Tài liệu Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng urease của vi khuẩn helicobacter pylori tt

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Helicobacter pylori (H. pylori) đã gây nhiễm hơn nửa dân số trên thế giới. Bệnh viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H. pylori trên thế giới chiếm 70 - 90% và ở Việt Nam chiếm cao hơn (83 – 100%). Enzyme urease của vi khuẩn H. pylori làm tăng dần pH ở bề mặt niêm mạc dạ dày từ thấp đến trung tính và quyết định sự tồn tại của H. pylori cũng như sự gây tổn thương ở niêm mạc dạ dày. Helicobacter pylori có khả năng đề kháng rất mạnh với những thuốc kháng sinh. Đối với bệnh lý viêm loét dạ dày và tá tràng do nhiễm H. pylori, Hội nghị Đồng thuận Maastricht III (2005) và VI (2010) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H. pylori tăng trên toàn cầu. Hiện nay, khả năng thất bại trong điều trị rất lớn chiếm 36% vì sự đề kháng thuốc kháng sinh ngày càng gia tăng. Trị liệu miễn dịch thụ động là liệu pháp sử dụng kháng thể để bất hoạt vi sinh vật và trung hòa độc tố. Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) được khám phá vào những năm cuối thế kỷ XVIII. IgY đã được sử dụng để gây miễn dịch thụ động phục vụ cho điều trị và phòng ngừa một số bệnh ở người và động vật. Từ các cơ sở lý luận và thực tiễn trên, nhằm tạo ra chế phẩm IgY kháng urease của H. pylori dùng để dự phòng và điều trị nhiễm H. pylori, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với ba mục tiêu: 1.Tách chiết urease của vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân viêm loét dạ dày – tá tràng. 2.Chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori. 3. Đánh giá khả năng dự phòng nhiễm Helicobacter pylori trên động vật thực nghiệm của IgY kháng urease. 2 2. Tính cấp thiết của đề tài - Viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H. pylori ở Việt Nam chiếm rất cao (83 – 100%) và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư dạ dày. Sự sinh tồn của vi khuẩn H. pylori ở dạ dày do enzyme urease của chúng quyết định và cũng chính enzyme urease góp phần gây tổn thương dạ dày. - Sự đề kháng thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H. pylori ngày càng gia tăng trên toàn thế giới chiếm 36%. - Sử dụng chế phẩm kháng thể IgY kháng enzyme urease của vi khuẩn H. pylori được tách chiết từ lòng đỏ trứng gà sau gây nhiễm vi khuẩn H. pylori cho gà mái để phá hủy phân tử đích urease, giảm nồng độ vi khuẩn H. pylori và giảm mức độ tổn thương dạ dày. 3. Những đóng góp mới của luận án - Sản xuất thành công chế phẩm IgY kháng enzyme urease của vi khuẩn H. pylori ở Việt Nam để dự phòng nhiễm vi khuẩn H. pylori. - Định hướng nghiên cứu phát triển thực phẩm chức năng chứa IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori dùng để dự phòng và hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày tá tràng dương tính với H. pylori. 4. Bố cục của luận án Luận án dài 115 trang bao gồm: Đặt vấn đề: 2 trang, Chương 1 Tổng quan: 29 trang, Chương 2 - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 20 trang, Chương 3 - Kết quả: 37 trang, Chương 4 - Bàn luận: 24 trang, Kết luận: 2 trang và Kiến nghị: 1 trang. Luận án có 15 bảng và 43 hình; 129 tài liệu tham khảo gồm 25 tài liệu tiếng Việt và 104 tài liệu tiếng Anh. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.VI KHUẨN Helicobacter pylori VÀ BỆNH VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, hình cong, xoắn nhẹ, dài 1,5 - 5µm, đường kính 0,3 - 1µm. Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 lông, đầu mút hình củ hành, nhờ đó H. pylori di chuyển được trong lớp nhầy của niêm mạc dạ dày bởi chuyển động xoắn [24], [34], [35], [36]. Enzyme urease được tiết ra từ H. pylori, là một trong những enzyme chủ yếu trong sinh bệnh học của H. pylori. Urease tạo nên một lớp đệm pH trung tính bao quanh H. pylori và quyết định sự sống còn của chúng trong môi trường pH dạ dày. Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày tá tràng liên quan đến H. pylori được thể hiện rõ nét qua phản ứng của cơ thể đối với H. pylori [52]. 