Tài liệu Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng urease của vi khuẩn helicobacter pylori

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm đã gây nhiễm hơn nửa dân số trên thế giới và đã được chứng minh có liên quan đến cơ chế gây bệnh viêm dạ dày mạn tính, loét dạ dày tá tràng, ung thư dạ dày và u lympho ở dạ dày (gastric MALT lymphoma) [1], [2], [3], [4], [5]. Tần suất nhiễm H. pylori có liên quan rất lớn đến điều kiện kinh tế xã hội, trên 80% ở các nước đang phát triển trong khi chỉ có khoảng 20 – 50% ở các nước phát triển [6], [7], [8], [9], [10] và có sự khác biệt theo từng vùng địa lý giữa các nước dao động từ 13% ở Nga đến Myanmar (48%), Nhật (71%), Trung Quốc (58%), Trung Mỹ (62%), Việt Nam (>70%), Đông Âu (82%) và các nước châu Phi (>80%) [10], [11], [12], [13], [14]. Mặc dù mỗi chủng H. pylori đều có sự khác biệt về khả năng gây bệnh nhưng nhìn chung H. pylori đã nhiễm ở 90% bệnh nhân viêm dạ dày, trên 90% loét tá tràng, 70% loét dạ dày và 90% ung thư dạ dày [11], [15], [16], [17]. Riêng ở Việt Nam, nhiễm H. pylori khá phổ biến và có mối liên quan mật thiết với bệnh lý dạ dày tá tràng. H. pylori được tìm thấy trong viêm dạ dày mạn (100%), viêm dạ dày thể hoạt động (83,1%), viêm teo niêm mạc dạ dày (85,3%), chuyển sản ruột (14,7%) tạo nguy cơ dẫn đến ung thư biểu mô tuyến dạ dày và loét dạ dày tá tràng (21%) [18], [19], [20]. Việc điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H. pylori rất phức tạp vì phải sử dụng phác đồ phối hợp các thuốc kháng sinh với các thuốc giảm toan, giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng quy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại cũng rất lớn do tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh. Hội nghị Đồng thuận Maastricht III (2005) khuyến cáo nên sử dụng phác đồ điều trị chuẩn ban đầu với bộ ba điều trị PPI (thuốc ức chế sự bài tiết acid của dạ dày - proton pump inhibitor) – clarithromycin – amoxicillin hoặc metronidazole. Tuy nhiên, tỉ lệ đề kháng thuốc với phác đồ bộ ba ngày càng tăng. Để hỗ trợ 2 cho phác đồ điều trị chuẩn ban đầu, Hội nghị cũng nhắc đến phác đồ thứ hai và phác đồ thứ ba, đồng thời tiếp tục bàn luận về sự đề kháng thuốc và nhận thấy khả năng đề kháng thuốc đạt tới 20% [21]. Năm 2010, tại Hội nghị Maastricht IV ở Florence (Ý) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H. pylori tăng trên toàn cầu và cũng thống nhất những phác đồ thích hợp dựa trên tình trạng kháng thuốc [22], trong đó phương pháp miễn dịch trị liệu thụ động sử dụng các kháng thể kháng trực tiếp H. pylori hoặc kháng urease của H. pylori là một hướng nghiên cứu được quan tâm đặc biệt. Globulin miễn dịch từ trứng gà (egg york immunoglobulin - IgY) là kháng thể được chuyển từ máu gà mái sang lòng đỏ trứng để thực hiện chức năng sinh lý là bảo vệ phôi và gà con. Các kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng gà có các đặc tính bảo vệ giống như các kháng thể có trong máu gà mẹ. Các tác giả Nhật Bản và Hàn Quốc đã sử dụng IgY kháng urease của H. pylori bổ sung vào sữa chua làm thực phẩm chức năng dự phòng nhiễm H. pylori bước đầu cho thấy có hiệu quả dự phòng trên người tình nguyện [23]. Nhằm tạo ra nguyên liệu chế tạo các chế phẩm dự phòng nhiễm H. pylori tại Việt Nam theo phương pháp miễn dịch thụ động, đề tài “Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Tách chiết urease của vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân viêm loét dạ dày - tá tràng. 2. Chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori. 3. Đánh giá khả năng dự phòng nhiễm Helicobacter pylori trên động vật thực nghiệm của IgY kháng urease. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. VI KHUẨN Helicobacter pylori 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Vào năm 1981, Robin Warren, nhà Giải phẫu bệnh người Úc, đã phát hiện được một loại vi khuẩn ở niêm mạc dạ dày của bệnh nhân bị viêm hoặc loét dạ dày và hình dạng của chúng giống vi khuẩn thuộc giống Campylobacter cho nên tên gọi đầu tiên của chúng là Campylobacter pylori. Đến năm 1983, Barry Marshall, người Úc, đã thành công trong việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn này từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn, loét dạ dày, loét tá tràng và ghi nhận đặc tính tăng trưởng khác nhau giữa chúng với Campylobacter pylori. Cho đến năm 1989, dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn này không giống Campylobacter vì có cấu trúc lông khác hẳn, bên cạnh đó, còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hoá và cấu trúc chuỗi 16S rRNA cho nên cuối cùng loài vi khuẩn này được xếp vào một giống mới, giống Helicobacter, thuộc họ Helicobacteraceae và được đổi tên là Helicobacter pylori [24], [25]. 1.1.2. Dịch tễ học Một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người mà các tác giả trong và ngoài nước thường hay nhắc đến đó chính là nhiễm H. pylori. Qua nhiều nghiên cứu nhận thấy tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và chủng tộc đã ảnh hưởng rất lớn đến tần suất nhiễm H. pylori. Đã có khoảng hơn nửa dân số thế giới bị nhiễm H. pylori và tần suất nhiễm có sự khác biệt rất lớn giữa các nước phát triển và các nước đang phát triển. Ở các nước đang phát triển như Ấn Độ, Saudi Arabia, Việt Nam và châu Phi có tỉ lệ nhiễm H. pylori khá cao chiếm khoảng 80% ở lứa tuổi trên 20 tuổi. Trong khi đó, ở các 4 nước phát triển như Anh, Úc và Pháp, tỉ lệ nhiễm thấp hơn 10 – 20% và tăng khoảng 1% mỗi năm [11], [26], [27]. Nguyên nhân của sự khác biệt này chủ yếu là do vệ sinh môi trường, cụ thể như sự phát triển của hệ thống hiện đại trong việc xử lý nước và chất thảy ở các nước phát triển [28], [29], [30]. Riêng về tuổi, trẻ em phần lớn bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 – 8, trong đó các nước phát triển tỉ lệ nhiễm cũng thấp hơn như tần suất nhiễm ở trẻ em Nhật Bản dưới 10 tuổi rất thấp chỉ có 5% và cũng tăng dần theo tuổi [27]. Thêm vào đó, ở các nước phát triển, người lớn có độ tuổi bị nhiễm thường trên 50 tuổi và tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm, trong khi các nước đang phát triển có độ tuổi nhiễm sớm hơn thường trên 20 tuổi. Ở Việt Nam, Nguyễn Sào Trung (2005) đã ghi nhận tần suất nhiễm H. pylori cao ở độ tuổi từ 31 - 50 tuổi [31]. Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lây trực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt. Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây quan trọng ban đầu. Đó cũng chính là lý do giải thích tại sao ở các nước đang phát triển tần suất nhiễm H. pylori cao hơn rất nhiều [11], [28], [32], [33]. 1.1.3. Đặc điểm sinh học của H. pylori 1.1.3.1. Hình thể và dinh dưỡng Hình 1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori * Nguồn: McColl K.E.L. (2010) [34] Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, hình cong, xoắn nhẹ, dài 1,5 - 5µm, đường kính 0,3 - 1µm. Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 lông, 5 đầu mút hình củ hành, nhờ đó H. pylori di chuyển được trong lớp nhầy của niêm mạc dạ dày bởi chuyển động xoắn (Hình 1.1) [24], [34], [35], [36]. Helicobacter pylori thuộc loại vi khuẩn vi hiếu khí, mọc chậm nên phải nuôi cấy từ 4 - 7 ngày. Vi khuẩn mọc trên các môi trường chuyên biệt như Pylori agar, Skirrow cải tiến hoặc trên các môi trường Columbia, Brucella, BHI agar có thêm 7 – 10% máu ngựa hoặc máu cừu tươi, để ở 37 oC trong điều kiện có 5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao. Môi trường chọn lọc thường có thêm các thuốc kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và amphotericin B để ức chế tạp nhiễm. Helicobacter pylori có thể tăng trưởng được ở nhiệt độ từ 30 – 40oC, chịu được môi trường pH từ 5,5 - 8,5 và sống nhiều tháng ở âm 70oC trong môi trường thích hợp [24]. Kết quả có thể đọc sau 3 - 5 ngày nuôi cấy (hoặc có thể để đến 14 ngày) với các khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính từ 0,5 – 1mm, không tan máu hoặc tan máu alpha. Đặc biệt, tiêu chuẩn xác định H. pylori sau nuôi cấy là khuẩn lạc phải cho kết quả dương tính với các thử nghiệm oxidase, catalase và urease, trong đó thử nghiệm urease cho dương tính nhanh và mạnh. * Thử nghiệm oxydase Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên giấy thấm. Nhỏ thuốc thử TMPD 0,1% (TMPD: N,N,N’,N’-Tetramethyl-p-phenylenediamine). Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom oxy hóa + TMPD khử Cytochrom oxy hóa + H2O TMPD oxy hóa (màu xanh) Đọc kết quả ngay sau 30 giây: phản ứng (+) tính thì sinh khối chuyển màu xanh và phản ứng (-) tính sinh khối vẫn còn màu trắng (Hình 1.2). 6 Hình 1.2. Thử nghiệm oxydase của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] * Thử nghiệm catalase Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên lame kính sạch. Nhỏ H2O2 30% (hydrogen peroxide). H2O2 H2O + O2 (bọt khí) Catalase Đọc kết quả ngay sau 1 - 2 giây: phản ứng (+) tính thì có bọt khí xuất hiện và phản ứng (-) tính không có bọt khí (Hình 1.3). Hình 1.3. Thử nghiệm catalase của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] * Thử nghiệm urease Thử nghiệm urease nhằm phát hiện gián tiếp sự có mặt của H. pylori thông qua urease của chúng. Do H. pylori sản xuất urease có hoạt tính rất cao, vì vậy, chỉ cần đưa mảnh sinh thiết có chứa H. pylori hoặc khuẩn lạc của H. pylori vào một lượng nhỏ dung dịch urea có chỉ thị màu. Lúc này hoạt tính urease của vi khuẩn sẽ nhanh chóng phân hủy urea thành ammonia, làm môi trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đổi từ màu vàng thành màu hồng cánh sen. Kết quả đọc trong vòng 20 phút với độ đặc hiệu gần như 100% (Hình 1.4) [24]. 7 Hình 1.4. Thử nghiệm urease của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] Đồng thời trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể vi khuẩn H. pylori đa số là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có thể có cả hình trực khuẩn (Hình 1.5) và nếu để sau 10 ngày nuôi cấy, có thể xuất hiện các thể hình cầu [24], [36], [37]. Hình 1.5. Hình ảnh nhuộm Gram của Helicobacter pylori * Nguồn: O'Rourke J.L., et al. (2001) [36] 1.1.3.2. Tính chất hóa sinh và kháng nguyên urease của H. pylori Urease là một trong những enzyme chủ yếu trong sinh bệnh học của H. pylori. Trọng lượng phân tử của urease khoảng 550 kDa. Enzyme này mang tính quan trọng sống còn đối với H. pylori trong môi trường dạ dày. Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân urea thành ammonia và acid carbonic: urease (NH2)2CO + H2O NH2COOH + H2O NH3 + NH2COOH NH3 + H2CO3 8 NH3 vừa được tạo ra nhanh chóng hợp nước để tạo thành NH4+ và OH-. H2CO3 2NH3 + 2H2O H+ + HCO32NH4+ + 2OH- Gốc OH- này kết hợp với gốc H+ của acid HCl trong dịch nhày ở niêm mạc dạ dày, từ đó làm tăng dần pH ở bề mặt niêm mạc dạ dày từ thấp đến trung tính và tạo nên một lớp đệm pH trung tính bao quanh H. pylori. Cơ chế tác động này của urease đã giúp H. pylori không bị tác động của môi trường acid mạnh (pH < 4) ở dạ dày (Hình 1.6 và 1.7) [38]. Bên cạnh đó, urease còn là tác nhân kích thích mạnh mẽ hoạt động thực bào đơn nhân và sản sinh ra các cytokine gây viêm. Đồng thời, NH3 còn gây độc trực tiếp lên tế bào và phá vỡ liên kết giữa các tế bào làm tổn thương niêm mạc dạ dày. Như vậy, urease biểu hiện cả hai chức năng: vừa là tác nhân xâm lấn và cũng vừa là tác nhân gây độc. Urease là một trong những mục tiêu quan trọng nhất trong việc phát triển thuốc để kiểm soát nhiễm H. pylori ở dạ dày [39], [40], [41], [42], [43]. Hình 1.6. Vai trò của H. pylori urease trong nhiễm H. pylori * Nguồn: Follmer C. (2010) [44] Hình 1.7. Cơ chế xâm lấn của H. pylori vào dịch nhày dạ dày * Nguồn: Bansil R., et al. (2013) [39] 9 Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong đó 3 (nhóm chính là nhóm hydrolase), 5 (nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N), 1 (phân nhóm phụ cắt các amid thẳng) và 5 (số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ). Vào năm 1926, urease lần đầu tiên được Summer tách chiết từ đậu rựa (jack bean). Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sát được dưới kính hiển vi và có đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháp tách chiết. Khối lượng phân tử của urease được Polacco và Havir xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột agarose A-15m đối với urease đậu rựa và đậu nành Brazil. Urease đậu nành có 2 phân tử lượng khác nhau 540 kDa và 420 kDa, còn urease đậu rựa chỉ có một phân tử lượng là 480 kDa. Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau và ngay cả trong cùng một nguồn đậu nành đã có tới 2 loại urease. Hai loại urease này khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không thay đổi. Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid amine, mà thành phần của các acid amine này thì không giống nhau ở những nguồn khác nhau, điều này lý giải sự khác nhau về khối lượng phân tử giữa chúng [45], [46]. Urease dễ dàng hòa tan trong dung dịch ammonia loãng và dung dịch kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dịch muối loãng và acid hữu cơ tùy thuộc nồng độ acid. Điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng pH = 5,0 – 5,1 và tại điểm đẳng điện độ hòa tan của urease cực nhỏ. Urease cũng mang những đặc tính của protein như tan trong nước và dung dịch muối loãng; không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước phân tử lớn; tan khi có lớp áo nước và tích điện; tủa khi mất lớp áo nước và trung tính; bị biến tính dưới tác dụng của acid, kiềm đặc, các ion kim loại nặng và nhiệt độ cao; dễ bị tủa thuận nghịch trong các dung môi hữu cơ 10 (ethanol, acetone...) hoặc muối ammonium sulfate, sodium chloride; tính chất hóa lý có thể thay đổi khi kết hợp với cơ chất, coenzyme, ion kim loại hoặc một số chất hữu cơ đặc hiệu khác; và phân tử enzyme có thể tồn tại ở các trạng thái ion như anion, cation hoặc trung hòa tùy theo pH của môi trường. Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm các acid amine có nhóm hóa học hoạt động mạnh và các ion kim loại. Các nhóm hóa học hoạt động mạnh này có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất. Các ion kim loại có vai trò xúc tác rất lớn, có tác dụng liên kết giữa enzyme và cơ chất hoặc apoenzyme và coenzyme hoặc tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử. Đồng thời, urease là enzyme không có bất cứ cofactor hữu cơ nào và cũng không có sắt, manganese hay phosphorus. Bên cạnh đó, trung tâm hoạt động của urease còn có chứa hai nguyên tử nitrogen. Hai nguyên tử nitrogen này đóng vai trò rất quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease hay còn gọi là Nikel dependent enzyme. Cơ chất của urease khá quan trọng trong việc mô tả vai trò của trung tâm hoạt động nitrogen trong quá trình xúc tác. Một số cơ chất của urease là urea, semicarbazide, formamide, acetamide, N – Methylurea, N – Hydroxyurea, dihydroxyurea… Urea là cơ chất đặc hiệu của urease với năng lượng hoạt hóa là 8.700 hoặc 11.700 calories/gmol ở 25 oC, còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì vận tốc nhỏ hơn 120 lần. Phân tử urea rất bền và sự phân hủy urea không enzyme trong dung dịch không phụ thuộc vào độ pH. Tuy nhiên, khi gặp enzyme, chính enzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bị nước hay OHtấn công để tạo ra carbamate [7], [42], [47]. Urease được phát hiện ở nhiều loài vi sinh vật, thực vật và một số ít động vật. Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon, tên gọi chung là Ureabacterium và phần lớn thuộc hai họ 11 Cocoaceae và Bacilaceae. Một số vi khuẩn sinh tổng hợp urease là H. pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis… Helicobacter pylori phân lập được từ các mô sinh thiết dạ dày đều sản xuất một lượng lớn urease. Trọng lượng phân tử của urease sinh ra từ H. pylori khoảng 540 kDa và là một phân tử hexameric chứa nickel gồm có 2 tiểu đơn vị (UreA [30 kDa] và UreB [62 kDa]) theo tỉ lệ phân tử 1:1. Nhìn chung, hoạt tính của urease được đòi hỏi là phải tạo ra vi môi trường trung tính trong dạ dày cho H. pylori. Urease được biểu lộ như một protein lớp bề mặt ngoài của H. pylori và hình thành một lượng lớn protein bao quanh H. pylori. Cùng với việc urease sau tiết liên kết với màng ngoài của H. pylori thì hoạt tính của urease cũng còn biểu hiện trong bào tương của H. pylori với vai trò tiêu hóa nitrogen hữu cơ. Sự tương quan giữa urease và bề mặt vi khuẩn có vẻ ổn định nhờ vào các ion dương hóa trị 2 như Ca 2+ và Mg2+ mặc dù những ion dương khác có thể ức chế hoạt tính urease [7], [40], [42], [48]. Bên cạnh urease, những sản phẩm chuyển hóa đặc biệt khác của H. pylori là catalase, superoxid dismutase và alkylhydroperoxid reductase. Superoxid dismutase phân hủy superoxid của các tế bào bạch cầu đa nhân và đại thực bào, do đó H. pylori sẽ không bị bạch cầu đa nhân và đại thực bào tiêu diệt. Catalase bảo vệ H. pylori tránh khỏi sự tiêu diệt từ các hydro peroxid (H2O2) của các tế bào thực bào. Các protein màng ngoài, phospholipid, glucolipid và các điểm bám dính của H. pylori đã giúp cho vi khuẩn này bám vào lớp mucin và tế bào niêm mạc của dạ dày. Các điểm bám dính này bám vào các thụ thể đặc hiệu có ở trên tế bào chủ [7], [24], [49]. Ngoài ra, H. pylori còn sản xuất các độc tố khác như yếu tố độc tế bào tạo không bào A (Vacuolating cytotoxin A – VacA), yếu tố độc tế bào liên quan gen A (Cytotoxin associated gen A – CagA), lipopolysaccharid (LPS) của H. pylori [24]. Vai trò của CagA và VacA sau tiết từ H. pylori được minh 12 họa trong Hình 1.8 và 1.9. Trong đó, VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt động tế bào bằng những đường khác nhau nhằm tạo thuận cho bệnh viêm dạ dày mạn tính bởi H. pylori: (1) VacA bề mặt vi khuẩn bám trực tiếp vào màng, (2) VacA tiết bám lên thụ thể màng tế bào và khởi đầu đáp ứng tiền viêm, (3) xuyên trực tiếp qua màng tế bào và vào mitochondria gây ra sự chết tế bào, (4) vào pinocytosis tạo ra sự ẩm bào, (5) tạo kênh qua màng tế bào dẫn đến sự dò rỉ chất dinh dưỡng ra ngoài qua màng, (6) xuyên qua kẽ hở màng tế bào và ức chế sự hoạt hóa và tăng sinh của tế bào T [8], [50]. Thay đổi hình thái Tăng sinh tế bào Đáp ứng tiền viêm Hình 1.8. Những vai trò khác