Tài liệu Nghiên cứu chế tạo chip sợi nano vàng ứng dụng trong định lượng hàm lượng cholesterol tự do trong dung dịch

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO PHẠM XUÂN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHIP SỢI NANO VÀNG ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TỰ DO TRONG DUNG DỊCH LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO PHẠM XUÂN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHIP SỢI NANO VÀNG ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TỰ DO TRONG DUNG DỊCH Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TỐNG DUY HIỂN Tống Duy Hiển Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 1 LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. ...................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ............................................................................................ vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................................ viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................................... 2 1.1 Tổng quan về cholesterol và cảm biến sinh học......................................................... 2 1.1.1 Tổng quan về cholesterol ......................................................................................... 2 1.1.2 Tổng quan về cảm biến sinh học.............................................................................. 5 1.2 Công nghệ nano và cảm biến sinh học sợi nano vàng .................................................. 11 1.2.1 Công nghệ nano ..................................................................................................... 11 1.2.2 Cảm biến sợi nano vàng dùng cho phát hiện cholesterol ....................................... 14 1.3 Phương pháp đơn lớp tự lắm ghép ................................................................................ 16 1.3.1 Cố định enzyme ..................................................................................................... 16 1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme ......................................................................... 17 1.3.3 Phương pháp đơn lớp tự lắp ghép (self assembly monolayer – SAM) .................. 19 1.4 Kỹ thuật quét thế vòng tuần hoàn ................................................................................. 22 1.4.1 Nguyên lý ............................................................................................................... 22 1.4.2 Đồ thị quét thế vòng............................................................................................... 24 1.5 Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn ............................................................... 25 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 26 2.1 Chế tạo sợi nano vàng bằng kỹ thuật DEA ................................................................... 26 2.1.1 Cấu trúc sợi nano vàng trên đế silic chế tạo .......................................................... 26 2.1.2 Quy trình công nghệ chế tạo sợi nano vàng trên đế silic ....................................... 26 2.2 Hoạt hóa bề mặt và cố định enzyme lên sợi nano vàng ................................................ 38 2.2.1 Các hóa chất và thiết bị .......................................................................................... 38 2.2.2 Quy trình hoạt hóa bề mặt sợi nano vàng và cố định enzyme. .............................. 39 2.2.2.2 Hoạt hóa bề mặt sợi nano vàng bằng DTSP ....................................................... 40 2.2.3 Xác định nồng độ cholesterol tự do trong dung dịch ............................................. 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 42 3.1 Đánh giá kết quả chế tạo sợi nano vàng bằng ký thuật DEA........................................ 42 3.1.1 Kết quả chế tạo sợi nano vàng ............................................................................... 42 3.1.2 Kết quả đo điện trở sợi nano vàng ......................................................................... 44 ii 3.1.3 Kết quả chụp kính hiển vi điện lực nguyên tử (AFM) ........................................... 48 3.2 Kết quả kiểm tra tính chất của chip sợi nano vàng trong quá trình hoạt hóa bề mặt .... 49 3.3 Xác định cholesterol ................................................................................................. 52 3.3.1 Xác định cholesterol bằng chip hoạt hóa bởi cysteamine ...................................... 52 3.3.2 Xác định cholesterol bằng chip hoạt hóa bề mặt bởi DTSP .................................. 