1.2. KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA H. pylori Helicobacter pylori có khả năng đề kháng rất mạnh với những thuốc kháng sinh đưa vào điều trị cả trên in vitro và in vivo. Hội nghị Đồng thuận Maastricht III (2005) bàn luận về phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong điều trị tiệt trừ H. pylori trong bệnh viêm loét dạ dày và tá tràng với thời gian điều trị từ 7 – 14 ngày. Với phác đồ bộ ba này, tỉ lệ đề kháng thuốc ngày càng tăng [57]. Hội nghị Maastricht IV ở Florence (2010) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H. pylori tăng trên toàn cầu và thống nhất những phác đồ thích hợp dựa theo tình trạng kháng thuốc [22]. Riêng ở Việt Nam, vào những năm gần đây, tình hình đề kháng với các loại thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H. pylori như Clarithromycin, Amoxicillin, Metronidazole và Tetracycline trong bệnh viêm dạ dày mạn tính, loét 4 dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày ngày càng tăng: metronidazole (94,6 – 95,5%), amoxicillin (33,9 – 35,5%), tetracycline (17,78 21,4%) và clarithromycin (21,4 – 26,6%) [66], [67], [68], [69], [70]. 1.3. KHÁNG THỂ IgY 1.3.1. Cấu trúc và chức năng Cấu trúc IgY của gà cũng giống như cấu trúc IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-) [72], [74], [75]. Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản lề, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn. Vùng Fc của IgY gián tiếp quy định chức năng của nó như sự ngưng kết bổ thể và opsonin hóa các kháng nguyên. IgY không gắn vào các thụ thể Fc người và động vật có vú cũng như không hoạt hóa hệ thống bổ thể ở người và động vật có vú khác, đồng thời cũng không tương tác với yếu tố dạng thấp [72], [73], [75], [76], [78]. 1.3.2. Sự vận chuyển IgY từ gà mẹ sang gà con IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con trải qua 2 bước: (1) Bước 1: IgY chuyển từ máu vào lòng đỏ trứng, tương tự như quá trình vận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú; (2) Bước 2: Sự vận chuyển IgY từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trình phát triển. Lượng IgY được kết lại trong lòng đỏ trứng từ ngày thứ 7 trở đi cho đến ít nhất là ngày thứ 18. Trên noãn bào có các thụ thể ái lực cao và thấp dành cho IgY. IgY sẽ gắn kết với thụ thể của nó trên bề mặt noãn bào để chuyển từ máu gà mái sang trứng. Sau 3 đến 4 ngày kể từ khi IgY xuất hiện trong huyết thanh thì IgY cũng được tìm thấy trong lòng đỏ trứng [72], [74], [75], [76]. 1.3.3. Tính ổn định của IgY: Tính ổn định của IgY phụ thuộc vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH và enzyme protein. 5 1.4. IgY VÀ ỨNG DỤNG TRONG DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ IgY được sử dụng để gây miễn dịch thụ động phục vụ cho điều trị và phòng ngừa các bệnh ở người và động vật [84]. IgY cũng là nguồn trị liệu khác có thể thay thế cho kháng sinh khi mà các tác nhân gây bệnh đã đề kháng với thuốc kháng sinh [72], [81], [86], [87], [88]. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu sinh thiết Các mẫu sinh thiết niêm mạc hang vị qua nội soi dạ dày của 18 bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn và loét dạ dày tá tràng chưa được điều trị với thuốc kháng sinh hoặc thuốc điều trị dạ dày được cung cấp từ Phòng khám nội soi tiêu hóa, Bệnh viện 103, Học viện Quân y. 2.1.2. Động vật thí nghiệm 2.1.2.1. Gà mái: 12 gà mái giống Lương Phượng, cân nặng từ 1,9 đến 2,1kg ở độ tuổi sắp đẻ trứng và cùng lứa. 2.1.2.2. Chuột nhắt trắng: 28 con chuột nhắt trắng đực, dòng Swiss, cân nặng từ 16 - 18g, khoẻ mạnh. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên động vật. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.2.1. Phân lập vi khuẩn, nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease của H. pylori từ mẫu sinh thiết dạ dày - Mẫu bệnh phẩm sẽ được nuôi cấy trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar, được đặt trong túi ủ vi hiếu khí GENbag microear (BioMérieux, Pháp). Túi ủ được đặt trong tủ nuôi cấy vi sinh 37 oC. H. pylori phân lập được sẽ được nhuộm Gram và được định danh 6 bằng các phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase và urease [24]. - Sau nuôi cấy, chọn ba chủng H. pylori có hoạt tính urease mạnh nhất. Ba chủng này sẽ được tăng sinh trong môi trường Brucella broth (Neogen Corporation, Mỹ) trong tủ ủ lắc 37 oC (Suzuki và cs., 2004). Sau nuôi cấy tăng sinh, urease được tách chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50%. 