Tài liệu Nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen nd6 và mt tk liên quan đến bệnh ty thể

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy tâm huyết, đã luôn tận tình dìu dắt, hướng dẫn, khích lệ tôi từ những ngày đầu tiên tôi bắt đầu làm quen với khoa học. Cô luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi có thể hoàn thành được luận văn này, dành nhiều thời gian trao đổi và chia sẻ với tôi những kiến thức, kinh nghiệm và nhờ đó tôi trưởng thành hơn rất nhiều. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Trần Thị Thùy Anh, người thầy luôn đồng hành, sát cánh trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài, đồng thời chia sẻ với tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô giáo trong Bộ môn Di truyền học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã dạy dỗ, chỉ bảo trong suốt quá trình tôi học tập và làm việc nghiên cứu tại bộ môn, giúp tôi tiếp cận được nhiều kiến thức và kĩ thuật mới. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền học, phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống đã tạo điều kiện về trang thiết bị và vật chất cho tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh chị em trong phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học, đã luôn giúp đỡ, khích lệ, động viên để tôi có được ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Võ Thị Phƣơng MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ................................................................................................vii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................... viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3 1.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể người ............................................................ 3 1.1.1. Cấu trúc của ty thể ............................................................................................ 3 1.1.2. Chức năng của ty thể ........................................................................................ 5 1.2. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể ........................................ 7 1.2.1. Hệ gen ty thể .................................................................................................... 7 1.2.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của các gen ty thể......................................... 10 1.2.3. Heteroplasmy và homoplasmy ....................................................................... 12 1.3. Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan ...................................................... 13 1.3.1. Đột biến gen ty thể ......................................................................................... 13 1.3.2. Một số hội chứng phổ biến do đột biến gen ty thể gây ra .............................. 15 1.3.2.1. Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) ............................................................................ 15 1.3.2.2. Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh động kinh co giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác) ......................................................... 15 1.3.2.3. Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes – bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch)………………………………………………………………………………16 1.3.2.4. Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)………………………………………………………………………………16 1.4. Gen MT-TK và các đột biến A8344G, T8356C, G8363A .............................. 16 1.4.1. Gen MT-TK .................................................................................................... 16 1.4.2. Đột biến A8344G, T8356C, G8363A ............................................................ 17 1.5. Gen ND6 và đột biến T14484C ...................................................................... 18 1.5.1. Gen ND6 ......................................................................................................... 18 i 1.5.2. Đột biến T14484C .......................................................................................... 19 1.6. Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng ....................................... 20 1.6.1. Phương pháp Kunkel ...................................................................................... 20 1.6.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp 20 1.6.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR ................................ 21 1.6.3.1. Sử dụng PCR truyền thống .......................................................................... 21 1.6.3.2. Sử dụng Primer extention ............................................................................ 21 1.6.3.3. Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR) ................................................................. 22 1.7. Một số phương pháp phát hiện đột biến điểm ................................................ 23 1.7.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR- RFLP ................................. 23 1.7.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen ............................. 24 1.7.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) ................................................................................. 25 1.8. Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam ................................ 25 1.9. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài ................................................... 26 1.9.1. Mục tiêu.......................................................................................................... 26 1.9.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 26 CHƢƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 27 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ............................................................................................... 27 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 28 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................. 28 2.2.1.1. Quy trình tách chiết ...................................................................................... 28 2.2.1.2. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết ...................................................... 29 2.2.2. Nhân bản các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 bằng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) ..................................... 29 2.2.3. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism).............................................................................................. 32 ii 2.2.4. Nhân dòng sản phẩm PCR từ khuôn là ADN bình thường (không chứa các đột biến quan tâm) ..................................................................................................... 34 2.2.4.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α ........................................................ 34 2.2.4.2. Phản ứng gắn các đoạn ADN đã được nhân bản bằng PCR vào vector PTZ57R/T.................................................................................................................. 34 2.2.4.3. Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến ............. 35 2.2.4.5. Tách chiết plasmid ....................................................................................... 38 2.2.4.6. Giải trình tự các plasmid nhân dòng ............................................................ 38 2.2.5. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc .................................... 