Tài liệu Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên transistor hiệu ứng trường sợi silic và ứng dụng ban đầu trong phát hiện tế bào lưu chuyển của ung thư vú

iii MỤC LỤC CHƢƠNG 1: 1.1 TỒNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SiNW FET ................................................ 1 ĐẠI CƢƠNG VỀ CTC TRONG UNG THƢ VÚ .................................................. 1 1.1.1 Khái niệm về CTC. .......................................................................................... 1 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu CTC: ................................................................................ 1 1.1.3 Các phƣơng pháp phát hiện CTC .................................................................... 2 1.1.4 Ý nghĩa lâm sàng của CTC .............................................................................. 6 1.2 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CẢM BIẾN SINH HỌC SiNW FET ..................... 8 1.3 PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET ............................................................. 10 1.3.1 Chế tạo sợi nano Silic bằng phƣơng pháp Top Down (TD) .......................... 10 1.3.2 Chế tạo sợi nano bằng phƣơng pháp Bottom Up (BU) ................................. 15 1.4 ỨNG DỤNG CỦA CẢM BIẾN SiNW FET ........................................................ 16 CHƢƠNG 2: 2.1 CHẾ TẠO CẢM BIẾN SiNW FET ........................................................... 17 CHẾ TẠO SiNW FET .......................................................................................... 17 2.1.1 Wafer: ............................................................................................................ 21 2.1.2 Oxy hóa tạo màng SiO2 ................................................................................. 21 2.1.3 Tạo màng Si3N4 ............................................................................................. 21 2.1.4 Quang khắc (photolithography) ..................................................................... 22 2.1.5 Ăn mòn khô lớp Si3N4 ................................................................................... 22 2.1.6 Tẩy lớp photoresist ........................................................................................ 23 2.1.7 Ăn mòn ƣớt lớp SiO2 ..................................................................................... 23 2.1.8 Ăn mòn dị hƣớng tạo sợi Silic ....................................................................... 23 2.1.9 Tẩy lớp Si3N4 ................................................................................................. 24 2.1.10 Ăn mòn SiO2 hình thành sợi Silic .................................................................. 24 2.1.11 Chế tạo điện cực ........................................................................................... 24 2.1.12 Thụ động bề mặt điện cực ............................................................................. 25 2.2 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT SỢI NANO ......................................................... 28 2.2.1 Biomarkers .................................................................................................... 28 2.2.2 Thụ thể ........................................................................................................... 29 2.2.3 Chất kết nối (Linker) ..................................................................................... 29 CHƢƠNG 3: ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CẢM BIẾN SAU KHI CHẾ TẠO.................. 34 3.1 TÍNH CHẤT HÌNH THÁI ................................................................................... 34 3.2 TÍNH CHẤT ĐIỆN: ............................................................................................. 35 iv CHƢƠNG 4: ỨNG DỤNG BAN ĐẦU CỦA SiNW FET TRONG PHÁT HIỆN TẾ BÀO LƢU CHUYỂN CỦA UNG THƢ VÚ.................................................................. 41 4.1 CHUẨN BỊ TẾ BÀO ............................................................................................ 41 4.2 CHUẨN BỊ HỆ ĐO .............................................................................................. 42 4.3 KẾT QUẢ ĐO PHÁT HIỆN TBUTV TRONG DUNG DỊCH ĐỆM .................. 44 4.4 NGHIÊN CỨU, SOI TẾ BÀO BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG ........ 47 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ................................................. 50 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1-1.(a) Cấu tạo của một cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc transistor hiệu ứng trƣờng sợi Silic. Hai điện cực nguồn và máng đƣợc nối với nhau qua kênh dẫn sợi Silic kích thƣớc nanomét. Độ dẫn qua sợi đƣợc điều chỉnh bằng thế điện áp vào cực cổng ở đế Silic. (b) Sự thay đổi tính cƣờng độ dòng điện chạy qua sợi Si loại P khi có các phần tử bị bắt lại trên sợi. Dòng điện giảm khi đối tƣợng mang điện tích dƣơng, cùng dấu với điện tích hạt tải chính trong sợi, làm dòng điện qua sợi giảm. Trong khi đối tƣợng mang điện tích âm bị bắt làm dòng điện tăng lên ............................................................................ 8 Hình 1-2. Chíp SiNW FET gồm nhiều sợi Si đặt song song nhau, mỗi sợi đƣợc gắng một phần tử khác nhau nhằm phát hiện những đối tƣợng khác nhau, nên cảm biên có thể đo đồng thời nhiều thông số khác nhau ...................................................................................... 9 Hình 1-3. Độ dài sợi Silic và độ rộng của vùng chứa sợi và chất làm thụ động hóa bề mặt là những thông số cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET ..................................................... 10 Hình 1-4. Ba quá trình của cơ chế ăn mòn là quá trình khuếch tán, quá trình ăn mòn, và quá trình thải sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài. ...................................................... 11 Hình 1-5. Ba cơ chế ăn mòn: a- đẳng hƣớng, b- dị hƣớng, c- siêu dị hƣớng ........................... 12 Hình 1-6. Quy trình lithography dùng trong phƣơng pháp chế tạo sợi Silic ........................... 