Tài liệu Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2019 Tác giả luận án Lê Quốc Việt ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân và PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn tác giả Hoàng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo và Bùi Trần Anh Đào đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Quốc Việt iii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... ii Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii Mục lục ............................................................................................................................. iv Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vii Danh mục bảng ............................................................................................................... viii Danh mục hình .................................................................................................................. ix Trích yếu luận án .............................................................................................................. xi Thesis abstract................................................................................................................. xiii Phần 1. Mở đầu ................................................................................................................ 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .............................................................................. 3 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................. 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................... 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................................... 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 4 2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ............................................................................ 4 2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên thế giới ................................................................................................................... 4 2.2. Một số đặc tính của liên cầu khuẩn lợn ................................................................. 7 2.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................. 8 2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa ................................................................................ 9 2.2.3. Sức đề kháng ........................................................................................................ 10 2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................................................ 11 2.2.5. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 13 2.3. Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do vi khuẩn S. Suis gây ra ........................... 14 2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn .................................. 14 2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người .............................. 16 2.4. Chẩn đoán ............................................................................................................ 17 iv 2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR ..................................................................... 18 2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA ................................................................. 19 2.5. Điều trị ................................................................................................................ 19 2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh ............................................................................ 19 2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh ............................................................................ 20 2.6. Giới thiệu về hạt nano vàng và kỹ thuật sắc ký miễn dịch .................................. 20 2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng ................................................................................ 20 2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch.................................................................................... 20 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................. 26 3.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 26 3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................ 26 3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 ..................... 26 3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2 ........... 27 3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2 ............ 27 3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ............................................................................................................ 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 27 3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 .................. 27 3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2 ............................ 33 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 37 3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 38 3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................................. 40 Phần 4. Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 41 4.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 2 ........................... 41 4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ ................................... 41 4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 ....... 44 4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2 .......................................... 55 4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S. Suis type 2 ................ 57 4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên .................................... 