nhau của hệ thống tiết loại IV của Cag trong điều chỉnh về miễn dịch, tăng sinh tế bào và thay đổi hình thái * Nguồn: Kusters J.G., et al. (2006) [8] 13 Kênh màng tế bào Con đường tín hiệu tiền viêm Sự chết tế bào Sự tạo không bào Hình 1.9. VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt Ức chế hoạt hóa và tăng độngsinh tế bào tế bào T bằng những đường khác nhau nhằm tạo thuận cho viêm dạ dày mạn tính bởi H. pylori * Nguồn: Kusters J.G., et al. (2006) [8] 1.1.4. Nhiễm H. pylori và bệnh viêm loét dạ dày tá tràng Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày tá tràng liên quan đến H. pylori được thể hiện rõ nét qua phản ứng của cơ thể đối với H. pylori. Urease của vi khuẩn trung hòa pH của dạ dày đưa pH dạ dày trở về trung tính, từ đó đã tạo thuận lợi cho sự tồn tại của vi khuẩn, sự tấn công của chúng vào tế bào biểu mô dạ dày và sự di chuyển của chúng trên bề mặt nhày của niêm mạc dạ dày [51]. Sự dính bám của vi khuẩn vào lớp biểu mô của dạ dày nhờ vào hai yếu tố dính bám là BabA (blood group antigen - binding adhesion) và SabA (sialic acid - binding adhesion), ngay sau khi dính bám, vi khuẩn giải phóng hai yếu tố CagA và VacA vào lớp tế bào này. Chính CagA và VacA là những nguyên nhân tạo ra một đáp ứng của hệ thống miễn dịch rất mạnh và gây viêm niêm mạc dạ dày [52]. 14 Hình 1.10. Cơ chế bệnh sinh của nhiễm H. pylori và đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bệnh * Nguồn: Cadamuro A.C.T., et al. (2014) [52] Lipopolysaccharide (LPS) của H. pylori được nhận biết chủ yếu bởi hai thụ thể TLR4 và TLR2 (Toll-like receptor - TLR) trong đó TLR4 là thụ thể nhận biết chính LPS của H. pylori, tuy nhiên do sự thay đổi của cấu trúc LPS đã làm thay đổi sự nhận biết này và làm giảm kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể, điều này tạo thuận cho sự tấn công của vi khuẩn và gây ra bệnh. Hai thụ thể này phụ thuộc vào sự hiện diện của MyD88 (myeloid differentiation primary-response gene 88) để truyền tín hiệu. Phức hợp MyD88 được kết hợp với IRAK1 (interleukin-1-receptor-associated kinase-1) và IRAK4. IRAK1 được phosphoryl hóa và kế đó phân ly từ MyD88. Cũng bằng sự phosphoryl hóa, phức hợp MyD88 phân tách cho ra NF-κB (nuclear facter κB). NF-κB được di chuyển vào nhân để kích hoạt biểu lộ các gen liên quan đến tiến trình hình thành viêm niêm mạc dạ dày [52]. 15 CagA tạo ra đáp ứng viêm là do chúng gây ra sự tăng sản xuất một vài cytokines như IL-1β (interleukin - 1β) và IL-8 và đồng thời hoạt hóa NF-κB, thủ phạm tạo ra sự phát sinh nhanh các kiểu hình của vi khuẩn, quan trọng trong quá trình hình thành cơ chế bệnh sinh của ung thư như kích hoạt các yếu tố tăng trưởng và ức chế sự chết tế bào. Như vậy, CagA đã hủy bỏ con đường truyền tín hiệu trong tế bào và thay vào sự phát triển những tế bào ung thư, một điểm quan trọng trong bệnh sinh của H. pylori [52], [53]. VacA kích hoạt đáp ứng tiền viêm và hoạt hóa những tế bào viêm tham gia trong đáp ứng viêm mạn tính ở niêm mạc dạ dày bởi sự tấn công của vi khuẩn H. pylori. VacA còn kích hoạt sản sinh ra TNF-, IL-1β, nitric oxide, phản ứng đặc hiệu oxy và hoạt hóa NF-κB có thể liên quan đến những cytokine tiền viêm và sự chết tế bào. VacA cũng tác động đến hệ thống miễn dịch nhằm giúp cho H. pylori né tránh được đáp ứng miễn dịch thu được của cơ thể để tạo ra nhiễm trùng dai dẳng, từ đó cản trở sự thực bào, sự trình diện kháng nguyên và cũng ức chế sự biệt hóa tế bào lympho T [52]. Song song đó, đáp ứng miễn dịch cũng được hoạt hóa với sự tăng sinh những tế bào viêm tại ổ nhiễm ở dạ dày dẫn đến sự phóng thích nhiều hóa chất trung gian tiền viêm và kháng viêm