13 Hình 1-7. Quy trình chế tạo sợi nano Silic bằng kỹ thuật SNAP. (a) cấu trúc siêu mạng GaAs/AlxGa1-xAs. (b) các cạnh của siêu mạng đƣợc ăn mòn khác nhau. (c) kim loại bạch kim (Pt) đƣợc phủ lên các cạnh của siêu mạng. (d) chập các cạnh có kim loại đã phủ của siêu mạng lên wafer SOI đã có trƣớc lớp polyme, khi đó lớp kim loại đơn tinh thể sẽ gắn với lớp Silic đơn tinh thể của wafer. (e) ăn mòn siêu mạng, chỉ còn lại lớp kim loại trên đế wafer. (f) lớp kim loại đóng vai trò là mặt nạ khi ăn mòn khô hình thành cấu trúc sợi.(g) cuối cùng các sợi kim loại bị tẩy đi, hiện ra các sợi Silic đồng đều và định hƣớng cao ................................................................................................................ 15 Hình 2-1. Wafer SOI có cấu trúc 3 lớp, đế là lớp bán dẫn Silic, giữa là lớp cách điện SiO2, trên cùng là lớp Silic - lớp này dùng đề chế tạo sợi SiNW FET.......................................... 18 Hình 2-2. Lớp SiO2 đƣợc tạo trên lớp Silic ban đầu có chiều dày 40nm. ................................ 18 Hình 2-3. Lớp Si3N4 25nm đƣợc hình thành trên cầu trúc lớp SiO2 ......................................... 18 Hình 2-4. Quá trình quang khắc. (a) khi lớp photoresit đƣợc phủ trên lớp Si3N4;(b) là những nơi photoresist bị chiếu sáng sẽ có màu tím; (c) những phần màu tím bị rửa trôi trong dung dịch thuốc hiện (developer). .............................................................................. 19 Hình 2-5. Lớp Si3N4 bị ăn mòn tại những vùng lớp photoresist đã đƣợc tẩy trong khi những vùng không bị tầy lớp Si3N4 vẫn còn giữ lại. .................................................................. 19 Hình 2-6. Cấu trúc sau khi rửa bỏ lớp photoresist .................................................................... 19 Hình 2-7. Ăn mòn lớp SiO2 40nm, sau quá trình ăn mòn thu đƣợc cấu trúc hình bên phải ... 20 Hình 2-8. (a) cơ chế ăn mòn dị hƣớng wafer Silic <100> trong dung dịch bazơ của kim loại kiềm; (b) kết quả sau khi ăn mòn dị hƣớng tạo sợi Silic .............................................. 20 Hình 2-9. Sau khi tầy lớp Si3N4 phía trên................................................................................. 20 vi Hình 2-10. (a) mặt cắt sợi chế tạo đƣợc, ( b) nhìn nghiêng từ trên cao với nhiều sợi song song nhau, hai đầu sợi là vùng sẽ phủ làm điện cực. ........................................................... 21 Hình 2-11. Bƣớc chế tạo điện cực gồm sáu bƣớc nhỏ: (a) bƣớc phủ photoresist, (b) chiếu ánh sáng làm thay đổi tính chất của photoresist, (c) development rửa trôi những phần photoresist bị chiếu, (d) phủ lớp đệm điện cực bằng kim loại Ti mục đích tạo tiếp xúc ohmic, (e) phủ kim loại Platin làm điện cực, (f) liff off-tẩy kim loại trên lớp photoresist và photoresist đó. ................................................................................................................. 25 Hình 2-12. Các bƣớc thực hiện khi chế tạo lớp cách điện thụ động điện cực. (a) mặt bên của sợi đã chế tạo, (b) phủ photoresist, (c) chiếu ánh sáng lên vùng photoresist cần tẩy đi, (d) development tẩy lớp photoresist bị chiếu, (e) phủ lớp cách điện SiO2 bằng phƣơng pháp e-beam, (f) liff off hình thành cầu trúc có vách ngăn cách điện giữa hai điện cực ................................................................................................................................ 26 Hình 2-13. Transistor đƣợc chế tạo có dạng nhƣ hình vẽ. Vùng chính giữa sợi Silic có chiều dài 10µm, chiều rộng 2µm là vùng sẽ đƣợc chức năng bề mặt làm cảm biến. Hai đầu điện cực lộ ra để cắm nguồn điện, hai lớp cách điện hai bên điện cực ngăn chặn dòng rò ................................................................................................................................. 27 Hình 2-14. Quy trình thực hiện chức năng hóa bề mặt sợi Si bằng phƣơng pháp xử lý trực tiếp trên bề mặt Si tinh khiết. ............................................................................................... 31 Hình 3-1. Hình ảnh của SiNW FET chế tao đƣợc. (a) Hình tổng thể với độ phóng đại 5000 lần. Chíp có 8 transistor, mỗi bên có 4 transistor, bao gồm các loại chứa 8 sợi, 4 sợi, 2 sợi và 1 sợi Silic. (b) Transistor có 8 sợi, (c) Transistor có 4 sợi Silic, (d) Transistor có 2 sợi Silic, và (e) Transistor có 1 sợi Silic. Chiều dài của các sợi trong khoảng 9 ± 0.5 µm và chiều rộng trong khoảng 1.5 ±0.15 µm, khoảng cách các sợi trong một transistor là 2µm. ................................................................................................................................. 34 Hình 3-2. Hệ đo đặc trƣng điện Aligent 4155C. Hình bên trái là hệ probstation (Suss , Germany) là nơi đặt mẫu cần đo. Hệ này gồm mâm để đặc mẫu, bốn SMU, kính hiển vi và các probe để nối các điện cực của sợi nano. Bên phải là giao diện làm việc trang bị phần mềm kết nối Labview. Dòng điện chạy qua soi nano Si đƣợc ghi lại bằng máy tính thông qua phần mềm Agilent Desktop EasyEXPERT......................................................... 35 Hình 3-3. Đặc trƣng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 1 sợi Si .......................... 36 Hình 3-4. Đặc trƣng I-V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 2 sợi Silic ....................... 37 Hình 3-5. Đặc trƣng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 4 sợi Silic. ..................... 37 Hình 3-6. Đặc trƣng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 8 sợi Silic ...................... 38 Hình 3-7. Đặc trƣng bias của các SiNW FET vời (a) là kênh dẫn một sợi, (b) là kênh dẫn hai sợi, (c) kênh dẫn bốn sợi, (d) kênh dẫn 8 sợi ................................................................. 39 Hình 4-1. Hệ giữ chíp có chứa các kênh dẫn vi chất lỏng (microfluidics) và hệ hỗ trợ để tích hợp SiNW FET với thiết bị đo điện bên ngoài, sử dụng để thực hiện các thí nghiệm trong phát hiện tế bào ung thƣ vú bằng cảm biến SiNW FET. ............................................ 42 Hình 4-2. Sự phụ thuộc dòng điện của SiNW FET (loại chứa tám sợi SiNW) vào thời gian thí nghiệm, trong quá trình đó dung dịch chứa TBUTV đƣợc bơm vào ............................. 44 vii Hình 4-3. Cƣờng độ dòng điện của SiNW FET thay đổi từ 9nA lên 25nA khi cho dung dịch chứa tế bào UTV. Dòng điện sau đó đạt giá trị bão hòa xấp xỉ 30nA ......................... 45 Hình 4-4. Kết quả lăp lại trong phép đo phát hiện TBUTV. Dòng điện qua SiNW FET trong thời gian chƣa có dung dịch chứa tế bào ổn định ở mức thấp, khi cho dung dịch vào dòng tăng lên khoảng 20nA sau đó giảm nhẹ và đều về khoảng 30nA ........................ 