57 v 4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp ứng miễn dịch ở chuột SA .......................................................................................... 60 4.2.3. Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả năng sinh miễn dịch của chuột SA .............................................................................................................. 63 4.2.4. Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2 ................ 66 4.2.5. Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế ............................................................ 71 4.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S. Suis type 2 ........... 72 4.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano ............................................................................................................. 72 4.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng S. suis type 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano ...................................................................................................................... 74 4.3.3. Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp .................................................................... 77 4.4. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 79 4.4.1. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp............................... 79 4.4.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT .............................................. 81 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ....................................................................................... 87 5.1. Kết luận ................................................................................................................ 87 5.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 88 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án ........................................... 89 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 90 Phụ lục ........................................................................................................................... 103 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải 6PGD : 6-phosphogluconate-dehydrogenase ADN : Acid deoxyribo nucleic ARN : Axit ribonucleic Bp : Base pair dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate E. coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay/ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ICT : Immunochromatographic test/ Kỹ thuật sắc ký miễn dịch IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobase kDa : Kilodalton NC : Nitrocellulose PBS : Phosphat Buffer Saline PCR : Polymerase Chain Reaction/ phản ứng khuếch đại gene S. suis : Streptococcus suis SDS : Sodium dodecyl sulfate X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto- pyranoside vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1. Thành phần phản ứng PCR phát hiện S. suis type 2 .......................................... 29 3.2. Chu trình nhiệt cho PCR phát hiện mẫu dương tính .......................................... 29 3.3. Thành phần PCR nhân đoạn gene 6PGD ........................................................... 30 3.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gene 6PGD ................................................ 31 3.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tạo dòng ......................... 31 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch ............................................................................................................ 34 3.7. Bố trí thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch .............. 34 3.8. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh ............................. 39 4.1. Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 ở lợn tại một số lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế ........................................................................................................... 42 4.2. Kết quả sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2 ....................................................... 50 4.3. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng TTHSS2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng SC 19 trên ngân hàng gene ...................................................................................................54 4.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên .......................... 58 4.5. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA ............................................................................................................. 61 4.6. Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA..................... 64 4.7. Kết quả chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 ................................................. 67 4.8. Kết quả phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 ở các nồng độ kháng thể bắt khác nhau ........................................................................................................... 81 4.9. Ngưỡng phát hiện của KIT phát hiện nhanh vi khuẩn S. suis type 2 ................... 83 4.10. Đánh giá độ đặc hiệu của KIT ........................................................................... 85 4.11. Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT ............................................ 86 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis.................................................................. 8 2.2. Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh ............................................................................ 22 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh ....................................................... 24 3.1. Cấu trúc vector pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega) .............................. 32 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2 .................................... 