54 KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN .............................................................................. 57 • Kết luận ........................................................................................................................ 57 • Hướng phát triển .......................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 58 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan nội dung đề tài này do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện. Kết quả trình bày trung thực, chính xác. Đề tài này chưa được công bố trên bất kỳ phương tiện nào. Kết quả thực nghiệm do tác giả và nhóm nghiên cứu thực hiện. Mọi bảng biểu đồ thị, hình ảnh có được do chúng tôi xử lý kết quả thí nghiệm Xin cam đoan mọi thông tin là đúng sự thật, nếu có bất kỳ vấn đề gì tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm TP. HCM ngày 22 tháng 09 năm 2014 Học viên cao học Phạm Xuân Thanh Tùng Cán bộ hướng dẫn TS. Tống Duy Hiển iv Để hoàn thành đề tài này, tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn, TS. Tống Duy Hiển là người đã đưa tôi vào Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano hướng dẫn tôi từ những ngày đầu khập khiễng bước chân vào lĩnh vưc cảm biến sinh học và tạo mọi điều kiên thuận lợi trong quá trình thực hiện luận văn này. Xin cảm ơn giáo viên phản biện đã dành thời gian đọc, góp ý và đánh giá cho đề tài Xin cảm ơn trường Đại học Công nghệ ĐHQG HN và Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano ĐHQG TP. HCM đã hợp tác mở chuyê ngành công nghệ Vật liệu và Linh kiện Nano để tôi có điều kiện theo học Xin chân thành cảm ơn anh Phạm Văn Bình, chị Đặng Ngọc Thùy Dương, anh Phan Thanh Nhật Khoa, chị Lê Thị Thanh Tuyền là thành viên của nhóm nghiên cứu Biosensor thuộc PTN CNNN đã giúp đỡ tôi trong những vấn đề về chuyên môn cũng như quá trình làm thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn các anh chị em trong PTN CNNN đã giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn cũng như chia sẻ với tôi niềm vui khi thành công. Để hoàn thành luận văn này, không thể thiếu được sự giúp đỡ động viên từ cha mẹ và các thành viên trong gia đình tôi cũng như họ hàng đang sinh sống tại TP. HCM. Tôi xin dành tình cảm sâu sắc nhất cảm ơn mọi thành viên trong gia đình. Xin chân thành cám ơn! v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. Au: vàng ChOx: Cholesterol Oxidase CA: Cysteamine DTSP: Dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide ester). GAD: Glutaraldehyde CV: Cyclic voltammetry HDL: High density lipoprotein LDL: Low density lipoprotein VLDL: very low density lipoprotein SAM: Self assembly monolayer EIS: electrochemical impedance spectroscopy PECVD: plasma enhance chemical vapour deposition LPCVD: low pressure chemical vapour deposition RIE: reactive ion etching PVD: physical vapour deposition SEM: Scanning electron microscopy WE: working electrode CE: counter electrode RE: reference electrode PBS: phosphate buffer saline vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng I.1: Giới hạn hàm lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành. Bảng I.2: Enthanpi của một số phản ứng có enzyme xúc tác Bảng II.1: Thông số của quá trình quang khắc và chất lượng của cấu trúc tạo thành tương ứng. Bảng II.2: Tốc độ bốc bay theo dòng diện đốt. Bảng III.1: Kết quả đo điện trở từ khảo sát đặc trưng I-V của các sợi nano Au chế tạo. Điện thế quét 1 Volt, với bước quét 50 mV, chiều dài sợi thay đổi từ 5-1000 µm. Chiều ngang sợi la 50 nm, chiều dày 25 nm. vii DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Hình I.7: Đồ thị quét thế theo thời gian trong phép đo CV . Hình I.8: Quan hệ dòng-điện thế trong quét thế vòng thuận nghịch. Hình I.10: Đồ thị CV của quá trình oxi hóa bất thuận nghịch (A), giả thuận nghịch (B) và thuận nghịch (C). Hình III.4: Đặc trưng tính chất điện I-V của sợi nano Au có chiều rộng 50 nm, độ dày 25 nm, và chiều dài thay đổi từ 5 đến 500 µm. Điện thế một chiều được quét trong giá trị từ -1 volt đến + 1 volt, với bước quét 50 mV. Hình III.7: Đường quét CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch H2SO4 10 mM Hình III.8: Đường CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch K3Fe(CN)6 5mM trong PBS pH 4 trước và sau khi được hoạt hóa bởi cysteamine Hình III.9: đồ thị sự phụ thuộc của cường độ peak oxi hóa khử theo thời gian của chip Au/CA với các nồng độ cysteamine khác nhau khi quét trong dung dịch K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4 Hình III.10: Đường CV của chip sợi nano vàng sau mỗi bước hoạt hóa bề mặt trong dung dịch K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4 