46 Hình 4-5. Sự thay đổi dòng điện của SiNW FET khi đo trong môi trƣờng buffer PBS 0.1M . 47 Hình 4-6. Hình ảnh tế bào phân bố trên bề mặt chíp SiNW FET đƣợc nhìn qua KHV huỳnh quang độ phóng đại 5000 lần. Các đốm sáng là các tế bào UTV phát sáng, các đốm nhỏ trong hình vuông trắng là sợi Silic. Với thiết kế và kích thƣớc đang đƣợc sử dụng của sợi Silic nhƣ quan sát đƣợc trên hình cho ta thấy xác suất để tế bào nằm vào vùng làm việc (vùng có khả năng kết cặp với các kháng thể trên sợi SiNW) là không lớn. ....................................................................................................................................... 48 viii MỞ ĐẦU Cảm biến sinh học là một lĩnh vực đã đƣợc nghiên cứu từ lâu và hiện vẫn đang đƣợc quan tâm đầu tƣ nghiên cứu để phát triển do có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực quan trọng. Ví dụ, riêng cảm biến sinh học đo glucose trong máu đã có thị trƣờng khoảng 6 tỷ USD/năm. Mục đích của mọi hệ cảm biến sinh học nhằm phát hiện đƣợc một đối tƣợng sinh học cần phân tích nào đó. Quá trình cảm biến dựa trên một sự gắn kết đặc hiệu với độ chọn lọc cao hoặc phản ứng của chất cần phân tích với một phần tử nhận diện đã đƣợc biết trƣớc. Trong các phƣơng pháp phân tích không phá hủy mẫu, phép phân tích dựa chủ yếu vào sự thay đổi tính chất vật lý của cảm biến khi có sự bắt cặp giữa chất phân tích và chất thử hoặc có sản phẩm mới tạo thành. Nhu cầu khoa học ngày nay, không những cần phát hiện một chất mà đòi hỏi phân tích tổng hợp cùng lúc nhiều chất khác nhau. Vì thế yêu cầu tích hợp một lƣợng lớn các cảm biến trong một quy trình phân tích tối ƣu là một đòi hỏi thiết thực. Trong nền công nghệ máy vi tính, một thành tựu đột phá là sự chế tạo thành công mạch tích hợp, gồm các transistor đƣợc chế tạo đồng thời và kết hợp lại với nhau thành một chíp duy nhất. Tƣơng tự với mô hình trong công nghệ máy tính, nhiều cảm biến sinh học khác nhau dựa trên cấu trúc transistor của sợi bán dẫn Silic (Si), có khả năng phát hiện đồng thời nhiều chất phân tích khác nhau, đƣợc chế tạo đồng thời với nhiều transistor tích hợp thành một đơn chíp có thể phát hiện đồng thời nhiều thông số mong muốn. Để thực hiện quá trình cảm biến, các transistor trong một chíp cần một bộ phận chuyển đổi tín hiệu từ các quá trình phản ứng sinh hóa, các quá trình bắt cặp đặc biệt của chất phân tích thành tín hiệu điện có thể ghi nhận đƣợc. Chính vì có mối liên hệ này đòi hỏi ta phải nghiên cứu sự đáp ứng của chất bán dẫn Si, chất đang đƣợc sử dụng chủ yếu để chế tạo các linh kiện trong công nghệ máy tính, với môi trƣờng sinh hóa xung quanh nó. Tại bề mặt của chất bán dẫn, điện tích xuất hiện do thế điện của các phân tử sinh học bắt cặp trên bề mặt hay môi trƣờng lận cận gây ra. Điện tích này ảnh hƣởng đến độ dẫn của chất bán dẫn. Sự thay đổi về độ dẫn có thể dễ dàng đo đƣợc bằng cách bố trí hợp lý các hệ đo có độ chính xác cao. Transistor có cấu tạo gồm ba điện cực: cực nguồn, cực máng và cực cổng. Bằng cách thay đổi điện thế cực cổng có thể tăng hoặc giảm điện tích chạy qua cực nguồn và cực máng. Transistor với tính chất nhƣ thế gọi là transistor hiệu ứng trƣờng (Field Effect Transistor-FET). Dòng điện trong transistor với một hiệu điện ix thế không đổi có thể đƣợc điều khiển bằng cách thay đổi điện thế tại cực cổng, ngoài ra nó còn có thể thay đổi bởi các điện tích của các thành phần hóa học xung quanh bề mặt chất bán dẫn (tính chất này đƣợc ứng dụng để làm cảm biến). Những yêu cầu của loại transistor làm cảm biến sinh học khác so với loại dùng trong các mạch logic của máy tính. Chất bán dẫn, làm bộ phận cảm biến của transistor, phải đƣợc lộ ra để tiếp xúc với môi trƣờng chứa chất phân tích. Bộ phận cảm biến này phải đủ nhỏ và phải có diện tích bề mặt lớn để làm tăng độ nhạy của cảm biến. Vì độ nhạy phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ điện tích bề mặt so với tổng điện tích. Dựa trên các yêu cầu đó, transistor hiệu ứng trƣờng dùng sợi Silic là một lựa chọn tốt nhất, vì công nghệ chế tạo mạch tích hợp làm các transistor trong công nghệ máy tính có từ lâu, nên ta có thể áp dụng công nghệ này làm transistor cảm biến. Kể từ khi transistor hiệu ứng trƣờng sợi Silic (SiNW FET) đƣợc chế tạo và ứng dụng làm cảm biến sinh học vào 2001 bởi Y Cui (http://www.stanford.edu/group/cui_group/) và Lieber (http://cmliris.harvard.edu/), SiNW FET đã thu hút nhiều nhóm và viện nghiên cứu trên thế giới tập trung đầu tƣ, nghiên cứu: Peidong Yang: http://www.cchem.berkeley.edu/pdygrp/main.html; Health groupCaltech: http://www.its.caltech.edu/~heathgrp/Publications.html#; Viện Công Nghệ Nano MESA http://www.mesaplus.utwente.nl/; Viện nghiên cứu A-star Singapore: http://www.a-star.edu.sg; Autralia Research Council: (http://www.materials.com.au/); Đại học KTH Thụy Điển http://www.kth.se; Nanosens: http://www.nanosens.nl/product.htm Transistor hiệu ứng trƣờng dựa trên sợi Silic kích thƣớc nano là thiết bị hứa hẹn nhiều ứng dụng tìm năng trong y dƣợc học. Thực tế những thiết bị này cho thấy khả năng ghi nhận đƣợc nhiều chất phân tích nhƣ chuỗi DNA, dấu hiệu sinh học (biomarker), và các đối tƣợng lớn hơn nhƣ virus… Có nhiều loại cảm biến sinh học khác nhau đã đƣợc thiết kế và chế tạo trong suốt thập kỷ vừa qua, sử dụng nhiều vật liệu nano khác nhau để làm thành phần cảm biến nhƣ: Thanh dao động, chấm lƣợng tử, thanh nano, sợi nano, dây nano, nanogap và màng kích thƣớt nano. Một số thiết bị cảm biến này nhƣ loại dựa trên thanh dao động (cantilevers) và chấm lƣợng tửquantum dot, có nhiều ƣu điểm nhƣ: siêu nhạy, thời gian đáp ứng nhanh. Nhƣng nó đòi hỏi kết hợp với những thành phần quang học để có thể chuyển các hiện tƣợng gắn kết bề mặt thành các tính hiệu có thể ghi nhân nên chí phí hoạt động rất cao. Ngƣợc lại, các cảm biến hoạt động trên nguyên tắc hiệu ứng trƣờng (FET) cho ngay tín hiệu dựa trên sự tƣơng tác bề mặt chất phân tích mà không cần kết hợp với bất x kỳ thành phần quang học nào khác. Những cảm biến này dựa trên tính chất điện của vật liệu bán dẫn làm cảm biến, chẳng hạn độ dẫn điện của nó để cho tín hiệu đầu ra. Cảm biến dựa trên cấu trúc FET hứa hẹn là cảm biến có tính cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu phân tích sinh học bằng cách cung cấp thông tin trực tiếp, cụ thể, tức thì, siêu nhạy và có tính linh hoạt cao để ghi nhận đƣợc phân tử sinh học mong muốn. Bên