38 2.2.5.1. Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng ................................................. 39 2.2.5.2. PCR plasmid chứa các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng ............................................ 40 2.2.5.3. Đóng vòng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase ............................................. 42 2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vòng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến ......................................... 42 2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm. ............................................................................... 42 2.2.7. Điện di trên gel agarose................................................................................... 43 2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide ...................................................................... 43 2.2.9. Giải trình tự ..................................................................................................... 44 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 45 3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm ...................................................... 45 3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582. ................................................................................... 45 3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T .............................................................. 47 3.3.1. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp .................. 47 3.3.2. Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng ..................................... 49 3.3.3. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 đã được nhân dòng .................................................................................................... 51 iii 3.3.3.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 ................................................................... 51 3.3.3.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 ....................................................................... 51 3.3.3.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 và ngẫu nhiên phát hiện đột biến mất 9bp trên gen MT-TK ................................................................................................................ 52 3.3.3.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 ....................................................................... 54 3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C ................. 55 3.4.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 83428582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng .................................................. 55 3.4.2. Đóng vòng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp ........................ 56 3.4.3. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc ... 58 3.4.4. Tách và kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................ 59 3.4.4.1. Tách plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................................ 59 3.4.4.2. Kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến .......................................... 60 3.4.5. Giải trình tự các plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................. 61 3.4.5.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C .............. 62 3.4.5.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G .................... 63 3.4.5.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C .................... 64 3.4.5.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A .................... 66 3.5. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C bằng PCR-RFLP........................................................................................................ 67 3.5.1. Sàng lọc đột biến T14484C ............................................................................. 68 3.5.2. Sàng lọc đột biến A8344G .............................................................................. 69 3.5.3. Sàng lọc đột biến T8356C ............................................................................... 70 3.5.4. Sàng lọc đột biến G8363A .............................................................................. 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 74 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể....................................................................................... 4 Hình 1.2. Cấu trúc màng trong của ty thể ................................................................... 5 Hình 1.3. Ty thể và quá trình trao đổi năng lượng trong tế bào.................................. 6 Hình 1.4. Hệ gen ty thể người ..................................................................................... 7 Hình 1.5. Thuyết nút cổ chai di truyền ..................................................................... 12 Hình 1.6. Sơ đồ các đột biến gen ty thể liên quan đến một số bệnh phổ biến .......... 14 Hình 1.7. Tạo đột biến điểm (thay thế) định hướng sử dụng PCR truyền thống ...... 21 Hình 1.8. Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR primer extention ................ 22 Hình 1.9. Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR đảo ..................................... 22 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu sàng lọc một số đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh do đột biến gen ty thể........................................................................ 28 Hình 2.2. Bản đồ vector PTZ57R/T và vị trí đa điểm cắt ......................................... 35 Hình 2.3. Quy trình tạo đột biến điểm định hướng ................................................... 39 Hình 2.4. PCR plasmid đích với cặp mồi đột biến và nối 2 đầu sản phẩm PCR ...... 39 Hình 3.1. Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân.............. 45 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 81668385, 8342-8582 ....................................................................................................... 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385 và 8342-8582 ................................................................................ 47 Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn và cặp mồi vector ..... 49 Hình 3.5. Kết quả tách chiết plasmid nhân dòng ...................................................... 50 Hình 3.6. So sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 nhân dòng với trình tự gen chuẩn51 Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen chuẩn ................... 52 Hình 3.8. So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen chuẩn ................... 53 Hình 3.9. So sánh trình tự đoạn gen 8342-8582 với trình tự gen chuẩn ................... 54 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến .. 55 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra các khuẩn lạc ............ 57 Hình 3.12. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D). ...................... 59 v Hình 3.13. Kết quả tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (A), 8166-8385 (B), 8155-8366 (C), 8342-8582 (D) chứa các vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ...................................................................................................... 