến. Có 5 loại chuỗi nặng khác nhau: Chuỗi gamma, chuỗi alpha, chuỗi muy, chuỗi delta, chuỗi epsilon [18]. Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009