cạnh đó, SiNW FET cũng đƣợc dùng kiểm soát hoạt tính các enzyme và nghiên cứu cơ chế của các phân tử thuốc tiềm năng. Phát hiện các chất phân tích với độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong một thời gian hợp lý là một lợi thế đang dần thành hiện thực của SiNW FET. Ung thƣ vú (UTV) là một trong những loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới, và là ung thƣ có tỉ lệ tử vong cao nhất ở phụ nữ1. Do chƣa có kháng nguyên đặc hiệu nên việc phát hiện ung thƣ vú tiền di căn là việc nhiều khó khăn. Trong khi đó các tế bào ung thƣ dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells - CTC) tuy mới thu hút đƣợc sự quan tâm của giới khoa học trong thời gian gần đây, nhƣng việc định tính và định lƣợng CTC có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phát hiện sớm ung thƣ, cũng nhƣ đánh giá kết quả của phƣơng pháp điều trị và tiên lƣợng thời gian sống của bệnh nhân.2 Chính vì thế, chúng tôi chọn đề tài chế tạo cảm biến dựa trên cấu trúc SiNW FET để ứng dụng phát hiện tế bào ung thƣ vú dịch chuyển trong máu. Đây là một đề tài có liên quan đến rất nhiều lĩnh vực khác nhau từ vật liệu nano và chế tạo linh kiện kích thƣớc nano, vật lý, hóa học, sinh học và y học. Đồng thời sử dụng cảm biến SiNW FET để phát hiện CTC vẫn là lĩnh vực còn hoàn toàn mới trên thế giới nên cũng chƣa có kết quả để tham khảo, đối chiếu với kết quả chúng tôi đạt đƣợc. Do đó nhiệm vụ đặt ra trong đề tài này là: chế tạo thành công chíp SiNW FET, sau đó ứng dụng phát hiện tế bào dịch chuyển (CTC) của ung thƣ vú trong dung dịch nuôi cấy với nồng độ tế bào cao. Từ đó đánh giá tính chất, khả năng phát hiện của chíp cảm biến chế tạo đƣợc. Các kết quả ban đầu này là tiền đề quan trọng cho những bƣớc tiếp theo nhằm hoàn thiện hƣớng nghiên cứu còn rất mới và nhiều tiềm năng này, tiến tới việc sử dụng cảm biến SiNW FET trong phát hiện CTC trong mẫu máu thực sau. Nội dung đề tài gồm hai phần chính. [1] Chế tạo chíp cảm biến dựa trên cấu trúc SiNW FET; [2] Ứng dụng ban đầu trong phát hiện tế bào CTC của ung thƣ vú trong dung dịch nuôi cấy. 1 CHƢƠNG 1: TỒNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SiNW FET 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ CTC TRONG UNG THƢ VÚ 1.1.1 Khái niệm về CTC. Năm 1869 Thomas Ashworth lần đầu tiên phát hiện ra tế bào ung thƣ dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells-CTC). CTC là các tế bào ung thƣ lƣu chuyển trong quá trình tuần hoàn máu, nó xuất phát ra từ các khối u sơ khởi hoặc từ các tế bào di căn ban đầu. Nó biểu hiện khi bệnh nhân bị các loại ung thƣ di căn khác nhau nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến và ung thƣ đại trực tràng... CTC di chuyển trong máu, quá trình phát tán của CTC tới các cơ quan trong cơ thể đƣợc xem là mầm móng phát sinh các khối u mới cũng nhƣ nguyên nhân gây di căn3. CTC tồn tại trong máu đã đƣợc biết từ lâu nhƣng thời gian gần đây, với sự phát triển của công nghệ micro và nano, phát triển các thiết bị phân tích tƣơng thích về kích thƣớc và với độ nhạy, chúng ta mới có thể nghiên cứu về CTC hiệu quả. Nhiều công trình chứng minh rằng nồng độ CTC trong máu có liên quan mật thiết tới tình trạng ung thƣ, các giai đoạn ung thƣ, các thông tin liên quan khác đến ung thƣ. Số lƣợng CTC đóng vai trò là các dấu hiệu sinh học quan trọng, là một trong các yếu tố tiên lƣợng chính xác quá trinh di căn… 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu CTC: Năm 1869 Thomas Ashworth phát hiện ra tế bào ung thƣ dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells-CTC) của một bệnh nhân nam bị ung thƣ di căn4. Ông khẳng định rẳng: “những tế bào giống hệt các tế bào ung thư của nó đang tồn tại trong máu có thể là tín hiệu cho biết trạng thái, nguồn gốc của nhiều khối u tồn tại trong một bệnh nhân”. Đến những năm 1990 các bác sĩ mới nhận thấy đƣợc lợi ích của CTC trong chẩn đoán nhờ những nghiên cứu chứng tỏ các tế bào ung thƣ mẹ đã xuất hiện trong tủy xƣơng trƣớc khi di căn xuất hiện. Tuy nhiên phát hiện CTC trong máu là một việc rất khó khăn và nhiều thách thức, đặc biệt chỉ dùng những thiết bị truyền thống nhƣ kính hiển vi, vì kích thƣớc CTC tƣơng đƣơng với kích thƣớc các tế bào bạch cầu, nhƣng nộng độ thì của nó lại rất thấp, thƣờng từ khoảng 1-10 tế bào/mL. Bênh cạnh đó sự biểu hiện của CTC trong máu là một quá trình gián đoạn, nên việc ghi nhận CTC sẽ không đồng nhất. Tất cả các CTC di chuyển trong máu không cùng định sứ tại một cơ quan nào vì phần lớn CTC sẽ bị chết trong quá trình tuần hoàn máu. Tuy vậy vẫn có một hoặc một số rất ít các tế bào này sống sót, khi gặp điều kiện thuận lợi nó phát triển và sinh sôi để hình thành các khồi u mới. Trong ung thƣ, có các tế bào khối u cứng, xuất phát từ các tế bào biểu mô chiếm tới 80% các ca ung thƣ đƣợc chẩn đoán, CTC thƣờng đƣợc phân biệt bằng các dấu hiệu liên quan đến biểu 2 mô của chính nó. Các dấu hiệu này có thể dùng để phát hiện CTC và có thể nghiên cứu cơ chế di căn ung thƣ thậm chí ở mức độ tế bào, đặc biệt trong máu và trong tủy xƣơng của bệnh nhân. Phát hiện sự tồn tại của CTC trong máu giúp phát hiện sớm ung thƣ vài năm trƣớc khi ung thƣ khởi phát di căn, và tăng khả năng đánh giá rủi ro và giúp đƣa ra những y lệnh điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Những tế bào này có rất nhiều tiềm năng cho ta một phƣơng pháp mới để điều trị ung thƣ, đó là can thiệp và tiêu diệt các tế bào CTC. Để phản ánh sự phát triển của lĩnh vực nghiên cứu về CTC, phát hiện CTC đã đƣợc giới thiệu trong hệ thống phân chia giai đoạn ung thƣ quốc tế và năm 2007 Hiệp Hội Ung Thƣ Lâm Sàn Hoa Kỳ khuyến cáo biểu hiện CTC là một dấu hiệu phát hiện ung thƣ vú. Những hiểu biết về CTC giúp kiểm soát quá trình di căn do CTC phát tán, nên sẽ có ảnh hƣởng tích cực đến sự của bệnh nhân và quá trình theo dõi lâm sàn. Hiện tại, các dữ liệu chứng tỏ có thể dùng CTC nhƣ yếu tố theo dõi bệnh nhân mắc ung thƣ vú, trong khi những khía cạnh khác của bệnh học có liên quan đến CTC đang đƣợc nghiên cứu nhờ những công nghệ mới5. Kiểm tra CTC trong máu là phƣơng pháp ít xâm lấn so với các phƣơng pháp lấy sinh thiết, đồng thời có thể thực hiện nhiều lần từ một mẫu máu đƣợc lấy ra. Với sự phát triển của công nghệ micro-nano, cho phép tạo ra những vật liệu mới, những linh kiện, thiết bị mới và các hệ thống mới ở kích thƣớc tế bào, phân tử, nguyên tử giúp phát hiện CTC hiệu quả. Nhiều loại