2.2.2.2. Chế tạo IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori - Tạo kháng nguyên và gây miễn dịch cho gà mái được thực hiện dựa theo qui trình của các tác giả Schade R. và cs. (1996), Đỗ Minh Trung và cs. (2010), Hoàng Trung Kiên và cs. (2013). Urease thu được sau tách chiết tinh sạch từ dịch nuôi cấy của ba chủng H. pylori được phối trộn theo tỷ lệ 1:1:1 từ mỗi chủng, sau đó trộn với tá chất Freund theo tỷ lệ 1:1 về thể tích để tạo thành huyền dịch kháng nguyên gây miễn dịch cho ba lô gà mái bằng cách tiêm vào dưới da trước cơ ngực lớn theo qui trình tiêm 5 mũi nhắc lại: + Lô 1 (3 gà mái): nồng độ 250µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm. + Lô 2 (3 gà mái): nồng độ 500µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm. + Lô 3 (3 gà mái): nồng độ 750µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm Trước khi gây miễn dịch lần thứ nhất và 7 ngày sau khi gây miễn dịch các lần tiếp theo, tiến hành lấy máu tĩnh mạch cánh gà. - Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà: Thu hoạch trứng gà, đánh dấu số trứng gà, ngày đẻ trứng và bảo quản ở 4oC. IgY từ lòng đỏ trứng gà được tách chiết theo qui trình của Ko KY. và Ahn DU. (2007) và đã được chúng tôi cải tiến cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm: tủa lipid bằng nước cất, tủa ammonium sulfate 40% và sắc ký trao đổi ion [78], [109], [110]. - Đánh giá độ ổn định của IgY trong quá trình bảo quản: Sản phẩm IgY chế tạo được, được chia lô và bảo quản trong những điều 7 kiện khác nhau bao gồm nhiệt độ phòng, nhiệt độ 4C và -20ºC. Các mẫu được đánh giá kiểm tra bằng ELISA. 2.2.2.3. Đánh giá hiệu quả dự phòng nhiễm H. pylori của sản phẩm IgY kháng urease trên động vật thực nghiệm - Chuẩn bị thức ăn chứa IgY kháng urease của H. pylori: Thức ăn chứa IgY kháng urease được chuẩn bị bằng cách tẩm dung dịch protein lòng đỏ trứng gà chứa IgY kháng urease vào thức ăn đã hấp tiệt trùng và làm khô với tỷ lệ 4mg IgY/gam thức ăn theo phương pháp ước lượng nồng độ IgY trong lòng đỏ trứng của Nomura S. và cs. [95]. Sau đó, thức ăn được đựng vào các túi nilon bảo quản ở 4ºC. - Phân nhóm động vật nghiên cứu: 28 chuột nhắt trắng dòng Swiss trong nghiên cứu được sử dụng để kiểm tra độc tính của sản phẩm IgY và đánh giá hiệu quả dự phòng nhiễm H. pylori. + Để kiểm tra độc tính của sản phẩm IgY, 10 con chuột được chia thành 2 nhóm: nhóm 1 và nhóm 2, mỗi nhóm 5 con. Chuột nhóm 1 cho ăn thức ăn thường (không bổ sung IgY kháng urease của H. pylori) được sử dụng làm nhóm chứng sinh học và chuột nhóm 2 cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease của H. pylori được sử dụng để khảo sát độc tính của IgY. Hai nhóm chuột được nhận lúc 4 tuần tuổi. Khi chuột được 5 tuần tuổi (còn gọi là tuần 0). Cân nặng chuột của hai nhóm sẽ được xác định ở tuần thứ 2, tuần thứ 5 và tuần thứ 8 tính từ tuần 0. Các nhóm chuột tiếp tục được cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori hoặc không đến tuần thứ 8 khi chuột được 13 tuần tuổi. Sau đó, chuột được lấy máu và mổ lấy dạ dày để làm xét nghiệm. + Để đánh giá hiệu quả dự phòng nhiễm H. pylori của thức ăn tẩm IgY kháng urease, 18 con chuột được chia thành 2 nhóm: nhóm 3 và nhóm 4, mỗi nhóm 9 con. Chuột nhóm 3 và nhóm 4 được nhận lúc 8 4 tuần tuổi. Chuột nhóm 3 được cho ăn thức ăn thường (không bổ sung IgY kháng urease của H. pylori) được sử dụng để theo dõi sự nhiễm H. pylori và tác dụng gây tổn thương của chúng trên dạ dày chuột. Chuột nhóm 4 cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease của H. pylori trong một tuần được sử dụng để khảo sát tác dụng dự phòng nhiễm H. pylori của IgY kháng urease của H. pylori. Lúc chuột được 5 tuần tuổi (còn gọi là tuần 0), cả hai nhóm chuột sẽ được xác định cân nặng và sẽ được gây nhiễm H. pylori bằng cách bơm vi khuẩn vào dạ dày với liều 108 CFU/ml (15ml/kg cân nặng chuột). Sau gây nhiễm, các nhóm chuột tiếp tục được cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori hoặc không đến cuối tuần thứ 8. Cân nặng chuột của hai nhóm sẽ được xác định ở tuần thứ 2, tuần thứ 5 và tuần thứ 8 sau gây nhiễm. Kết thúc thí nghiệm ở tuần thứ 8 vào lúc chuột được 13 tuần tuổi. Tất cả chuột của nhóm 3 và nhóm 4 đều được lấy máu và mổ chuột lấy dạ dày để làm xét nghiệm. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS và số liệu được phân tích dựa trên các nguyên lý thống kê y học. Các chỉ số đưa ra trong quá trình phân tích bao gồm tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, 2, độ lệch chuẩn và giá trị p. 2.2.4. Đạo đức nghiên cứu Đây là nghiên cứu thực nghiệm trên các đối tượng gà mái và chuột nhắt trắng nhằm mục tiêu chế tạo các sản phẩm phục vụ cho mục đích điều trị bệnh ở người. Các đối tượng động vật thí nghiệm được chăm sóc trong điều kiện vệ sinh sạch sẽ, cung cấp thức ăn và nước uống dư thừa. Các thao tác lấy máu gà và chuột, gây miễn dịch cho gà, gây nhiễm vi khuẩn cho chuột, mổ và sinh thiết dạ dày chuột đều được thực hiện theo qui định chung cho động vật thí nghiệm. 9 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN H. pylori VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME UREASE CỦA VI KHUẨN 3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu bệnh phẩm cho phân lập H. pylori Sau khi nội soi sinh thiết, thu nhận được 18 mẫu bệnh phẩm qua nội soi dạ dày từ bệnh nhân với độ tuổi từ 19 đến 67 tuổi, trong đó có 5 nữ và 13 nam. Kết quả phát hiện được 2 trường hợp viêm dạ dày (11%), 11 trường hợp viêm dạ dày - tá tràng (61%) và 5 trường hợp viêm loét dạ dày - tá tràng (28%). 3.1.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn H. pylori Sau 5 ngày nuôi cấy, có 17/18 (94,5%) mẫu phân lập (trừ mẫu số 10) có vi khuẩn mọc. Với kết quả nhuộm Gram (-), có hình ảnh đặc thù của H. pylori và các phản ứng sinh hóa dương tính, đã định danh được 17 chủng vi khuẩn H. pylori từ HP01 đến HP18. 3.1.3. Đánh giá hoạt tính urease Hình 3.4. Kết quả đo OD phản ứng urease của các chủng H. pylori phân lập được Kết quả cường độ màu và đo OD cho thấy trong dịch nổi của 17 chủng vi khuẩn nghiên cứu, có 3 chủng vi khuẩn H. pylori (HP13, HP16 và HP18) cho hoạt tính cao hơn (Hình 3.4). 10 3.1.4. Kết quả tách chiết tinh sạch urease Trọng lượng của tiểu đơn vị này được xác định bằng cách lập đồ thị đường chuẩn biểu hiện sự tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng khi điện di (Hình 3.6). Dựa vào phương trình đường chuẩn y = - 0,371x + 5,117 với R 2 = 0,986 và d = 2,75cm, ln(M) là 4,09, từ đó thu được phân tử lượng được xác định là 60,3kDa tương ứng với tiểu phần UreB (Hình 3.7). Hình 3.6. Điện di đồ xác định phân tử lượng tiểu đơn vị của enzyme urease Hình 3.7. Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng 3.2. CHẾ TẠO IgY KHÁNG UREASE 3.2.1. Kết quả gây miễn dịch tạo IgY kháng urease của H. pylori - Phát hiện IgY đặc hiệu với urease của H. pylori trong máu gà: Sau lần gây miễn dịch thứ nhất đã có IgY đặc hiệu urease trong máu cả 3 lô gà. Hiệu giá kháng thể ở lô 3 đạt cao nhất từ mũi tiêm lần thứ 4 (32.000) và duy trì đến mũi tiêm lần thứ 5 (Hình 3.8). - Phát hiện IgY đặc hiệu với urease của H. pylori trong trứng gà: Các mẫu trứng thu được ở 3 lô gà sau gây miễn dịch lần thứ 5 đều cho phản ứng (+). Chứng tỏ IgY đặc hiệu với urease đã chuyển từ máu gà sang trứng và gây miễn dịch ở nồng độ 750µg/ml/lần tiêm cho hoạt tính kháng thể trong trứng mạnh nhất, tương đương với nồng độ IgY trong huyết tương gà cao nhất (Hình 3.9). 11 Hình 3.8. Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu urease của H. pylori trong máu gà trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm Hình 3.9. Hoạt tính IgY đặc hiệu urease của H. pylori trong lòng đỏ trứng gà được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm 3.2.2. Tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà - Phân tích và tinh sạch sản phẩm IgY bằng sắc ký trao đổi ion: Khảo sát về hoạt tính của IgY kháng urease của H. pylori cho thấy phân đoạn ở đỉnh 1 không có hoạt tính kháng thể, có thể đây là các protein tạp. Trong khi đó, phân đoạn ở đỉnh 2 có hoạt tính mạnh đối với urease của H. pylori tương ứng phần chứa IgY (Hình 3.10). 