khác nhau. Bên cạnh đó, sau khi hoạt hóa NF-κB (nuclear factor - NF), đã tạo ra một lượng lớn các cytokine và chemokine tiền viêm như yếu tố hoại tử u alpha (TNF-) và nhiều interleukin, và đồng thời đã hoạt hóa những con đường phát bệnh ung thư có thể gây ra ung thư dạ dày. Thêm vào đó, sự giải phóng các hóa chất trung gian trong đáp ứng miễn dịch học được điều tiết bởi miRNAs và những hóa chất trung gian trong viêm do nhiễm H. pylori có thể làm thay đổi sự phóng thích miRNAs. Mặt khác, sau hoạt hóa NF-κB và sản sinh các cytokine, nhiễm H. pylori tạo ra hóa hướng động các đại thực bào và tẩm nhuận các bạch cầu đa nhân (bạch cầu đa nhân trung tính) và các tế bào lympho (Hình 1.10) [52]. 16 1.1.5. Các phương pháp phát hiện H. pylori Có hai nhóm phương pháp phát hiện H. pylori: các phương pháp xâm phạm (invasive methods) và không xâm phạm (non-invasive methods) [24], [54], [55], [56]. Các phương pháp xâm phạm bao gồm phương pháp tế bào học, phương pháp mô bệnh học, thử nghiệm urease, nuôi cấy và phản ứng chuỗi polymerase (PCR - Polymerase chain reaction). Để thực hiện một trong những phương pháp này, bệnh nhân phải được nội soi dạ dày – tá tràng để lấy mảnh sinh thiết ở vị trí tổn thương dạ dày hoặc tá tràng. Bên cạnh đó, các phương pháp không xâm phạm bao gồm test thở với urea gắn 14C hoặc 13C, các xét nghiệm huyết thanh học tìm kháng thể và xét nghiệm phân tìm kháng nguyên H. pylori. 1.1.6. Khả năng kháng kháng sinh của H. pylori Helicobacter pylori có khả năng đề kháng rất mạnh với những thuốc kháng sinh đưa vào điều trị cả trên in vitro và in vivo. Đối với bệnh lý viêm loét dạ dày và tá tràng do nhiễm H. pylori, Hội nghị Đồng thuận Maastricht III (2005) bàn luận về phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong điều trị tiệt trừ H. pylori với thời gian điều trị từ 7 – 14 ngày. Với phác đồ bộ ba này, tỉ lệ đề kháng thuốc ngày càng tăng [57]. Ví dụ như tỉ lệ đề kháng clarithromycin ở Nhật là 16%, châu Âu lớn hơn 20% và Bắc Mỹ 25% [58]; và hiệu quả tiệt trừ H. pylori của phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong năm 2007 chỉ đạt được 72% [59]. Riêng ở Việt Nam, sự thất bại của phác đồ chuẩn điều trị tiệt trừ H. pylori được ghi nhận trong Hình 1.11 [60], [61], [62], [63]. Đồng thời, Hội nghị cũng bàn luận đến phác đồ thứ hai hoặc là bổ sung bismuth 10 – 14 ngày điều trị trong phác đồ bộ bốn (bismuth - PPI – clarithromycin – amoxicillin hoặc metronidazole) hoặc lựa chọn sự kết hợp khác thay clarithromycin và amoxicillin bằng tetracycline (PPI – tetracycline – metronidazole), tuy nhiên khả năng điều trị tiệt trừ H. pylori trên toàn cầu chỉ đạt được 64% đối với 17 phác đồ bộ bốn và 91% đối với phác đồ có tetracycline và phác đồ thứ ba có thêm hai kháng sinh levofloxacin (fluoroquinolone) và rifabutin (rifamycin) cũng với ghi nhận sự đề kháng thuốc tăng nhanh (Bảng 1.1) [21], [22], [64], [65]. Hình 1.11. Hiệu quả tiệt trừ H. pylori của phác đồ chuẩn tại Việt Nam * Nguồn: Nguyễn Thúy Vinh (2003) [62], Trần Ngọc Bảo (2004) [63], Đào Hữu Ngôi (2010) [61] và Bùi Hữu Hoàng (2011) [60] Bảng 1.