thiết bị cảm biến sử dụng vật liệu cấu trúc micro-nano khác nhau đã và đang phát triển để ứng dụng phát hiện CTC. Đó là một lĩnh vực nghiên cứu mới và nhiều hứa hẹn. 1.1.3 Các phƣơng pháp phát hiện CTC Phƣơng pháp ly tâm Có nhiều công nghệ khác nhau để phát hiện CTC trong máu ngƣời, phƣơng pháp truyền thống phổ biến nhất là phƣơng pháp ly tâm. Các thành phần nặng hơn trong mẫu máu sẽ lắng xuống dƣới đáy, trong khi các thành phần nhẹ hơn gồm các tế bào dịch chuyển CTC sẽ nổi lên trên. Các tế bào này sau đó đƣợc nhuộm và soi dƣới kính hiển vi để phát hiện CTC. Quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, trong khi độ chính xác phụ thuộc nhiều vào kỹ năng của kỹ thuật viên. Ngoài ra, tỉ lệ thu hồi tế bào cao nhất chỉ 70%. Tỉ lệ thu hồi thấp là do máu có xu hƣớng trộn lẫn với dung dịch pha loãng nếu chƣa đƣợc ly tâm ngay. Màng Lọc Màng lọc đƣợc dùng lần đầu tiên là màng polycabonate. Đây là phƣơng pháp đơn giản và rẻ tiền để làm giàu và bắt các CTC. Nguyên lý phát hiện CTC của màng lọc dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc của các tế bào dịch chuyển, CTC lớn hơn các 3 loại tế bào khác trong máu, nên khi đi qua màng lọc với kích thƣớc thích hợp nó sẽ bị giữ lại, trong khi các tế bào khác vẫn chui qua đƣợc. Màng polycacbonate này đƣợc khoét lỗ ngẫu nhiên bằng phƣơng pháp ăn mòn tạo ra cấu trúc xốp. Theo cách này mật độ các lỗ thấp và thƣờng phân bố thành cụm, và không đều. Mặc dù hiệu quả bắt tế bào khoảng 50-60%, nhƣng khi bắt CTC trong hỗn hợp với tế bào bạch cầu, cần tính toán độ nhiễu của kết quả do tế bào bạch cầu có kích thƣớc tƣơng đƣơng với kích thƣớc CTC. Độ nhạy của phƣơng pháp khoảng 1 CTC/mL. Kích thƣớc CTC không đồng nhất lớn hơn 8-10µm, do đó có thể cho kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khi dùng phƣơng pháp màng lọc. Một trong những màng lọc cải tiến của màng polycabonate là màng lọc kích thƣớc micro paralyne C6(Zheng et al. 2007). Màng paralyne dựa trên nhiều tính chất khác nhau để phát hiện CTC. Màng lọc này có khả năng khắc phục các lỗi do sự ô nhiễm sinh học trong mẫu phân tích. Nó có tính chất cơ học tuyệt vời nhƣ có khả năng kéo giãn hai lần, trong suốt với ánh sáng UV và ánh sáng nhìn thấy nên dễ dàng phân tích, quan sát và nhuộm màu CTC trực tiếp trên màng lọc mà không cần chuyển CTC sang lam kính, nhờ đó làm giảm sự mất mát CTC. Thực nghiệm cho thấy tỉ lệ thu hồi CTC lên đến 90% khi dùng màng paralyne, thế nhƣng cũng giống nhƣ những thiết bị dựa trên màng polycabonate, liệu kích thƣớc CTC có thực sự lớn hơn đáng kể so với tế bào hồng cầu? Đó vẫn đang là một câu hỏi. Vì thế kỹ thuật này bị những hạn chế tƣơng tự nhƣ màng polycacbonate, làm cho nó dễ gây ra các kết quả dƣơng tính, âm tính giả. Cellsearch Nguyên lý: Cellsearch là thiết bị duy nhất đƣợc cơ quan quản lý thuốc Hoa Kỳ (FDA) cấp phép và cũng là sản phẩm thƣơng mại duy nhất trong phát hiện CTC7(Cristofanilli et al. 2004). Đó là phƣơng pháp pháp hiện CTC dựa trên hƣớng tiếp cận gắn miễn dịch: khi một kháng thể đặc hiệu liên kết với các kháng nguyên tƣơng ứng của tế bào biểu mô đi kèm CTC để phân tách các tế bào này. Các kháng nguyên này thƣờng là các phân tử bám dính tế bào biểu mô EpCAM (Epithelial Cell ahhesion molecule). Phƣơng pháp Cellsearch đã đƣợc áp dụng phát hiện CTC của nhiều loại ung thƣ di căn khác nhau nhƣ: ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng, và ung thƣ tiền liệt tuyến. Một mẫu máu 10mL lấy ra từ cơ thể chứa nhiều tế bào bạch cầu và một số ít hoặc rất ít các CTC khác nhau. Sau đó mẫu máu đƣợc bảo quản trong môi trƣờng chống độc để giữ tế bào. Mẫu máu đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng và phân tích trong thời gian 72 giờ. Một bộ kit chứa các kháng thể đặc hiệu với các EpCAM nhằm làm giàu CTC và các chất đánh dấu tế bào bạch cầu và tế bào biểu mô. Các kháng thể này có gắn các hạt nano có từ tính. Khi kháng thể EpCAM bắt cặp với kháng nguyên của CTC, sau đó dƣới tác dụng của một từ trƣờng mạnh các CTC này sẽ tách ra khỏi máu theo các hạt nano từ. Các tế bào không liên kết đƣợc hút ra, còn các tế 4 bào đã đƣợc tách bằng từ trƣờng sẽ đƣợc ủ nhuộm trong một khoảng thời gian, khi đó từ trƣờng phân tách đƣợc lập lại để gom các CTC đã nhuộm hoặc đƣợc đánh dấu. Cuối cùng chất nhuộm dƣ sẽ đƣợc hút ra. Các CTC này đƣợc xác định thông qua kính hiển vi huỳnh quang bán tự động dƣới sự hỗ trợ của máy tính để tái tạo lại hình ảnh của tế bào. Nó là các tế bào có bề mặt gồ ghề, dƣơng tính với anti cytokeratin và âm tính với anti CD45. Nhược điểm: Những hệ thống nhƣ Cellsearch có các nhƣợc điểm nhƣ: [1] cần nhiều bƣớc thực hiện để làm tinh khiết và làm giàu CTC nên dễ gây thất thoát tế bào. [2] Khó áp dụng với những CTC không chứa các phân tử biểu mô EpCAM, khi tế bào đang trong trạng thái chuyển dịch trung gian biểu mô (Epithelial to Mesenchimal Transition-EMT), lúc đó làm cho tế bào giảm khả năng bám dính với kháng thể khi chúng ngẫu nhiên tách ra và đi vào tuần hoàn máu. Phƣơng pháp phát hiện thông qua các phân tử bám dính tế bào biểu mô (EpCAM) không thể áp dụng với những ung thƣ không có EpCAM nhƣ sarcomas. Chƣa có kết luận phƣơng pháp Cellsearch có thể ghi nhận đƣợc tất cả các nhóm các tế bào ung thƣ của ung thƣ vú nhƣ: loại bình thƣờng (normal like), basal, dƣơng tính HER2, loại tế bào luminal A, loại luminal B. FDA khuyến cáo Cellsearch chỉ áp dụng cho phát hiện CTC của ung thƣ di căn, nên với những ung thƣ chƣa di căn thì kết quả chƣa đƣợc kiểm chứng. Mặt khác Cellsearch là một hệ kín, không có tính kết nối với các thiết bị khác, và chi phí cho một lần kiểm tra thƣờng tốn kém. CTC chíp (Microfluidic chip) CTC chip là một công nghệ thú vị, cấu tạo từ các đƣờng dẫn có kích thƣớc micro để lọc các tế bào trong máu8 (Nagrath et al. 2007). CTC chip do Nagrath chế tạo năm 2007 có 78,000 thanh Silic kích thƣớc micro đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật ăn mòn trên tấm Silic. Kháng thể, anti-EpCAM đƣợc chức năng trên bề mặt của các thanh này. EpCAM đƣợc xem có tính đặc hiệu để bắt CTC thông qua các tế bào biểu mô-trong khi đó anti-EpCAM thụ động, không tƣơng tác với các tế bào máu. Thí nghiệm phát hiện đƣợc lƣợng CTC trong 115- 116 mẫu với số lƣợng thay đổi từ 51281 CTC/mL. Thí nghiệm cho thấy hiệu quả của thiết bị phụ thuộc nhiều vào vận tốc bơm máu qua các đƣờng dẫn vì tốc độ chảy quyết định thời gian tiếp xúc của CTC với các thanh