2 1 Hình 3.10. Sắc ký đồ trao đổi ion của sản phẩm sau kết tủa bằng ammonium sulphate 40% Hình 3.12. Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản phẩm sau mỗi bước tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà - Kết quả điện di SDS-PAGE sau các bước tách chiết và tinh sạch: Protein toàn phần từ lòng đỏ trứng gà sau tách bằng nước cất chứa rất nhiều protein tạp (giếng 2). Các protein này đã được loại bỏ lần lượt bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfate 40% (giếng 1) và sắc ký trao đổi ion (giếng 3). Sản phẩm thu được sau sắc ký trao đổi ion 12 được coi là tinh sạch nhất. Với kích thước khoảng 70kDa và 42kDa, phù hợp với kích thước chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của IgY, điều này có thể khẳng định sản phẩm thu được chính là IgY (Hình 3.12). - Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng: protein tổng số sau lọc với nước cất thu được rất lớn (1863,03mg) nhưng IgY sẽ có hoạt tính thấp do chứa nhiều protein tạp khác, trong khi đó hiệu suất thu hồi sau tủa ammonium sulfate là 10,84% và sắc ký trao đổi ion là 7,51%. Hiệu suất thấp nhưng hoạt tính của IgY mạnh, độ tinh sạch cao hơn. 3.2.3. Độ ổn định của chế phẩm IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau Ở nhiệt độ phòng, hoạt tính IgY giảm nhanh. IgY được bảo quản ở nhiệt độ 4ºC, kháng thể giữ được hoạt tính tốt nhất trong khoảng 2 3 tuần. Hoạt tính IgY được bảo quản ở -20ºC không thay đổi nhiều. 3.3. TÁC DỤNG DỰ PHÒNG NHIỄM H. pylori CỦA IgY KHÁNG UREASE TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 3.3.1. Xét nghiệm kháng thể kháng H. pylori trong máu chuột gây nhiễm vi khuẩn - Tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng H. pylori trong máu chuột gây nhiễm vi khuẩn: Chuột nhóm 3 có kết quả dương tính 9/9 (100%), trong khi chuột nhóm 4 có kết quả dương tính thấp hơn 6/9 (66,66%). p = 0.003 Hình 3.19. Hoạt độ kháng thể kháng H. pylori trong máu chuột gây nhiễm vi khuẩn không và có được dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease p = 0.004 Hình 3.21. Mức độ viêm dạ dày của chuột ở các nhóm gây nhiễm H. pylori có hoặc không được dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease 13 - Hoạt độ kháng thể kháng H. pylori trong máu chuột gây nhiễm vi khuẩn nhóm 4 thấp hơn nhóm 3. Sự khác biệt về hoạt độ kháng thể giữa 2 nhóm chuột có ý nghĩa thống kê (p = 0,003) (Hình 3.19). 3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ viêm niêm mạc dạ dày chuột - Tỷ lệ dạ dày chuột bị viêm sau gây nhiễm H. pylori: Chuột nhóm 3 có biểu hiện viêm dạ dày nặng nhất chiếm 100% (phần lớn là viêm (+++)), trong khi chuột nhóm 4 có biểu hiện viêm dạ dày nhẹ hơn (77,77%) và có 2/9 chuột cho kết quả viêm (-). - Mức độ viêm dạ dày của chuột gây nhiễm H. pylori nhóm 3 cao hơn nhóm 4. Sự khác biệt về mức độ viêm dạ dày giữa 2 nhóm chuột được ghi nhận là có ý nghĩa thống kê (p = 0,004) (Hình 3.21). 3.3.3. Kết quả đánh giá mật độ vi khuẩn dưới niêm mạc dạ dày - Tỷ lệ phát hiện có H. pylori dưới niêm mạc dạ dày chuột gây nhiễm H. pylori: Chuột không gây nhiễm (nhóm 1 và nhóm 2) không có sự hiện diện của vi khuẩn H. pylori, trong khi toàn bộ chuột gây nhiễm nhóm 3 đều có sự hiện diện H. pylori ở dưới niêm mạc dạ dày chuột. Riêng chuột nhóm 4 thì mật độ vi khuẩn ít hơn chiếm 44,44%. - Mật độ H. pylori dưới niêm mạc dạ dày chuột gây nhiễm nhóm 3 cao hơn nhóm 4. Sự khác biệt về mật độ H. pylori giữa 2 nhóm chuột (nhóm 3 và nhóm 4) có ý nghĩa thống kê (p  0,0001) (Hình 3.27). p < 0.0001 Hình 3.27. Mật độ H. pylori ở dạ dày chuột gây nhiễm H. pylori có hoặc không được dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease Hình 3.28. Tổn thương mô học dạ dày chuột N3-C1 (nhuộm Giemsa x200) 14 - Tổn thương mô học dạ dày chuột N3-C1: Chẩn đoán mô bệnh học: Viêm mạn teo nặng niêm mạc dạ dày, HP (++) (Hình 3.28). CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1. TÁCH CHIẾT UREASE CỦA Helicobacter pylori PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY – TÁ TRÀNG 4.1.1. Phân lập vi khuẩn Sở dĩ kết quả phân lập vi khuẩn đạt 94,5% cao hơn các tác giả trong nước (47 - 56,4%) [66] là do chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy chuyên biệt Pylori agar với điều kiện ủ thích hợp trong túi ủ GENbag microear ở 37oC dựa theo khuyến cáo của nhiều tác giả [8]. 