đối với chất hoạt hóa là cysteamine (A) và DTSP (B) Hình III.11: đường CV của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi cysteamine trong dung dịch cholesterol/PBS + 5%triton X-100 pH=7 ở các nồng độ cholesterol khác nhau từ 1 đến 7 mM (A) và đường chuẩn nồng độ - cường độ peak thu được từ đường CV (B) Hình III.12: Đường Lineweaver – Burke (A) và đường Hanes (B) của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi cysteamine Hình III.13: độ lặp lại của điện cực (A) và độ ổn định (B) với dung dịch cholesterol 3mM Hình III.14: đường CV của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi DTSP trong dung dịch cholesterol/PBS + 5%triton X-100 pH=7 ở các nồng độ cholesterol khác nhau từ 0.5 đến 9 mM (A) và đường chuẩn nồng độ - cường độ peak thu được từ đường CV (B) Hình III.15: Đường Lineweaver – Burke (A) và đường Hanes (B) của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi DTSP Hình III.16: độ lặp lại của điện cực (A) và độ ổn định (B) với dung dịch cholesterol 3mM viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình I.1: Cấu trúc hóa học của cholesterol Hình I.2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học Hình I.3: nguyên lý hoạt động chung của một cảm biến sinh học Hình I.4: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến áp điện Hình I.5: Sợi nano chế tạo bởi nhiều phương pháp khác nhau (A); Đơn sợi nano với kích thước 40-50 nm (B); Sợi nano với hai điện cực nối ra mạch điều khiển bên ngoài (C). Hình I.6: sự hình thành SAM từ sulfur hữu cơ Hình I.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm quét thế vòng tuần hoàn Hình II.1: Cấu trúc sợi nano Au trên đế silic chế tạo. Hình II.2: Quy trình chế tạo sợi nano vàng bằng kỹ thuật lắng đọng và ăn mòn dưới góc nghiêng Hình II.3: Thiết bị PECVD Plasmalab 80Plus, Oxford Instruments tại PTN CN Nano Hình II.4: Giao diện màn hình phần mềm PC 2000 dùng điều khiển thiết bị PECVD. Hình II.5: Thiết bị đo độ dày FilmTek 1000 tại PTN Công Nghệ Nano. Hình II.6: Hệ chiếu sáng dùng cho quá trình quang khắc quang học (optical lithography). Hình II.7: Hình SEM bề mặt các màng Au chế tạo bằng phương pháp bốc bay. (A) Màng có kích thước hạt nhỏ cỡ 10 nm. (B) Màng có kích thước hạt lớn cỡ 30 nm. Hình II.8: Hệ ăn mòn ion beam etching (Ionfab 300Plus. Oxford Instruments). Hình II.9: Hệ đo Autolab được sử dụng để khảo sát khả năng phát hiện cholesterol của sợi nano vàng chế tạo được tại PTN CNNN. Hình II.10: Quy trình hoạt hóa bề mặt và gắn kết enzyme Hình III.1: Hình SEM độ phân giải thấp của chíp silicon có sợi nano vàng, các đơn sợi được chế tạo cùng với điện cực nối riêng biệt nối ra mạch điều khiển ngoài (mạch điện tử, hệ đo). Hình III.2: Đơn sợi nano cùng các điện cực riêng biệt. Hình III.3: Chip sợi nano vàng dùng cho định lượng cholesterol Hình III.5: Cấu trúc 4 điện cực dùng xác định điện trở tiếp xúc của sợi nano. Hình III.6: Hình ảnh AFM 2 chiều (A) và 3 chiều (B) của sợi nano Au 1 MỞ ĐẦU Cholesterol là một chất béo steroid, mềm, màu vàng nhạt, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật. Nó được sản xuất hàng ngày trong gan, mỗi ngày từ 1,5g – 2g. Trong máu người, lượng cholesterol thường dao động trong khoảng từ 3.6 mM đến 7.8 mM, và trong cơ thể người khoẻ mạnh, tổng lượng cholesterol xấp xỉ 5.2mM. Tuy nhiên, đôi khi cơ thể lại sản sinh ra lượng cholesterol nhiều hơn mức cần thiết, tạo ra một lượng cholesterol dư thừa luân chuyển trong dòng máu và là tác nhân liên quan chặt chẽ với rất nhiều bệnh hiểm nghèo như: bệnh tim mạch vành, xơ cứng động mạch, nhồi máu cơ tim, bệnh nghẽn mạch máu não, rối loạn chuyển hóa lipid, tăng huyết áp,… Do đó xác định chính xác và khống chế nồng độ cholesterol trong máu ở mức cho phép là việc rất cần thiết và phải được thực hiện thường xuyên. Trong đề tài này, công nghệ chế tạo linh kiện nano (nanofabrication) sẽ được dùng để chế tạo sợi nano vàng trên đế silic có lớp cách điện SiO2/SiN. Sau đó, trên bề mặt của các sợi vàng này, enzyme cholesterol oxidase được cố định thông qua những nhóm chức năng như –SH, –CHO và –NH2 để tạo nên hệ kết hợp sợi nano vàng – enzyme, và tạo thành cảm biến sinh học, sử dụng cho việc định lượng cholesterol. Với hệ cảm biến nano sinh học này, cholesterol bị oxi hoá bởi cholesterol oxidase (ChOx) để thu được đồng thời hai sản phẩm là ketone và hydrogen peroxide (H2O2). Nồng độ H2O2 tạo ra sẽ được đo bởi phép đo điện hóa quét thế vòng tuần hoàn (CV– cyclic voltammetry), từ đó cho phép xác định được hàm lượng cholesterol tương ứng trong dung dịch, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế tạo một bộ cảm biến hoàn chỉnh để xác định nồng độ cholesterol toàn phần trong máu người. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cholesterol và cảm biến sinh học 1.1.1 Tổng quan về cholesterol 1.1.1.1 Cholesterol là gì? Cholesterol có tên gọi xuất phát từ tiếng Hi Lạp chole- (mật) và stereos (rắn), vì nó được phát hiện lần đầu ở dạng rắn trong sỏi mật. Cholesterol là một dạng chất béo có trong máu, có vai trò tạo nên lớp màng cho các tế bào, được hình thành một cách tự nhiên trong cơ thể hoặc do cơ thể hấp thu được qua ăn uống. Cholesterol có mặt ở tất cả các bộ phận trên cơ thể, không hòa tan trong máu mà lưu thông khắp nơi nhờ vào sự hỗ trợ của các chất “protein vận chuyển” (transporter protein). Cholesterol có nhiều loại khác nhau, thường gặp là ba loại có tác động tới sức khỏe đó là cholesterol HDL (High-density lipoprotein), cholesterol LDL (Low-density lipoprotein) và chất béo triglyceride. Trong khi cholesterol HDL được xem là tốt vì giảm được lượng chất béo dư thừa trong cơ thể bằng cách chuyển chúng từ hệ thống động mạch tới gan để xử lý và thải ra ngoài, thì cholesterol LDL bị xem là xấu do tích tụ nhiều ở động mạch khiến động mạch ngày càng hẹp đi, cản trở tuần hoàn máu, dễ dẫn đến các bệnh tim mạch cũng như nhiều sự cố khác. Lượng cholesterol trong máu cao hay thấp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, chế độ dinh dưỡng, béo phì, tuổi tác, giới tính, thói quen sinh hoạt… Lượng cholesterol trong máu cao sẽ dẫn đến tình trạng các chất béo dư thừa bám vào thành mạch máu, lâu ngày khiến chúng bị chai (bệnh xơ cứng động mạch) hoặc thu nhỏ lại, gây cản trở tuần hoàn máu, dẫn đến nguy cơ đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não. Hình I.1: Cấu trúc hóa học của cholesterol 3 Cholesterol được tổng hợp chủ yếu từ acetyl CoA theo đường HMG-CoA reductase ở nhiều tế bào/mô. Khoảng 20–25% lượng cholesterol tổng hợp mỗi ngày (~1 g/ngày) xảy ra ở gan, các vị trí khác có tỉ lệ tổng hợp cao gồm ruột, tuyến thượng thận và cơ quan sinh sản. Với một người khoảng 68 kg, tổng lượng cholesterol trung bình trong cơ thể khoảng 35g (35.000 mg). Trong một ngày lượng nội sinh trung bình khoảng 1000 mg và từ thức ăn trung bình khoảng 200 đến 300 mg. Sự di chuyển cholesterol trong cơ thể có tính chất tuần hoàn, nó được bài tiết ở gan qua mật đến cơ quan tiêu hóa. Khoảng 50% lượng cholesterol bài tiết được tái hấp thu ở ruột non vào hệ tuần hoàn. Phytosterols có thể cạnh tranh với cholesterol trong công tác tái hập thu của ruột vì vậy làm suy giảm độ tái hấp thu của cholesterol vào máu. [1-3] Một số thông tin cơ bản: - Công thức phân tử: C27H46O - Tên IUPAC: (3β)-cholest-5-en-3-ol - Tên khoa học: 2,15-dimethyl-14-(1,5-dimethylhexyl)tetracyclo [8.7.0.02,7.011,15] heptacos -7-en-5-ol - Khối lượng phân tử: 386.65 g/mol - Hình dạng: tinh thể rắn màu trắng - Khối lượng riêng: 1.052 g/cm3 - Nhiệt độ nóng chảy: 148-150ºC - Nhiệt độ sôi: 360 ºC (phân hủy) - Độ tan trong nước: 0.095mg/L - Tan trong các dung môi: acetone, benzene, chloroform, ethanol, ether, hexan, methanol, isopropyl myristate. 1.1.1.2 Vai trò của cholesterol trong cơ thể Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic acid tại gan, cholic acid sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối mật có tác dụng xác tác trong quá trình tiêu hóa và hấp thụ các chất béo. - Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường: + Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormone vỏ tuyến thượng thận, + Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng, + Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone, + Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào, + Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì da, cùng với các chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:  Kháng lại việc hấp thu các chất hòa tan trong nước  Kháng tác động của nhiều hóa chất  Ngăn cản quá trình bốc hơi nước từ da 4 Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể con người khi hàm lượng của nó ở mức phù hợp. Ở người trưởng thành, cholesterol toàn phần ở mức bình thường vào khoảng 4 – 5.6 mmol/L. Những gười có mức cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau. 1.1.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cholesterol tới sức khỏe Cholesterol tồn tại trong mọi tế bào của cơ thể và rất cần thiết trong việc xây dựng các tế bào khỏe mạnh và kích thích tố. Tuy nhiên, cholesterol cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não...Vấn đề về tim nghiêm trọng có thể là kết quả của hàm lượng cholesterol trong cơ thể quá cao. Cholesterol cao không phải là kết quả của việc ăn các loại thực phẩm chứa nhiều chất béo trong một vài ngày, vài tuần hoặc thậm chí một vài tháng, nhưng nếu sau nhiều năm ăn uống như vậy thì hàm lượng cholesterol cao là điều khó tránh. Có hai loại cholesterol là cholesterol tốt và xấu. Cholesterol xấu (LDL), là sự tích tụ của cholesterol có thể gây ra tắc nghẽn động mạch. Cholesterol tốt (HDL), giúp ngăn ngừa sự tích tụ cholesterol trong động mạch trở về gan. Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim mạch ngày càng gia tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước. Ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu người bị bệnh tim, trong số này có khoảng 1,5 triệu người bị đau tim và một phần ba số này chết. Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau tim không hề có triệu chứng hay dấu hiệu cảnh báo trước. Tần số đàn ông Mỹ bị chết vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số, còn ở Anh, tỷ suất này là khoảng 250/100.000 dân số. [4-5] Cholesterol toàn phần trong máu (mmol/L [mg/dL]) <5.2 (200) Mong muốn 5.2 – 6.1 (200 – 239) Giới hạn cao ≥6.2 (240) Cao LDL cholesterol (mmol/L [mg/dL]) <2.6 (100) Tối ưu 2.6 – 3.3 (100 – 129) Mong muốn 3.4 – 4.0 (130 – 159) Giới hạn cao 4.1 – 4.8 (160 – 189) Cao 5 ≥4.9 (190) Rất cao HDL Cholesterol (mmol/L [mg/dL]) < 1.0 (40) Thấp 1.0 – 1.5 (40 – 59) Mong muốn ≥ 1.6 (60) Cao Triglyceride (mmol/L [mg/dL]) < 1.7 (150) Tối ưu 1.7 – 2.2 (150 – 199) Mong muốn 2.3 – 4.4 (200 – 399) Cao ≥ 4.5 (400) Rất cao Bảng I.1: Giới hạn hàm lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành 1.1.1.4 Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu Để giảm cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau như sử dụng các loại thuốc có chứa chất simvastatine và chất ezetimibe hay các loại thuốc có chứa statin, nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý. Do sở thích ăn uống và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực phẩm có hàm lượng cholesterol cao như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất béo (thịt gà, heo, cá) và đặc biệt là trứng. Có một số người ăn một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả mà nó sẽ gây ra. Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể, tuy nhiên chúng ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng và giảm lượng cholesterol trong máu nhằm tránh các bệnh về tim mạch. 1.1.2 Tổng quan về cảm biến sinh học 1.1.2.1 Khái niệm cảm biến sinh học Cảm biến sinh học (Biosensor) thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện. Đầu tiên, Cảm biến sinh học sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong cảm biến sinh học, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích 6 gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho cảm biến sinh học. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích. Hình I.2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học 1.1.2.2 Đặc điểm, yêu cầu của cảm biến sinh học Để định lượng, cảm biến sinh học phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt. Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng cảm biến sinh học trong cùng một mẫu phân tích. Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai. Tính chọn lọc của cảm biến sinh học thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng. Một cảm biến sinh học có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp. Tính nhạy cảm của cảm biến sinh học thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay đổi về tín hiệu trả lời: Da = sDm Trong đó Da: Độ dao động về biên độ của dòng ra Dm: Độ dao động về biên độ của dòng vào s: Độ nhạy cảm của cảm biến sinh học, đặc trưng cho mức độ phù hợp của cảm biến sinh học trong một ứng dụng cụ thể. 7 Đối với Cảm biến sinh học đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích. Theo định luật Nernst: Da = sD(logc). Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm. Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian. Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ. 1.1.2.3 Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực, màng ngoài (external membrane) của cảm biến sinh học sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua. Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được. Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau:  Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua các phản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ).  Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích.  Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học.  Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được. Hình I.3: nguyên lý hoạt động chung của một cảm biến sinh học Chất cần phân tích Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu) Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài. Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng.[6-8] 8 1.1.2.4 Phân loại cảm biến sinh học a. Cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến đo điện thế Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện thế không đổi). Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực là hàm của hoạt độ các ion trong dung dịch điện phân nơi đặt điện cực (điều kiện hoạt động của điện cực đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người ta gọi nó là điện cực có dòng điện bằng không). Điện thế này được xác định theo phương trình Nerst: 𝐸 = 𝐸0 + 𝑅𝑇 𝑎1 × ln 𝑛𝐹 𝑎2 Trong đó: Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn; R: Hằng số khí; T: Nhiệt độ tuyệt đối; F: hằng số Faraday; N: số điện tử trao đổi của cơ chất; a1, a2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực. Cảm biến đo dòng điện Cảm biến đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh). Mật độ của các hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực. Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực. Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo. Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I= f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ của hạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo. Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau:  Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất qua màng  Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm dần, do đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ những vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là cần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài mm).  Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan (cảm biến thế hệ 1). Để hạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch 9 đến kết quả phân tích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tử mà sử dụng các chất trung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực (cảm biến thế hệ 2). Các chất vận chuyển điện tửtrung gian có thể là ion Fe3+, Nmethylphenazinium (NMP) hoặc tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate. b. Cảm biến nhiệt (calorimetric biosensor) Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệt năng và người ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đo nhiệt (điện cực đo nhiệt), từ đó sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu. Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn. Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tới 4-5 enzym). Cơ chất Enzyme xúc tác -DH, kJ/mol Hydrogen peroxide Catalase 100.4 Cholesterol Cholesterol Oxidase 52.9 Clucose Glucose Oxidase 80.0 Ure Urease 6.6 Uric Acid Uricase 49.1 Pennicilin G Pennicilinase 67 Saccharose Invertase 20 Bảng I.2: Enthanpi của một số phản ứng có enzyme xúc tác c. Cảm biến đo quang (Optical biosensor) Cảm biến đo quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân tích. Nguyên tắc hoạt động: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu. Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzym. Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang. Nó có khả năng chỉ báo những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợi dẫn. Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được đo. 10 d. Cảm biến áp điện (Piezoelectric biosensor) Nguyên lý của loại cảm biến này dựa vào sự dao động của các tinh thể. Các chất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng hợp…dao động khi chịu tác động của từ trường. Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng. Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay giải hấp từ bề mặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể. Đo tần số dao động sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo. Tần sốdao động được tính theo công thức: 𝐾𝑓 2 ∆𝑚 ∆𝑓 = 𝐴 Trong đó ∆f là chênh lệch tần số dao động (Hz), ∆m là chênh lệch khối lượng của chất hấp thu (g), K là hằng số đặc trưng cho sự dao động của tinh thể, phụ thuộc vào bề dày và độ nứt của tinh thể, A là diện tích bề mặt hấp thu (cm2). Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất phosphate hữu cơ. Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn kìm hãm enzym xholinesterase. Ưu điểm: Cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền Nhược điểm: Không dùng phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí. Hình I.4: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến áp điện e. Cảm biến miễn dịch (Immunobiosensor) Cảm biến miễn dịch hoạt động dựa trên tính chất kháng nguyên – kháng thể, tức là các kháng thể phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên sinh ra nó.