Silic và lực liên kết của nó khi bị bắt lại tại các thanh Silic này. Vận tốc phải đảm bảo đủ nhỏ khoảng 1ml/h để sự gắn kết CTC và thanh micro Silic bền nhất.. Với tốc độ đó, CTC chip đòi hỏi từ 6-8h để xử lý xong một mẫu 10ml máu bệnh nhân. Năng suất của CTC chip giảm 20% khi tăng tốc độ chảy lên 3ml/h. Một nhƣợc điểm khác là CTC chip chỉ bắt các EpCAM vì thế không phát hiện đƣợc các tế bào ở thời kỳ EMT cũng nhƣ những ung thƣ sarcomas vì sarcomas không biểu hiện EpCAM. Khi giảm kích thƣớc các thanh Silic về kích thƣớc nano thì tỉ lệ bắt CTC tăng lên 65% 9 và thời gian cần thiết cũng mất hàng giờ để thực hiện một mẫu phân 5 tích. Kết quả ta thấy độ nhạy của phƣơng pháp không cao và đặt biệt thời gian phân tích rất lâu. Transistor hiệu ứng trƣờng Transistor hiệu ứng trƣờng dựa trên sợi Silic kích thƣớc nano và Cacbon nanotube (SiNWs FET và CNT FET) là vật liệu có khả năng làm tăng độ nhạy phát hiện CTC dựa trên nhiều cách khác nhau. Trƣớc tiên, vật liệu kích thƣớc nano có khả năng thay đổi bề mặt để tƣơng tác với tế bào. Hình thái bề mặt của vật liệu có thể dẫn đến tính tƣơng thích sinh học cao với tế bào hoặc thậm chí sự tƣơng tác đó biểu hiện khác nhau với những loại tế bào khác nhau. Bề mặt có kích thƣớc nano có thể làm tăng khả năng bám dính của tế bào nên thuận lợi khi phát hiện CTC trong máu. Lần đầu tiên transistor hiệu ứng trƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các phân tử sinh học, các phân tử hóa học vào năm 2001 10(Cui et), từ đó đến nay có nhiều công trình chứng tỏ những tính năng vƣợt trội của loại cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc này. Nhƣng vì CNT FET có hai nhƣợc điểm chính khi dùng làm cảm biến sinh học: (1) Phƣơng pháp tổng hợp hiện tại làm cho CNT dễ bị lẫn tạp chất kim loại, nên gây ra nhiều tính chất không mong muốn khi làm cảm biến. (2) Những trở ngại trong các phƣơng pháp chức năng bề mặt CNT để có thể gắn nhiều các chất phân tích lên đó. Trong khi SiNWs FET khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm này. Ngoài ra Silic là chất bán dẫn và nồng độ hạt tải đƣợc kiểm soát nhờ quá trình pha tạp thành bán dẫn loại N hoặc loại P, cho phép chế tạo đƣợc cảm biến với cƣờng độ dòng điện thích hợp để có độ nhạy cao nhất - tức là khả năng can thiệp các tham số của cảm biến dễ dàng để có đƣợc tính chất mong muốn. Việc kết hợp SiNW FET với các mồi sinh học tạo nên cảm biến nano sinh học thế hệ mới. Các khả năng làm việc ƣu việt của cảm biến sợi nano sinh học có thể đƣợc trình bày vắn tắt dƣới đây:  Chỉ cần một vài phân tử sinh học (từ dung dịch hoặc không khí) bám lên bề mặt sợi nano Silic cũng đủ làm thay đổi đáng kể điện trở của sợi - tính siêu nhạy của cảm biến.  Vì các cặp mồi sinh học đƣợc thiết kế để sử dụng có tính kết cặp siêu chọn lọc, cho phép cảm biến có độ chọn lọc rất cao với chất cần phát hiện - tính chọn lọc đặc trưng rất cao của cảm biến. Tính kết cặp chọn lọc cao của các cặp mồi sinh học là một tính chất phức tạp, nhƣng tuyệt vời của tự nhiên, cho phép phân biệt từng cá thể riêng biệt trong một quần thể phức tạp, phong phú. Ví dụ trong khi trái đất có trên 6 tỉ ngƣời với từng ấy phân tử DNA khác biệt, nhƣng một phân tử DNA sẽ chỉ kết cặp duy nhất với một DNA khác đƣợc thiết kế tƣơng thích).  Một cảm biến sinh học có thể đƣợc chế tạo bao gồm nhiều sợi nano (array of nanowires) mà mỗi sợi đƣợc gắn kết với một mồi sinh học đặc trƣng. Cảm biến 6 nhƣ thế cho phép phát hiện đồng thời, cùng lúc nhiều loại phân tử sinh học khác nhau (simultaneous DNA multiplex detections), điều này nâng cao khả năng làm việc cũng nhƣ tính chính xác của phép phân tích - tính đồng bộ và đa dạng của cảm biến.    Tính tự do chức năng bề mặt: Lĩnh vực nghiên cứu về Silic có từ rất lâu đời nên bản chất của vật liệu Silic cũng nhƣ các quá trình hóa học liên quan trong quá trình chức năng bề mặt sợi Silic trên đế SiO2 là một thuận lợi rất lớn trong quá trình chế tạo đảm bảo tính chính xác và tính ƣu việt. Dễ dàng gắn các thụ thể khác nhau để phát hiện các biomaker khác nhau trong từng mục đích nhất định. Tính tích hợp: Trong cùng một dụng cụ, với nhiều cảm biến có cấu trúc SiNWs đƣợc chế tạo trên một diện tích rất nhỏ, chứa trong một thiết bị duy nhất. Mỗi một sợi Silic đƣợc chức năng với một phân tử sinh học cụ thể khác nhau để phát hiện một phân tử sinh học đặc hiệu với nó. Nhƣ vậy với nhiều sợi đƣợc chức năng khác nhau có thể phát hiện đồng thời các biomaker trong cùng một thiết bị (lab on chip)11. Tính tƣơng thích: Thừa hƣởng thành tựu của công nghệ máy tính nên cảm biến SiNWs FET có tính tƣơng thích cao với các thiết bị ngoại vi. Nhờ tính tƣơng thích với việc chế tạo các thiết bị công nghệ micro điện tử nên chỉ cần áp dụng công nghệ micro để giảm kích thƣớc thiết bị và sẽ cho ta một thiết bị ở kích thƣớc nano, nhạy hơn, chi phí thấp và khả thi12.  Tính tức thời: Vì cảm biến hoạt động thông qua sự đo đạc trực tiếp, liên tục của tín hiệu điện, cho phép các phân tích đƣợc phát hiện nhanh, rút ngắn đáng kể thời gian thực hiện một mẫu phân tích 13. Với các ƣu việt nói trên SiNWs FET hứa hẹn là một trong những công nghệ hiệu quả trong việc phát hiên CTC ứng dụng cho nhiều mục tiêu khác nhau nhƣ chẩn đoán, tiên lƣợng, đánh giá kết quả điều trị, tầm soát các bệnh ung thƣ. Chính vì thế, năm 2011 nhóm các nhà khoa học Thụy Điển đã đề xuất một dự án nghiên cứu chế tạo thiết bị phát hiện CTC trong máu với kinh phí lên tới 64 triệu Korana (tương đương 10 triệu USD)14. 