4.1.2. Tách chiết urease của H. pylori Urease được tách chiết từ dịch nổi của ba chủng HP13, HP16 và HP18 có hoạt tính cao nhất trong 17 chủng vi khuẩn H. pylori phân lập được đã được chọn làm kháng nguyên để gây miễn dịch. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của một số tác giả đã công bố [107], [113]. Với mục đích tách chiết urease của vi khuẩn H. pylori để làm kháng nguyên gây miễn dịch, chúng tôi quan tâm nhiều đến việc xác định sản phẩm thu được có đúng là urease hay không, từ đó tiến hành xét nghiệm định tính hoạt tính urease kết hợp với điện di phân tích kích thước protein thu được để kết luận sản phẩm thu được và dùng để gây miễn dịch đó chính là urease của vi khuẩn H. pylori. Kết quả thể hiện trên băng điện di của 3 chủng vi khuẩn H. pylori cho thấy cũng chỉ có một vạch sáng nhất, tương đương nhau khoảng 60,3kDa và tương ứng về lý thuyết với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân tử urease (60,3 - 64,3kDa) [7], [8], [47], [114]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về urease, tuy nhiên nghiên cứu chỉ 15 tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật, còn nghiên cứu từ H. pylori thì chưa thấy công trình nghiên cứu nào công bố [115], [116]. 4.2. CHẾ TẠO IgY KHÁNG UREASE CỦA Helicobacter pylori 4.2.1. Kết quả gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu với urease H. pylori 4.2.1.1. Chế tạo kháng nguyên urease từ vi khuẩn H. pylori Dựa trên đặc điểm của H. pylori, H. pylori chỉ sinh sống được tốt trong môi trường trung tính mà môi trường trung tính này có được là nhờ urease. Vì vậy việc ức chế được urease đồng nghĩa với việc có thể ức chế được H. pylori. Do đó, trong nghiên cứu này đã lựa chọn urease làm đối tượng tách chiết sử dụng làm kháng nguyên và đây cũng là phương cách đã được thực hiện bởi các nhà nghiên cứu trước đây trên thế giới [79], [105], [106], [107], [108]. 4.2.1.2. Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà Loài gà mái giống Lương Phượng chuyên đẻ trứng được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu để gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu theo cách chọn đối tượng nghiên cứu thuận tiện. Sở dĩ nghiên cứu của chúng tôi chọn loài gà thuận tiện là do tính sinh miễn dịch của gà tương đối mạnh. Tuy nhiên do thời gian sinh kháng thể của gà nhanh và để tránh phải chờ đợi khi đã có kháng thể trong máu gà mà gà chưa đẻ trứng, cho nên chúng tôi cùng các tác giả khác chọn gà ở độ tuổi chuẩn bị hoặc bắt đầu đẻ trứng để gây miễn dịch [109], [117]. 4.2.1.3. Gây miễn dịch cho gà Nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn việc sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho mũi tiêm đầu, còn các mũi tiêm sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh, đây cũng là cách làm phổ biến cho hiệu quả kích thích miễn dịch sinh kháng thể mạnh ở gà mái. Kết quả thu được này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước của các tác giả khác 16 ở Học viện Quân y đã công bố trước đây trong việc tạo kháng thể kháng lại một số tác nhân gây bệnh như Pseudomonas aeruginosa, Edwardsila ictaluri [109], [117], [121], [122]. Mặc dù liều 750µg/ml/lần tiêm kích thích sinh kháng thể nhanh và mạnh hơn nhưng ở lô gà này không ghi nhận hiện tượng ức chế đẻ trứng của gà. Thêm vào đó, kháng nguyên trong nghiên cứu của chúng tôi là kháng nguyên protein có thể khác với kháng nguyên là vi khuẩn trong việc ức chế đẻ trứng của gà. Nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch trong đề tài này được chọn mức cao là 750µg/ml/lần tiêm, mặc dù thu được hiệu quả cao hơn so với hai nồng độ thấp hơn là 250µg/ml/lần tiêm và 500µg/ml/lần tiêm nhưng chưa phải là nồng độ tối ưu. Nhưng dẫu sao trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi cũng