60 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tách chiết với các cặp mồi LHTC, MRTC, MRAG, MRGA và M13 .................................................................. 61 Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 ............................................................................................................ 62 Hình 3.16. Một phần trình tự tạo đột biến T14484C ................................................ 63 Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 ............................................................................................................ 63 Hình 3.18. Một phần trình tự tạo đột biến A8344G .................................................. 64 Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 ............................................................................................................ 65 Hình 3.20. Một phần trình tự tạo đột biến T8356C .................................................. 65 Hình 3.21. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 ............................................................................................................ 66 Hình 3.22. Một phần trình tự tạo đột biến G8363A .................................................. 67 Hình 3.23. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến T14484C .................................................................................................................... 68 Hình 3.24. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến A8344G ..................................................................................................................... 69 Hình 3.25. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến T8356C ...................................................................................................................... 70 Hình 3.26. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến G8363A ..................................................................................................................... 71 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể ........................................................................ 8 Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho PCR nhân bản các đoạn ADN trên gen ND6 và MT-TK .......................................................................................................... 30 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582 .................................................................................... 31 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt và kích thước của phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen ...................................................................................................... 31 Bảng 2.4. Dự đoán sản phẩm phản ứng cắt các đoạn ADN với enzyme giới hạn. ... 32 Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn ....................................... 33 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ligase ..................................................................... 35 Bảng 2.7. Trình tự mồi M13 ..................................................................................... 36 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR với mồi M13 ................................................. 37 Bảng 2.9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi M13 ........................................... 37 Bảng 2.10. Kích thước sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn và mồi vector M13 của các loại đột biến ....................................................................... 37 Bảng 2.11. Trình tự mồi oligonucleotide cho PCR tạo đột biến định hướng. .......... 40 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dòng với mồi chứa vị trí đột biến ............................................................................................................................ 41 Bảng 2.13. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với từng loại mồi chứa vị trí đột biến..... 41 Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vòng sản phẩm PCR .................................. 42 Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide ............................................. 44 vii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic ADP Adenosine diphotphate ARN Axit ribonucleic ATP Adenosine Triphosphate bp Base pair (cặp bazơ nitơ) DDW Deionized Distilled Water (Nước cất loại ion, khử trùng) D-loop Displacement Loop (vòng chuyển vị) dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase LB Môi trường Luria Bertani Leigh Leigh syndrome (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh) LHON Leber’s hereditary optic neuropath (hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) LHTC Mồi nhân bản đoạn gen 14455-14578 LHCFw/Rv Cặp mồi tạo đột biến điểm T14484C MELAS Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes (bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch) MERRF Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers (bệnh động kinh co giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác) mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể) MRAFw/Rv Cặp mồi tạo đột biến điểm G8363A MRAG Mồi đặc hiệu đoạn gen 8155-8366 MRCFw/Rv Cặp mồi tạo đột biến điểm T8356C MRGFw/Rv Cặp mồi tạo đột biến điểm A8344G MRGA Mồi đặc hiệu đoạn gen 8342-8582 MRTC Mồi đặc hiệu đoạn gen 8166-8385 viii MT-TK Mitochondrially encoded tRNA lysine NADH Nicotinamide adenine dinucleotide ND6 Gen mã hóa NADH dehydrogenase 6 PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Sự đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn) TAE Tris Acetate EDTA ix MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP. Ngoài ra, ty thể còn có vai trò trong quá trình tạo hemoglobin, tổng hợp các purine và pyrimidine, viên gạch cấu trúc giúp xây dựng ADN và ARN, tham gia vào quá trình chết theo lập trình (Apoptosis - Programmed cell death) của tế bào và nhiều quá trình trao đổi chất khác. Để thực hiện hết được các vai trò của mình và đảm bảo về nhu cầu năng lượng nhằm duy trì sự sống và hỗ trợ sự tăng trưởng, ty thể phải thực hiện các quá trình trao đổi chất với tần suất cao. Các phản ứng trao đổi chất này giải phóng nhiều sản phẩm có tính ứng ôxy hóa, đồng thời với sự tác động thêm của một số yếu tố khác là nguyên nhân gây ra sự tổn thương cho ty thể, đặc biệt là ADN ty thể. Các đột biến trong hệ gen ty thể là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là bệnh cơ não ở người, các bệnh này có thể là nguyên nhân kéo theo nhiều bệnh khác nghiêm trọng hơn, ảnh hưởng rất nhiều tới đời sống con người. Trong số các gen ty thể, gen MT-TK và ND6 được quan tâm nghiên cứu bởi sự đột biến gen MT-TK được khẳng định liên quan đến nhiều bệnh ty thể khác nhau, với các hội chứng bao gồm tiểu đường và điếc di truyền theo dòng mẹ (mateARNlly inherited diabetes and deafness – MIDD), hội chứng động kinh giật cơ với các sợi cơ đỏ rách nham nhở (myoclonic epilepsy with ragged-red fibers – MERRF), hội chứng não giật cơ, tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes -MELAS). Còn gen ND6 được coi là “điểm nóng” đột biến của hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy). Các đột biến trên hai gen này phần lớn là các đột biến điểm thay thế đồng hoán hay dị hoán. Các đột biến thay thế nucleotit có thể được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật phân tích ADN khác nhau, trong đó RFLP-PCR là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp, giúp sàng lọc nhanh đột biến ở các mẫu bệnh phẩm mà không cần quá nhiều thiết bị phức tạp. Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng RFLP-PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến là cần thiết được tạo ra. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo 1 đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể” nhằm tạo ra một số đối chứng dương mang đột biến cần xác định cho các phản ứng sàng lọc các đột biến trên gen ND6 và trên gen MT-TK. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học – Khoa Sinh học và phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN. 2 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ngƣời 1.1.1. Cấu trúc của ty thể Cơ thể con người là một thể thống nhất, bao gồm rất nhiều cơ quan, hệ cơ quan khác nhau. Mỗi cơ quan đảm nhận một nhiệm vụ riêng, nhưng tất cả đều được cấu tạo bằng các tế bào, nên tế bào được coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Ty thểlàmột trong những bào quan có mặt trong tất cả các tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào. Ty thể bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX. Năm 1857, nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kolliker lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào cơ. Năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương pháp nhuộm fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi quang học[13]. Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng và kích thước khác nhau. Ty thể có khả năng thay đổi kích thước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào [13]. Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng. Số lượng của ty thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào đó, có thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ [13]. 3 Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể [61] Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, tương tự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền tạo thành các mào răng lược [8; 19]. Màng ngoài ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các chất với khối lượng phân tử lớn đến 10 kDa và các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngược lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [8]. Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lượng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol và phospholipid là 1/53. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử 4 (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotit translocase (ANT)[8; 19]. Hình 1.2. Cấu trúc màng trong của ty thể [33] Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện tử cơ động cho chuỗi hô hấp. Sự giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis). Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể [8; 19]. Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi tạo ra hai ty thể mới. Trước tiên, hệ gen ty thể được sao chép để tăng số lượng bản sao. Sau đó, màng trong thắt lại rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [13]. 1.1.2. Chức năng của ty thể Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng cho tế bào bằng cách oxy hóa các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng toàn bộ năng lượng dưới dạng ATP 5 (hình 1.3). Các phản ứng này được xúc tác bởi các phức hợp của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở màng trong của ty thể [17; 23]. Nguồn tạo ra năng lượng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein được lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất này được oxy hóa để tạo ra các chất khử giàu năng lượng, sau đó các đương lượng khử được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng liên kết phosphate cao năng trong ATP thông qua con đường hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme. Hình 1.3. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [62] ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào [18; 33]. Do đó, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh ra năng lượng để cung cấp cho tế bào và cơ thể bị chậm lại, thậm chí bị ngừng lại hoàn toàn. Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó sự tổn thương của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và cơ quan. Triệu chứng của bệnh ty thể không giống nhau, bởi vì người bệnh có thể có một hỗn hợp ty thể bình thường lẫn ty thể đột biến với sự phân bố riêng trong cơ thể. Đôi khi, số ty thể bình thường đủ để bù đắp cho những ty thể bị đột biến [19]. 6 1.2. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể 1.2.1. Hệ gen ty thể Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. Hệ gen của ty thể người được Clayton mô tả lần đầu tiên vào năm 1976. Đến năm 1981, Anderson đã công bố trình tự và cấu trúc của hệ gen ty thể người [5; 8]. ADN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đôi, có kích thước 16.569 bp, bao gồm 37 gen (bảng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rARN, 22 phân tử tARN và 13 phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone oxidoreductase), cytochrome b (Cyt b) là tiểu đơn vị của phức hệ III chỉ được mã hóa bởi ADN ty thể (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII) mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen ATP 6 và ATP 8 mã hóa cho 2 tiểu đơn vị của phức hệ V, chính là ATP synthase (hình 1.4). Các phân tử protein còn lại của chuỗi hô hấp được mã hóa bởi gen nhân, được dịch mã trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển vào bên trong ty thể [28]. Hình 1.4. Hệ gen ty thể ngƣời 7 Đặc biệt, hệ gen ty thể chứa ít trình tự không mã hóa xen kẽ giữa các vùng mã hóa. Vùng D-loop dài khoảng 1,1 kb là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng, điều hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (chuỗi H), chuỗi nhẹ (chuỗi L) và chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Chức năng của các vùng này chưa được biết đầy đủ nhưng dường như chúng quan trọng đối với quá trình tái bản và phiên mã của hệ gen. Hai gen mã hóa cho rARN (rARN 12S và 16S) và 22 gen mã hóa cho 22 tARN được nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các ARN cần thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể. Đa số thông tin được mã hóa trên chuỗi nặng, gồm các gen mã hóa cho 2 rARN, 14 tARN và 12 chuỗi polypeptide. Các gen trên chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và 1 chuỗi polypetide [8]. Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể [8] Gen Vị trí Sản phẩm MTATP6 8527–9207 ATPase 6 của ATP synthase (phức hợp V) MTATP8 8366–8572 ATPase 8 của ATP synthase (phức hợp V) MTCO1 5904–7445 Tiểu đơn vị I của Cyt c oxidase (phức hợp IV) MTCO2 7586–8269 Tiểu đơn vị II của Cyt c oxidase (phức hợp IV) MTCO3 9207–9990 Tiểu đơn vị III của Cyt c oxidase (phức hợp IV) MTCYB 14747–15887 MTND1 3307–4262 ND1 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND2 4470–5511 ND2 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND3 10059–10404 ND3 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND4 10760–12137 ND4 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND4L 10470–10766 ND4L của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND5 12337–14148 ND5 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTND6 14149–14673 ND6 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) MTRNR1 1671–3228 rARN 16S MTRNR2 648–1601 rARN 12S MTTA 5587–5655 tARNAla MTTC 5761–5826 tARNCys MTTD 7518–7585 tARNAsp MTTE 14674–14742 tARNGlu MTTF 577–647 tARNPhe MTTG 9991–10058 tARNGly Apocytochrome b subunit of ubiquinol (phức hợp III) 8