1.1.4 Ý nghĩa lâm sàng của CTC Số lƣợng CTC đƣợc ghi nhận có một ý nghĩa quan trọng: đánh giá hiệu quả điều trị: theo dõi số lƣợng CTC trƣớc và sau khi áp dụng một phƣơng pháp điều trị mới để kết luận phƣơng pháp điều trị tốt nếu lƣợng CTC giảm, và ngƣợc lại thì cần phải đổi phƣơng pháp điều trị, thuốc điều trị khi lƣợng CTC không giảm. Nghiên cứu của công ty Varidex trên 177 bệnh nhân bị ung thƣ vú cho thấy rằng tỉ lệ sống sót trung bình rất thấp với những bệnh nhân biểu hiện số lƣợng CTC cao trong lần thăm 7 khám đầu tiên. Số lƣợng CTC trong ung thƣ vú di căn trƣớc khi áp dụng một phƣơng pháp điều trị, có giá trị đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp điều trị đó thông qua tỉ lệ bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng không nguy hiểm hơn và đánh giá kết quả điều trị sau một thời gian nhất định thông qua yếu tố tỉ lệ sống của bệnh nhân15 Tiên lƣợng thời kỳ bệnh: mức độ nguy hiểm của giai đoạn bệnh có liên quan mật thiết với hàm lƣợng CTC. Phát hiện CTC ở nồng độ thấp là yếu tố tiên lƣợng thời kỳ bệnh hiệu quả. Lúc đó áp dụng phƣơng pháp phẫu thuật hoặc một phƣơng pháp điều trị thích hợp có thể ngăn chặn sự phát triển của bệnh. CTC có thể chỉ ra giai đoạn sớm hay muộn của bệnh và tƣơng quan đến khả năng sống sót của bệnh nhân. CTC có giá trị tiên lƣợng cao và là yếu tố độc lập trong ung thƣ vú khi so sách với các các yếu tố tiên lƣợng đang đƣợc dùng nhƣ kích thƣớc khối u, hình thái, chi tiết của khối u đối với những bệnh khác nhau (phenotypic subtype of disease). và CTC có thể là dấu hiệu quan trọng trong sinh học ung thƣ trong ung thƣ vú di căn16. Thực tế cho thấy những bệnh nhân đƣợc phát hiện có CTC ở tình trạng nguy hiểm hơn bệnh nhân không biểu hiện CTC17. Khía cạnh sinh học của CTC: Về khía cạnh sinh học tế bào, thông tin về CTC vẫn còn nhiều hạn chế. Nên cần nhiều nghiên cứu để có một tập hợp thông tin sinh học đầy đủ của nó kèm theo đó là cơ sở phân loại CTC dựa trên các biểu hiện bề mặt khác nhau, cũng nhƣ xác định hàm lƣợng ngƣỡng nguy hiểm của từng loại là một nhiệm vụ quan trọng giúp cung cấp một số chỉ dẫn điều trị ung thƣ hiệu quả hơn. Những thiết bị ghi nhận các tín hiệu về điện, từ, quang...dựa trên công nghệ nano có thể đƣợc dùng để phát triển thiết bị phân tích cầm tay, chúng có thể phân loại bệnh nhân dựa trên các tín hiệu miễn dịch học. Ngoài ra nó còn kích thích phát triển các loại thuốc đặc biệt nhằm cắt đứt quá trình di căn dựa trên các thông tin về tế bào của bênh nhân. Thông tin di truyền: Thông tin di truyền ẩn chứa trong CTC vẫn còn là hiện tƣợng chƣa đƣợc hiểu thấu đáo và nếu nghiên cứu thông tin di truyền này có thể mang lại những tín hiệu mới cho quá trình nghiên cứu quá trình chuyển dịch trung gian biểu mô (Epithelial to Mesan Transformation-EMT). CTC gần đây thể hiện những tính chất giống với tính chất của tế bào gốc18(Mark 2007). CTC giúp biết đƣợc vị trí nguồn gốc của khối u thông qua quá trình tự gieo mầm ung thƣ. Sinh học ung thƣ - Cơ chế của quá trình di căn: nghiên cứu CTC có thể giúp chúng ta khám phá cơ chế quá trình di căn để có thể can thiệp, ngăn chặn quá trình di căn, từ đó phát triển các loại thuốc thích hợp nhằm ngăn chặn quá trình phát tán di căn. 8 1.2 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CẢM BIẾN SINH HỌC SiNW FET Hình 1-1.(a) Cấu tạo của một cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc transistor hiệu ứng trường sợi Silic. Hai điện cực nguồn và máng được nối với nhau qua kênh dẫn sợi Silic kích thước nanomet. Độ dẫn qua sợi được điều chỉnh bằng thế điện áp vào cực cổng ở đế Silic. (b) Sự thay đổi tính cường độ dòng điện chạy qua sợi Si loại P khi có các phần tử bị bắt lại trên sợi. Dòng điện giảm khi đối tượng mang điện tích dương, cùng dấu với điện tích hạt tải chính trong sợi, làm dòng điện qua sợi giảm. Trong khi đối tượng mang điện tích âm bị bắt làm dòng điện tăng lên Một FET cảm biến có cấu trúc là một transistor có ba điện cực, trong đó cực nguồn và máng nối với nhau qua một kênh chất bán dẫn và cực cổng có khả năng điều khiển sự dẫn điện của kênh này. Một FET cảm biến nano, kênh dẫn đƣợc làm từ vật liệu nano Silic. Để phát hiện một đối tƣợng sinh học nào đó, ta cần gắn các chất nhận biết nó lên trên bề mặt sợi Silic để khi có phản ứng xảy ra, hoặc quá trình bắt cặp của chúng xảy ra sẽ làm ảnh hƣởng đến độ dẫn điện của sợi Silic, kênh dẫn của transistor. Chất nhận biết này đƣợc chọn tiên quyết để có thể bắt đƣợc phân tử mục tiêu (chất cần phân tích) với tính chuyên biệt duy nhất và ái lực càng mạnh càng tốt. Nếu sợi Silic là chất bán dẫn loại P thì khi có phần tử tích điện âm bị bắt lại trên bề mặt sợi sẽ làm tăng dòng điện chạy qua sợi, ngƣơc lại nếu chất cần phân tích mang điện tích dƣơng, khi bị bắt tại sợi Silic loại P sẽ làm giảm dòng điện. Ngƣợc lại, với sợi Silic là bán dẫn loại N, thì khi phần tử mang điện tích âm bị bắt lại trên bề mặt sẽ làm giảm dòng điện qua sợi và trƣờng hợp phần tử mang điện dƣơng bị bắt sẽ làm tăng cƣờng độ dòng điện qua sợi. Biên độ thay đổi dòng điện mang ý nghĩa định lƣợng các chất cần phân tích. Hiện tƣợng trên gọi là hiệu ứng trƣờng. Hiện tƣợng đó có thể giải thích bằng cơ chế tiếp xúc P-N nhƣ sau: Khi đối tƣợng mang điện tích dƣơng bị bắt lại trên bề mặt sợi Silic loại P, với thành phần hạt tải chính là lổ trống mang điện dƣơng, do thế tĩnh điện nên chúng đẩy nhau tạo ra một vùng không gian ở giữa không mang điện nên làm giảm độ dẫn điện chạy qua sợi. Trong khi đó nếu đối tƣợng bị bắt lại mang điện 9 tích âm, chúng sẽ hút các lỗ trống về phía mình làm tăng cƣờng kênh dẫn trong sợi Silic. Khi tích hợp nhiều SiNW FET này trong một chíp, và mỗi sợi Silic đƣợc chức năng các phần tử nhận biết những đối tƣợng khác nhau nhằm phát hiện nhiều đối tƣợng cùng lúc. SiNW FET có thể đƣợc chia ra thành 3 nhóm dựa theo chất gắn kết trên bề mặt sợi: gắn enzyme, gắn miễn dịch, và dựa trên tế bào. Hình 1-2. Chíp SiNW FET gồm nhiều sợi Si đặt song song nhau, mỗi sợi được gắng một phần tử khác nhau nhằm phát hiện những đối tượng khác nhau, nên cảm biên có thể đo đồng thời nhiều thông số khác nhau Ƣu điểm của SiNWs FET là khả năng chuyển đổi tín hiệu trực tiếp từ sự tƣơng tác của các phần tử sinh học xảy ra trên bề mặt sợi Silic thành tín hiệu điện mà không cần qua bất kỳ một quá trình trung gian nào. Công nghệ xử lý bề mặt vật liệu Silic có từ lâu đời và quy củ nên việc chức năng hóa bề mặt sợi Silic để hình thành các loại cảm biến khác nhau, mang lại sự thuận tiện trong chế tạo. Chính vì quá trình chuyển đổi tín hiệu trực tiếp nên thời gian đáp ứng nhanh. Đồng thời các cảm biến này có thể tái sử dụng bằng phƣơng pháp tái chức năng bề mặt. Trong quá trình chế tạo, độ dẫn điện của sợi Silic có thể đƣơc kiểm soát nhờ kiểm soát tỉ lệ pha tạp. Môi trƣờng để đƣa chất cần phân tích vào cảm biến SiNW FET ảnh hƣởng rất lớn đến sự hoạt động của cảm biến: nồng độ ion, độ tinh khiết của nƣớc, độ pH...chính vì thế với các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới khi thực hiện đo trong môi trƣờng khác nhau thì khó mà so sánh đƣợc nên cần có một môi trƣờng chuẩn cho tất cả các nghiên cứu sau này. Các thông số quan trọng cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET là: [1] Độ dài kênh dẫn, chiều dài sợi Silic; [2] độ rộng kênh dẫn, là độ rộng của điện cực; [3] loại chất thụ động