tạm ghi nhận nồng độ 750µg/ml/lần tiêm là liều tối ưu trong số ba liều tiêm đã được khảo sát. 4.2.1.4. Phát hiện IgY đặc hiệu Trong nghiên cứu này, hoạt tính IgY đặc hiệu urease của H. pylori thu được trong máu và trong trứng gà được khảo sát bằng ELISA. Kết quả nghiên cứu ở các Hình 3.8 và 3.9 bổ sung cho nhau đã cho thấy mặc dù kháng nguyên được dùng để gây miễn dịch là hỗn hợp kháng nguyên của 3 chủng vi khuẩn H. pylori (HP13, HP16 và HP18). Điều này cho thấy, hệ thống miễn dịch của gà đã nhận diện được urease của H. pylori để sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại. 4.2.2. Chế tạo chế phẩm IgY kháng urease của H. pylori 4.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà Hiệu suất thu hồi protein tổng số trong đó có chứa IgY qua các bước có sự khác biệt lớn. Sản phẩm thu được sau tủa với muối ammonium sulfate và sắc ký trao đổi ion với số lượng kháng thể thấp 17 nhưng hoạt tính của kháng thể mạnh, độ tinh sạch cao hơn. Hàm lượng IgY nhận được trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với tác giả Lê Văn Đông và cs. (2011) thu được 101mg. Tuy nhiên khi xem xét kỹ kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy mặc dù điện di trong điều kiện biến tính nhưng băng tương ứng với phân tử IgY nguyên vẹn không biến mất hoàn toàn. Theo Lê Văn Đông và cs., sản phẩm protein của trứng gà sau một lần sắc ký ái lực vẫn còn tạp lẫn các protein khác có cùng kích thước và đặc tính mang điện tương tự như IgY. Điều này có thể là nguyên nhân khiến cho sản lượng protein chứa IgY thu được trong nghiên cứu này cao hơn. Về khảo sát hoạt tính của kháng thể IgY kháng urease, trong đề tài này, sản phẩm thu được là IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori. Urease là sản phẩm chế tiết của vi khuẩn có vai trò trong việc lây nhiễm của vi khuẩn H. pylori xuống dưới niêm mạc dạ dày trong điều kiện lây nhiễm tự nhiên ở dạ dày hơn là vai trò trong việc nhân lên của vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy in vitro. Từ đó, trên phương diện miễn dịch, nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát khả năng gắn đặc hiệu của kháng thể IgY vào kháng nguyên urease của vi khuẩn H. pylori đã dùng để gây miễn dịch bằng xét nghiệm ELISA gián tiếp. Thử nghiệm này được thực hiện liên tục với các sản phẩm là lòng đỏ trứng gà cũng như các sản phẩm IgY ở các bước tách chiết, tinh sạch khác nhau. Dưới góc độ phản ứng kháng nguyên kháng thể, xét nghiệm ELISA đã cho phép khẳng định sản phẩm IgY thu được là đặc hiệu với kháng nguyên urease của vi khuẩn H. pylori dùng để gây miễn dịch. Mặc dù vậy, trên phương diện hoạt tính hóa sinh của enzyme urease, nếu sản phẩm IgY được kiểm tra tác dụng ức chế hoạt tính urease bằng thử nghiệm thủy phân cơ chất ure của urease qua phản ứng tạo màu trong ống nghiệm (như mô tả ở phần phân lập 18 vi khuẩn) sẽ cho thêm các thông tin về khía cạnh hóa sinh. Đây cũng là một điểm hạn chế của đề tài cần được thực hiện trong các nghiên cứu phát triển sản phẩm IgY kháng urease trong tương lai. Ngoài ra, do urease chỉ có vai trò chính trong việc xâm nhiễm của vi khuẩn xuống dưới niêm mạc dạ dày tá tràng để vi khuẩn tồn tại và nhân lên. Nói cách khác, urease chỉ có vai trò gián tiếp liên quan đến sự tồn tại và nhân lên của vi khuẩn H. pylori trong điều kiện in vivo. Việc khảo sát tác dụng ức chế sự nhân lên của vi khuẩn trên in vitro có thể không khả thi, đồng thời không cho các thông tin liên quan trực tiếp đến cơ chế kháng khuẩn. Từ đó nghiên cứu này không thực hiện đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro bằng kỹ thuật tương tự như làm kháng sinh đồ của các tác giả chế tạo IgY kháng vi khuẩn (Tim Sunnary với trực khuẩn mủ sanh - 2011) hay các tác giả chế tạo IgY kháng toàn bộ các thành phần của vi khuẩn H. pylori. 4.2.2.2. Hoạt tính và độ ổn định của chế phẩm IgY kháng urease từ H. pylori trong quá trình bảo quản Về tính ổn định của chế phẩm, kết quả cho thấy chế phẩm vẫn giữ được hoạt tính. Mặc dù vậy, nghiên cứu về các điều kiện bảo quản đa dạng và với thời gian kéo dài hơn là cần thiết để có được các thông tin đầy đủ hơn nhằm đánh giá tính khả thi của phương án sử dụng chế phẩm IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori trong các điều kiện thực tế ở các vùng miền khác nhau ở Việt Nam với các điều kiện khí hậu, độ ẩm và trang thiết bị khác nhau. 4.2.2.3. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY So với công nghệ sản xuất kháng thể IgG từ động vật có vú, công nghệ sản xuất IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái của chúng tôi bước đầu đã cho thấy đây là hướng đi đúng trong việc áp dụng một công nghệ đơn giản có thể tạo ra một lượng lớn IgY với giá thành rẻ 19 áp dụng cho các mục đích điều trị và dự phòng các bệnh nhiễm trùng nói chung và nhiễm vi khuẩn H. pylori nói riêng. 4.3. HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG LÂY NHIỄM HELICOBACTER PYLORI TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA IgY KHÁNG UREASE 4.3.1. Về chuột thí nghiệm: Sở dĩ chúng tôi chọn chuột nhắt trắng dòng Swiss là do chúng vẫn khỏe, nhanh nhẹn và giá thành thấp, điều này tạo thuận rất nhiều cho các nhà nghiên cứu. Về cỡ mẫu, nhóm 1 và nhóm 2 dùng để làm chứng và không tiếp xúc với tác nhân gây nhiễm, vì vậy khả năng sống còn trong thí nghiệm rất cao cho nên số mẫu chuột được chọn nhỏ (5 con/nhóm). Cỡ mẫu này cũng được lựa chọn dựa theo tác giả đã nghiên cứu trước, Normura S. và cs. (2005), có số chuột được chọn cũng thấp (3 con/nhóm). Để đánh giá tác dụng dự phòng của sản phẩm nghiên cứu, đề tài cần so sánh các nhóm 3 và nhóm 4 với nhau. Với mục tiêu này, đề tài đã chọn 9 con chuột cho mỗi nhóm. Cỡ mẫu này cũng khá phù hợp với tác giả Shin JH. và cs. (2002) sử dụng là 10 chuột nhảy Mông Cổ cho mỗi nhóm trong một thí nghiệm tương tự, trong khi Normura S. và cs. (2005) sử dụng số chuột thấp hơn (3 con/nhóm). Cân nặng chuột nghiên cứu có thay đổi một ít nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Nhóm chuột ăn thức ăn có IgY kháng urease của vi khuẩn H. pylori ở nhóm chứng và nhóm nhiễm đều có tăng cân. Bên cạnh chuyện giải thích là do IgY bản chất là protein góp phần tăng cường dinh dưỡng cho chuột còn giúp sơ bộ chứng minh tính không gây dị ứng, tính không độc của kháng thể gà khi sử dụng trên chuột và tính an toàn khi được sử dụng bằng đường uống. 4.3.2. Về kết quả huyết thanh học và mô bệnh học dạ dày chuột Helicobacter pylori không được phát hiện trong nhóm chuột chứng (nhóm 1 và nhóm 2) của nghiên cứu chúng tôi và của Nomura 20 S. và cs. (2005). Điều này đã chứng tỏ được điều kiện nuôi chuột trong phòng thí nghiệm của chúng tôi khá tốt, không có nhiễm vi khuẩn H. pylori sau gây nhiễm H. pylori cho chuột nhóm 3 và nhóm 4 bằng đường uống và thao tác kỹ thuật gây nhiễm vi khuẩn H. pylori đạt được mức an toàn cho các cá thể chuột chung quanh. Đối với lô chuột gây nhiễm vi khuẩn H. pylori, theo tác giả Nomura S. và cs. (2005), toàn bộ chuột nhóm nhiễm H. pylori đều cho kết quả tăng kháng thể kháng H. pylori trong huyết thanh (OD450) so với nhóm chứng, trong đó kháng thể trong huyết thanh của chuột nhóm 3 lớn hơn kháng thể trong huyết thanh của chuột nhóm 4 (0,150 > 0,119) [95]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, nhận thấy cũng có tăng kháng thể kháng vi khuẩn H. pylori nhưng chỉ tăng ít và kháng thể trong huyết thanh của chuột nhóm 3 lớn hơn kháng thể trong huyết thanh của chuột nhóm 4 (0,180 > 0,120). Tuy nhiên, khi so sánh về tác dụng dự phòng của IgY kháng urease của H. pylori thì kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Nomura S. và cs. (2005). Thứ nhất, toàn bộ chuột nhóm 4 đã nêu được sự giảm kháng thể kháng H. pylori trong huyết thanh mặc dù sự tiệt trừ H. pylori trong mô bệnh học dạ dày của nhóm chuột gây nhiễm vẫn chưa đạt hiệu quả 100%. Thứ hai, có 55,6% chuột nhóm 4 đã tiệt trừ được H. pylori (HP(-)) mặc dù thấp hơn Nomura S. và cs. (100%), tuy vậy trong số HP (-) của nghiên cứu chúng tôi đã có 40% cho kết quả viêm dạ dày âm tính, điều này đã phản ánh phần nào khả năng tiệt trừ H. pylori hay tác dụng dự phòng của chế phẩm IgY kháng urease của H. pylori đã giúp bảo vệ dạ dày chuột chống lại sự tấn công và thâm nhiễm của H. pylori, nghĩa là đã loại bỏ tác nhân gây viêm dạ dày.