42 4.2. Kết quả phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis trên môi trường thạch máu cừu 5% ................................................................................................................. 44 4.3. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc ......................... 45 4.4. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn ...................... 46 4.5. Kết quả kiểm tra Streptococcus spp trên môi trường Bile Esculin agar .............. 47 4.6. Kết quả lên men đường glucose và lactose của vi khuẩn S. suis ......................... 48 4.7. Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn ......................................................... 48 4.8. Kiểm tra khả năng sinh indol của vi khuẩn S. suis............................................... 49 4.9. Kết quả PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 ................................................. 50 4.10. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2 ..................................... 51 4.11. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli Top 10 ............... 52 4.12. Kết quả PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng và kết quả các khuẩn lạc trắng PCR cùng cặp mồi M13 ............................................................. 53 4.13. So sánh mức độ tương đồng của amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD của chủng TTHSS2 và đoạn gene đã được công bố WP_012028448.1 .............. 54 4.14. Kết quả cấy vi khuẩn TTHSS2 bất hoạt cấy trên môi trường thạch máu cừu 5% ................................................................................................................. 56 4.15. Kết quả đánh giá tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2 ................................. 59 4.16. So sánh đáp ứng chuột khi được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 với các liều khác nhau ...................................................................................................... 62 4.17. Đáp ứng miễn dịch của chuột được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 phối trộn với các chất bổ trợ khác nhau ....................................................................... 65 4.18. Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng thể đã tinh sạch ............................................................................................................... 68 ix 4.19. Kết quả xác định nồng độ protein kháng thể bằng Pierce BCA Protein Assay Kit .............................................................................................................. 69 4.20. Đồ thị đường chuẩn BSA ..................................................................................... 69 4.21. Kết quả xác định nồng độ kháng thể sau tinh sạch .............................................. 70 4.22. Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch .................................. 71 4.23. Kết quả xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano ................................................................................................. 72 4.24. Kết quả xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp ....................................... 73 4.25. Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn vàohạt vàng nano ........... 75 4.26. Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn với dung dịch gold colloid................................................................................................................... 75 4.27. Kết quả sản xuất kháng thể cộng hợp .................................................................. 78 4.28. Kết quả chế tạo đệm conjugate kháng thể (conjugate pad) .................................. 78 4.29. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp .............................................. 80 4.30. Kết quả xác định độ nhạy của Kit ........................................................................ 83 4.31. Kết quả xác định độ đặc hiệu của Kit .................................................................. 85 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Lê Quốc Việt Tên Luận án: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2 (streptococcosis) ở lợn. Phương pháp nghiên cứu Để nghiên cứu các nội dung: nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2; Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2; Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2 và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 (S. suis type 2). Luận án sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 để xác định tình hình nhiễm vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn khỏe tại một số địa điểm giết mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Vi khuẩn S. suis type 2 thuần chủng được phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch máu cừu 5%, định danh bằng các phản ứng sinh hóa và phương pháp PCR với cặp mồi CPS2. Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 phân lập được được xác định dựa trên gene bảo thủ 6PGD bằng phương pháp PCR và tạo dòng gene trong vector pGem T easy. Vi khuẩn S. suis type 2 thuần được bất hoạt để chế tạo kháng nguyên thô bằng dung dịch formaldehyte 1%. Kháng thể kháng S. suis type 2 được chế tạo bằng phương pháp tiêm kháng nguyên và chất bổ trợ vào phúc mạc của chuột nhắt trắng Swiss abino. Kháng thể kháng S. suis type 2 thu từ huyết thanh chuột được tinh sạch bằng KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad). KIT phát hiện nhanh vi khuẩn được chế tạo dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch với kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng dung dịch gold colloid (DCN, 40nm) kết hợp với kháng thể kháng S. suis type 2. Kháng thể kháng S. suis type 2 và kháng thể dê kháng chuột được phun lên màng nitrocellulose ở đường kiểm tra và đường đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003. xi Kết quả chính và kết luận Với kết quả PCR, kết quả xác định vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn khỏe tại Thừa thiên Huế cho thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00%. Kết quả xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn S. suis type 2 dựa trên gene bảo thủ 6PGD cho thấy đoạn gen 6PGD phân lập được có độ dài 1428 bp và có độ tương đồng 99% với gen 6PGD đã được công bố (gb|CP000407.1|). Chủng vi khuẩn S. suis type 2, đặt tên là TTHSS2 được bất hoạt bằng dung dịch formaldehyte 1% để chế tạo kháng nguyên. Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng nguyên TTHSS2 có tính sinh miễn dịch cao, lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch ở chuột nhắt trắng swiss abino là 1,5x108CFU/chuột và chất bổ trợ thích hợp là Freund với liều tiêm là 400 µl/chuột (200 µl kháng nguyên+ 200 µl chất bổ trợ). Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy kháng thể kháng S. suis type 2 có nồng độ và độ tinh sạch cao. Hàm lượng kháng thể thu được cao nhất là 2000 µg/ml và thấp nhất là 100 µg/ml. Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch cho thấy, hiệu giá các mẫu kháng thể kháng vi khuẩn S. suis type 2 (nồng độ 1000 µg/ml, pha loãng ban đầu 10 lần) tương đối đồng đều, dao động từ 7log2 đến 8log2. Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp cho thấy pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano pH 8.0 và nồng độ kháng thể thích hợp là 360 µg/µl. Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp phun lên màng nitrocellulose là 2000 µg/ml. Nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu KIT có thể phát hiện là 5x 106 CFU/ml (5x 105 CFU trong 100 µl mẫu). KIT có độ đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các loài E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và các chủng liên cầu không phải type 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT lần lượt là 93,33% và 100,00% khi được so sánh với phương pháp PCR. xii THESIS ABSTRACT PhD candidate: Le Quoc Viet Thesis title: Development of rapid KIT for identification of Streptococcus suis type 2 in pig. Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 9.64.01.02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Manufacture KIT for rapid detection Streptococcus suis type 2 in pig. Materials and Methods The dissertation focuses on the following subjects: Production of Streptococcus suis type 2 antigen; Production of Streptococcus suis type 2 (S. suis type 2) specific antibody; Development conjugate-antibody against S. suis type 2 and evaluation its sensitivity, specificity of rapid diagnosis KIT for S. suis type 2. In order to perform above subjects, PCR method using CPS2 specific primers was carried out to determine the prevalence of S. suis type 2 infection in healthy pigs in some slaughter sites in Thua Thien Hue. S. suis type 2 was isolated by culture on 5% sheep blood agar, biochemical properties were characterized and PCR assay was performed using CPS2 primer. Molecular identification of S. suis type 2 isolates was determined base on highly conserved 6PGD gene by PCR and gene was cloned in the pGem-T easy vector. S. suis type 2 was inactivated to produce crude antigen with 1% formaldehyde solution. S. suis type 2 antibodies were prepared by injection of antigen plus adjuvant to the peritoneal mucosa of the Swiss abino mice. Antibody against S. suis type 2 in serum mice was purified by KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad). S. suis type 2 rapid detection KIT was developed through immuno-affinity chromatography with conjugate-antibody created from a gold colloid solution (DCN, 40nm) supplemented S. suis type 2 antibodies. S. suis type 2 antibodies and Anti-Mouse IgG antibody produced in goat were sprayed onto the nitrocellulose membrane in the test line and control line by Biodot XYZ3060D0003 instrument. xiii Main findings and conclusions PCR results showed that the prevalence of S. suis type 2 infection in healthy pigs collected at slaughterhouse in Thua Thien Hue were 9,00% (13.33%, 7,50% and 6,67% from Bach Yen, Bai Dau and Xuan Phu laughterhouse, respectively). Results on determination the molecular identification of S. suis type 2 isolated based on 6PGD gene showed that that the 6PGD gene was 1428 bp long and had 99% similarity with the 6PGD gene on GenBank database (gb |CP000407.1|). The S. suis type 2 strain, named TTHSS2, was inactivated with a 1% formaldehyde solution to produce antigen. The results showed that the antigen had highly immunogenicity. Appropriate amount of antigen and adjuvant for hyperimunity in swiss abino mice was 1,5x108 CFU/mice and Freund with injection dose of 400 μl/mice (200 μl antigen + 200 μl adjuvant). SDS-PAGE showed that S. suis type 2 antibodies had high concentration and purity. The highest antibody concentration was 2000 μg / ml and the lowest was 100 μg/ml. The ELISA analysis indicated that titers of purified S. suis type 2 antibodies (concentration 1000 μg/ml, initial dilution 10 times) was similar, ranged from 7log2 to 8log2. Conjugate-antibody production resulted in suitable pH of the gold colloid solution and S. suis type 2 antibody concentration for binding between S. suis type 2 antibodies and gold nano were 8.0 and 360 µg/ml. The appropriate conjugated antibodies concentration spray in nitrocellose membrane was 2000 μg/ml. Minimum bacterial concentrations in sample could be detected by KIT was 5x106 CFU/ml (5x105 CFU in 100 μl samples). The KIT had high sensitivity and specificity with no cross-reaction between E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Similar results were observed on other S. suis serotype. The sensitivity and specificity of the KIT were 93.33% and 100,00%, respectively in compared to PCR method. xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt lợn có thể gây nguy hiểm cho con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn. Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) gây ra. Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu. Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh. Trong đó, S. suis type 2 thường gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999). Vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà. Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn. Những loài động vật này mang mầm bệnh nhưng chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng mới gây nguy hiểm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Bệnh ở lợn biểu hiện bằng viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm nội tâm mạc và viêm khớp. Thông thường người bị nhiễm vi khuẩn do tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh, lợn chết hoặc ăn tiết canh lợn, thịt lợn bệnh, lợn chết chưa được nấu chín kỹ (Lê Văn Tạo, 2005). Con đường lây truyền từ lợn sang người có thể qua vết thương ở da, đường hô hấp, tiếp xúc với máu, các dịch tiết ở lợn bệnh hoặc qua đường ăn uống. Ruồi, gián, chuột là những động vật trung gia làm phát tán mầm bệnh (Vecht et al., 1992). Vi khuẩn liên cầu lợn gây ra hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc... Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời, người bệnh có thể tử vong. Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992). Thời gian ủ bệnh ngắn, từ vài giờ đến 3 ngày. Khi khởi phát, người bệnh có các triệu chứng như sốt cao có thể kèm theo rét run; mệt, đau mỏi người; đau đầu, buồn nôn và nôn, đau bụng, tiêu chảy; có thể mê sảng, ngủ gà, hôn mê. Những trường hợp nhiễm khuẩn huyết có thể xuất huyết dưới da, ban xuất huyết 1 hoại tử lan rộng ở mặt, ngực, chân, tay và đầu các chi (Arends and Zanen, 1988; Tan et al., 2008b). Các phương pháp chẩn đoán bệnh do liên cầu khuẩn lợn gây ra thường dùng là phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng, phương pháp PCR. Không dừng lại ở đó, việc ứng dụng và phát triển công nghệ ADN tái tổ hợp đã mở ra cho các nhà khoa học rất nhiều hướng đi trong việc tìm phương pháp chẩn đoán cũng như xây dựng các hệ thống phòng bệnh một cách hiệu quả hơn. Các vùng gene chỉ thị của S. suis type 2 được biểu hiện thành các protein tái tổ hợp. Tiếp theo đó, dựa trên cơ sở tính ưu việt của phản ứng miễn dịch là sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể để phát triển các phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các phương pháp ELISA, phương pháp dot blot đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán căn bệnh này ở các nước trên thế giới (Torremorell et al., 1997; Okwumabua and Chinnapapakkagari, 2005; Mandanici et al., 2010). Trong những năm gần đây, trên thế giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa trên phương pháp sắc kí miễn dịch (ICT). KIT có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, không cần phòng thí nghiệm, không cần thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người, động vật bị bệnh. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển KIT chẩn đó nhanh như Sheng et al. (2012) đã nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện khối u ở cá, Wang et al. (2014) với nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện kháng thể kháng giun tròn Paragonimiasis skrjabini. Tại Việt Nam, một số nhà nghiên cứu đã ứng dụng kĩ thuật ICT để chế tạo KIT phát hiện nhanh kháng nguyên và kháng thể như Đinh Thị Bích Lân và cs. (2009) với công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh phát hiện kháng thể kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii. Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2015) với công trình nghiên cứu KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4. Thế nhưng chưa có tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 ở người và động vật. Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 mang tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn. KIT chẩn đoán nhanh sẽ đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như kiểm soát tình trạng mang mầm bệnh ở gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu quả chăn nuôi. 2 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017. Địa điểm nghiên cứu: + Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế; + Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; + Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế. Mẫu vi khuẩn S. suis type 2 phân lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử. KIT chẩn đoán S. suis type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương tự với KIT chẩn đoán S. suis type 2 do Ju et al. (2010) đã công bố. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn S. suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S. suis type 2 trên lợn khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type 2 gây ra ở người và động vật. Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S. suis type 2 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sàng trên thực địa, từ đó cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type 2 từ lợn và các sản phẩm của lợn. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên thế giới 2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S. suis) gây nên, bệnh xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới và gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh liên cầu lợn cũng có thể lây cho người. Chính vì vậy nó được xếp vào nhóm các bệnh chung của người và động vật. Windsor and Elliott (1975) đã phân lập được chủng Streptococcus tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis type 2. Những chủng có phản ứng với huyết thanh của cả type 1 và 2 được gọi là type ½. S. suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi lợn như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006). Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus được phân lập. Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số type nhất định, từ 1 – 8. Mặc dù type 2 phân lập được ở hầu hết các nước nhưng tỷ lệ có sự sai khác giữa các vùng địa lý. Chẳng hạn, ở Canada tỷ lệ phân lập được S. suis type 2 tương đối thấp (dưới 25%) (Higgins and Gottschalk, 2001). Ở Nhật, tỷ lệ phân lập S. suis type 2 cao nhất (28%) (Kataoka et al., 1993); ở Châu Âu thì tỷ lệ này thấp nhất tại các nước Pháp, Ý và Tây Ban Nha (Smith et al., 1999; Gottschalk et al., 2007). Bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn gây ra ở người với 2 trường hợp viêm màng não và 1 trường hợp nhiễm trùng nặng đến mức tử vong đã được mô tả lần đầu tiên tại Đan Mạch (Perch et al., 1968). Sau đó, bệnh do vi khuẩn này dần được báo cáo tại Hà Lan, Anh và nhiều nước khác. Từ đó đến nay, vi khuẩn này đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới. Các trường hợp người mắc bệnh đã được thông báo ở các nước trên thế giới: Hà Lan, Đan Mạch, Đức, Bỉ, Anh, Pháp, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Úc, Hungari, Hồng Kông, Croatia, Nhật, Singapore, Đài Loan, New Zealand, 4 Argenetina, Trung Quốc… Trên thế giới đã phát hiện khoảng 490 ca bệnh liên cầu lợn ở người, trong đó tỷ lệ tử vong là 17,5% (Sihvonen et al., 1988; Touil et al., 1988). S. suis là vi sinh vật thường xuyên cư trú ở niêm mạc và các hốc tự nhiên của cơ thể lợn, đồng thời nó cũng được phân bố rất rộng rãi trong môi trường thiên nhiên, giữa vi khuẩn và động vật có trạng thái cân bằng (Wei et al., 2009). Theo Perch et al. (1983), vi khuẩn Streptococcus suis xâm nhập vào các đàn mới bởi các lợn khỏe mang mầm bệnh trong amidan hay trong đường mũi. Lợn khỏe có thể bị bệnh viêm màng não sau vài tháng đã mang mầm bệnh trong amidan. Việc nhập các lợn khỏe mang mầm bệnh (lợn cái giống, lợn đực giống và lợn cai sữa) hoặc lợn sinh ra ở những đàn mang bệnh lan truyền vi khuẩn S. suis cho lợn con. Lợn con mang mầm bệnh này khi phân vào chuồng nuôi sẽ gây nhiễm cho những lợn khác. S. suis ảnh hưởng tới lợn mọi lứa tuổi. Nhưng hầu hết các trường hợp xảy ra ở lợn đều nằm giữa 3-12 tuần tuổi và đặc biệt là sau khi lợn cai sữa được nhốt chung với nhau. Các nhà nghiên cứu Anh phát hiện thấy đàn lợn giống có thể mang S. suis trong amidan ít nhất 5-12 ngày. Vecht et al. (1985) đã nghiên cứu các phương thức thông thường làm lan truyền vi khuẩn S. suis giữa các đàn lợn là thông qua nhập lợn mang bệnh, vật môi giới và các xác chết mang vi khuẩn. S. suis sống trong ruồi ít nhất 5 ngày. Khi ruồi tiếp xúc với thức ăn, nước uống của lợn hay giữa các đàn lợn với nhau. Ruồi là môi giới truyền bệnh rất nguy hiểm. Theo Windsor (1977), ruồi tự bay xa và có thể bám trên các phương tiện “xe cộ” để đi xa nhiều hơn nữa, đó chính là điều kiện thuận lợi cho bệnh dịch lây lan. Trước những yếu tố gây lây lan mầm bệnh, biện pháp phòng bệnh bằng khâu vệ sinh chuồng trại chăn nuôi, chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn là yếu tố vô cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn (Vasconcelos et al., 1994). Do tính chất nghiêm trọng của bệnh, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh do liên cầu lợn gây ra. Với công trình nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên bề mặt của liên cầu lợn type 2 vào năm 2008. Tan et al. (2009) đã nghiên cứu thành công vắc xin phòng chống liên cầu lợn type 2 gây bệnh ở lợn. Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi 5 khuẩn S. suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004). Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu phát hiện nhanh kháng thể kháng kháng S. suis type 2, Yang et al. (2007), đã phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) với nguồn nguyên liệu điều chế kháng thể kháng S. suis type 2 là lớp vỏ polysaccharide của vi khuẩn. KIT phát hiện nhanh kháng thể kháng S. suis type 2 có độ nhạy và độ đặc hiệu là 97,1% và 86,3% khi so với phương pháp ELISA. Cũng với mục đích phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 gây bệnh ở lợn, Ju et al. (2010) đã thành công trong việc chế tạo KIT chẩn đoán nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch. Hiện nay, đã có một số tác giả trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp, vắc xin thô để phòng bệnh liên cầu khuẩn như: Li et al. (2006); Tan et al. (2009)... Tuy nhiên hiệu quả chưa được đánh giá đầy đủ. 2.1.1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước Trước khả năng gây bệnh nguy hiểm của vi khuẩn liên cầu lợn, nhiều nhà nghiên cứu Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu nơi cư trú của vi khuẩn, sự lưu hành hay khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Nguyễn Như Thanh và cs. (2001) đã xác định nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là đường tiêu hoá và sinh dục. Vi khuẩn S. suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi. Những lợn khỏe mạnh mang trùng này khi nhốt chung với một đàn lợn mới chưa bị bệnh, có thể bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn con qua đường hô hấp, từ đó truyền cho những con khác lúc nhập đàn hay cai sữa. Trong nghiên cứu biện pháp phòng bệnh do S. suis Phạm Sĩ Lăng và cs. (2002) đã chỉ ra rằng, để phòng bệnh, việc xác định và loại thải những lợn nái mang bệnh hoặc chia đàn, phân ô chuồng của một trang trại là rất cần thiết. Cần chia lợn cai sữa thành các ô chuồng nhỏ để đạt được độ tăng trưởng tối đa của chúng. Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh bằng cách giảm mật độ và nuôi trong các ô chuồng sạch sẽ là điều kiện cần thiết và có hiệu quả. Nên định kỳ di chuyển lợn ở các ô chuồng nuôi, kết hợp với tẩy uế chuồng trại là rất cần thiết và vô cùng quan trọng trong công tác phòng chống bệnh. Trong biện pháp quản lý đàn phải hạn chế tối đa các tác động do mật độ quá đông và hệ thống thông gió kém. Chỉ số về sự thông gió và sự lưu thông không khí trong các ô chuồng phải thích hợp 6