điện cực. Với SiNW FET, chế tạo trong luận văn này, thì đế Silic có vai trò làm điện cực cổng, kích thƣớc của linh kiện sẽ ảnh hƣởng trực tiếp tới thời gian đáp ứng của nó. Độ dài kênh dẫn là khoảng cách giữa điện cực nguồn và điện cực máng. 10 Hình 1-3. Độ dài sợi Silic và độ rộng của vùng chứa sợi và chất làm thụ động hóa bề mặt là những thông số cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET Độ rộng kênh dẫn: là độ rộng của điện cực nguồn và điện cực máng19(Sheehan & Whitnan) khi mô phỏng cho thấy rằng độ rộng này ảnh hƣởng trực tiếp và lớn đến số lƣợng chất phân tích bị bắt lại trên bề mặt sợi nano Si, vì độ nhạy phụ thuộc vào dòng các chất phản ứng đi qua sợi cảm biến. Khi kênh dẫn rộng hơn thì thời gian để cho đƣợc một tín hiệu ra sẽ nhỏ hơn nhiều đối với cùng một nồng độ chất phân tích cho trƣớc. Độ rộng kênh dẫn tính theo lý thuyết tối ƣu là 2-10µm. Điện cực: thƣờng đƣơc làm từ Au, Pt, Ni có độ dày khoảng 50-100nm. Lớp vật liệu bám dính cho điện cực thƣờng là: Ti, Cr, Al (5-50nm), có chức năng tạo tiếp xúc thuần trở giữa sợi Silic và các kim loại làm điện cực. Ngoài ra phần điện cực còn đƣợc phủ một lớp cách điện thƣờng là Si3N4 để ngăn chặn quá trình bị ăn mòn, phản ứng điện hóa hoặc sự thay đổi công thoát khi có những chất lạ bám lên bề mặt nó. PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET Có hai phƣơng pháp chính (top down và bottom up) đƣợc sử dụng để chế tạo SiNW FET làm cảm biến sinh học. Trong đó sợi Silic có thể đƣợc chế tạo với nhiều kích thƣớc khác nhau, mật độ hạt tải khác nhau, và độ linh động của hạt tải khác nhau. Tất cả các yếu tố đó ảnh hƣởng đến sự hoạt động của thiết bị cảm biến. Có nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm làm rõ sự phụ thuộc của đặc tính cảm biến vào kích thƣớc của sợi nano và nộng độ pha tạp. Khi so sánh tính chất điện của FET dùng sợi nano trong môi trƣờng có độ pH khác nhau, kích thƣớt sợi nano thay đổi trong khoảng 50-170nm, cho thấy rằng sự ảnh hƣởng của môi trƣờng giảm dần theo chiều tăng dần kích thƣớc đƣờng kính sợi20 và khi đƣờng kính lớn hơn 150nm, nó thể hiện tính chất nhƣ sợi có kích thƣớc micro. Từ thực nghiệm cũng cho thấy sợi nano pha tạp với nồng độ hạt tải thấp sẽ nhạy hơn khi pha tạp cao hoặc không pha tạp21. 1.3 1.3.1 Chế tạo sợi nano Silic bằng phƣơng pháp Top Down (TD) Top down là phƣơng pháp chế tạo SiNW FET từ đế Silic loại SOI (Semiconductor On Insulator-SOI) dựa trên các kỹ thuật chủ yếu bao gồm quang 11 khắc nano (nanolithography), ăn mòn (etching), tạo đƣờng dẫn (metallization) để có đƣợc cấu trúc SiNW FET mong muốn. Wafer sử dụng chế tạo sợi Silic trong phƣơng háp TD là loại đế SOI có ba lớp: (1) lớp đế là lớp Si đã đƣợc pha tạp nhiều, có chức năng đóng vai trò là cực cổng của FET, (2) lớp giữa là lớp điện môi SiO2 có kích thƣớc 50-200nm, (3) lớp trên cùng là lớp đơn tinh thể Si (20-300 nm), sợi Silic nano sẽ đƣợc chế tạo ở lớp trên cùng này. Kỹ thuật dùng trong TD để định dạng sợi nano có thể là các kỹ thuật ăn mòn ƣớt, ăn mòn khô, quang khắc, khắc bằng chùm tia điện tử, hoặc phƣơng pháp dịch chuyển về kích thƣớc nano nhƣ phƣơng pháp dịch chuyển thành cấu trúc sợi nano trong siêu mạng. Sợi nano đƣợc chế tạo từ TD có tính đồng nhất và định hƣớng cao, kích thƣớc sợi thƣờng đƣợc chế tạo trong khoảng 30100nm. Sợi nano đƣợc chế tạo bằng TD có hiệu suất cao theo một hƣớng và vị trí cho trƣớc, nhƣ thế dễ dàng chế tạo thành những thiết bị có chức năng mong muốn. 1.3.1.1 Ăn mòn Có hai kỹ thuật ăn mòn là: ăn mòn ƣớt là quá trình ăn mòn xảy ra ở pha lỏng và ăn mòn khô là quá trình ăn mòn xảy ra ở pha khí. Trong quy trình chế tạo SiNW FET bằng kỹ thuật ăn mòn ƣớt, cần chú ý nhất là hƣớng ƣu tiên của quá trình ăn mòn Si (anisotropic etching), vì quá trình này kiểm soát kích thƣớc sợi Si. Ngoài ra kỹ thuật ăn mòn lớp SiO2 cũng là một điều cần quan tâm lƣu ý. Cơ chế quá trình ăn mòn gồm ba bƣớc: quá trình khuyếch tán chất ăn mòn (chất phản ứng) lên lớp bề mặt màng, quá trình ăn mòn màng mỏng (phản ứng xảy ra giữa chất ăn mòn và màng mỏng làm cho màng mỏng bị ăn mòn), cuối cùng là quá trình khuếch tán ngƣợc của sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài. Hình 1-4. Ba quá trình của cơ chế ăn mòn là quá trình khuếch tán, quá trình ăn mòn, và quá trình thải sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài. 12 Ăn mòn SiO2: Khi ăn mòn lớp SiO2 yêu cầu phải chọn chất ăn mòn sao cho chỉ ăn mòn SiO2 mà không ăn mòn Si. Axít flohiđric (HF) là thƣờng dùng trong quá trình ăn mòn này. Nhƣng khi dùng trực tiếp HF thì phản ứng xảy ra rất nhanh, HF 1% đã có tốc độ ăn mòn SiO2 5nm/phút, nên rất khó kiểm soát, đặt biệt khi cần kiềm soát ở độ chính xác từng nano mét. Tuy nhiên nồng độ dung dịch HF bị giảm rất nhanh trong quá trình ăn mòn làm thay đổi tốc độ ăn mòn trong quá trình sử dụng. Vì thế trong thực tế, HF đƣợc pha loãng trong dung dịch đệm (buffer solution) để có tốc độ ăn mòn thấp và ổn định trong suốt quá trình ăn mòn, cho phép kiểm soát đƣợc chiều dày của lớp bị ăn mòn tƣơng ứng với thời gian ăn mòn . Ăn mòn ƣớt Si: Chất ăn mòn thƣờng dùng là dung dich KOH nồng độ thấp. Trong cơ chế ăn mòn ƣớt màng Silic để hình thành cấu trúc sợi nano, ta cần biết cơ chế ăn mòn ƣớt có thể giống nhau về mọi hƣớng, có khi ƣu tiên một hƣớng nào đó. Xét về hình thái vật liệu khi bị ăn mòn có thể chia ra làm ba loại: ăn mòn đẳng hƣớng, ăn mòn dị hƣớng và ăn mòn siêu dị hƣớng. Hình 1-5. Ba cơ chế ăn mòn: a- đẳng hướng, b- dị hướng, c- siêu dị hướng [Hình 1-5a] ăn mòn đẳng hƣớng (Isotropic): Tốc độ ăn mòn là nhƣ nhau theo mọi hƣớng, thƣờng chỉ phụ thuộc vào tính chất hóa học của các chất. [Hình 1-5b] ăn mòn dị hƣớng (Anisotropic): Tốc độ ăn mòn theo một hƣớng nào đó nhanh hơn các hƣớng khac (ƣu tiên một hƣớng nhất định). [Hình 1-5c] ăn mòn siêu dị hƣớng (compeletely anisotropic): Tốc độ ăn mòn chỉ thẳng theo một hƣớng duy nhất. Trong phƣơng pháp TD, nanolithography là một trong các kỹ thuật chủ yếu nhất đƣợc sử dụng kết hợp với quá trình ăn mòn để chế tạo sợi nano Silic. Nanolithography có hai loại: photolithography dùng tác nhân là photon và e_beam lithography dùng tác nhân là chùm điện tử. Trong quy trình này chất cảm quang (photoresist) đƣợc phủ lên vật liệu mong muốn, khi nó bị chiếu sáng hoặc chiếu chùm electron (theo các định dạng định sẵn) thì tính chất hóa học của nó thay đổi, tạo nên những cấu trúc mong muốn [Hình 1-6].