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori trên thế giới theo Hội nghị Đồng thuận Maastricht III và IV Loại kháng sinh Tỉ lệ kháng thuốc Clarithromycin 15 – 20% Metronidazole  80% Levofloxacin 20% Rifabutin 20% * Nguồn: Malfertheiner P. (2007 và 2012) [21], [22] 18 Riêng ở Việt Nam, vào những năm gần đây, tình hình đề kháng với các loại thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H. pylori như Clarithromycin, Amoxicillin, Metronidazole và Tetracycline trong bệnh viêm dạ dày mạn tính, loét dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày ngày càng tăng: metronidazole (94,6 – 95,5%), amoxicillin (33,9 – 35,5%), tetracycline (17,78 - 21,4%) và clarithromycin (21,4 – 26,6%) (Hình 1.12) [66], [67], [68], [69], [70]. Tóm lại, về vấn đề đề kháng thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H. pylori trên toàn cầu, Hội nghị khuyến cáo nên dựa chủ yếu vào kháng sinh đồ trước khi tiến hành điều trị cho bệnh nhân [21]. Tiếp đến Hội nghị Maastricht IV ở Florence (2010) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H. pylori tăng trên toàn cầu và thống nhất những phác đồ thích hợp dựa theo tình trạng kháng thuốc [22]. Hình 1.12. Tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori tại Việt Nam * Nguồn: Phan Quốc Hoàn (2000) [69], Lê Đình Minh Nhân (2006) [66], Nguyễn Văn Thịnh (2009) [68] và Nguyễn Thị Nguyệt (2010) [67] 1.2. HỆ THỐNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ VÀ KHÁNG THỂ IgY 1.2.1. Hệ thống miễn dịch của gà 19 Hệ thống miễn dịch của gà cũng tương tự như hệ thống miễn dịch đã tìm thấy ở động vật có vú, bao gồm 2 phần: miễn dịch tự nhiên (innate immunity) là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại sự viêm nhiễm và miễn dịch thích ứng (adaptive immunity) là loại đề kháng của cơ thể khi có sự xâm nhập của vật lạ vào cơ thể và hình thành các tế bào nhớ miễn dịch có khả năng nhận diện khi có sự tái xâm nhập lại của vật lạ [71], [72], [73]. 1.2.2. Các kháng thể của gà Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụ động thu được ở chim. Ông đã chứng minh về sự di truyền các yếu tố miễn dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con. Sự miễn dịch này có được là nhờ có sự vận chuyển của kháng thể từ gà mẹ sang gà con [74], [75]. Gà có 3 lớp kháng thể là IgA, IgM và IgY. Trọng lượng phân tử, đặc điểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà thì tương tự như các lớp này ở động vật có vú, trong khi đó, IgY có trọng lượng phân tử thấp, có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng đỏ trứng (egg york – nên có tên gọi là IgY) nhằm cung cấp khả năng đề kháng cho phôi gà và gà con [72], [73], [74], [76], [77]. 1.2.3. Kháng thể IgY 1.2.3.1. Cấu trúc và chức năng Cấu trúc IgY của gà (chim) nói chung cũng giống như cấu trúc IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-). Trọng lượng phân tử của IgY là 167.250Da, lớn hơn so với IgG của động vật có vú (160.000 Da). Chuỗi nhẹ của IgY gồm một vùng thay đổi V L (variable region) và một vùng hằng định CL (constant region), có trọng lượng phân tử là 18.660Da. Chuỗi nặng gồm một vùng thay đổi V H và bốn vùng hằng định ký 20 hiệu từ C1 đến C4, với trọng lượng phân tử là 65.105 Da (Hình 1.13) [72], [74], [75]. Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản lề. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vùng C3, C4 của IgY tương tự như các vùng Cγ2 và Cγ3 của IgG còn vùng bản lề của IgG được thay bằng vùng C2 ở IgY, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn. Đây có thể là lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú. Vùng Fc của IgY gián tiếp quy định chức năng của nó như sự ngưng kết bổ thể và opsonin hóa các kháng nguyên. Cụ thể IgY không gắn vào các thụ thể Fc người và động vật có vú cũng như không hoạt hóa hệ thống bổ thể ở người và động vật có vú khác, đồng thời cũng không tương tác với yếu tố dạng thấp [72], [73], [75], [76], [78]. Hình 1.13. Cấu trúc IgY của gà (chim) và IgG của động vật có vú * Nguồn: Schade R., et al. (1996) [75] 1.2.3.2. Sự vận chuyển IgY từ gà mẹ sang gà con IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con trải qua 2 bước: