Tài liệu Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu sargassum henslowianum và sargassum swartzii của việt nam (tt)

  • Số trang: 24 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 155 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

1 I. Giíi thiÖu luËn ¸n 1. §Æt vÊn ®Ò Polysaccharide là các polymer sinh học tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và đa dạng. Trong phân tử của polysaccharide từ rong biển thường có chứa các nhóm chức như carboxyl, sulfate hoặc amino nên phân tử chúng mang điện và được gọi là các ionic polysaccharide. Nhiều ionic polysaccharide từ rong biển có hoạt tính sinh học quí báu hay tính chất lý thú như khả năng tồn tại ở trạng thái gel trong môi trường nước. Chính vì vậy mà chúng được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và thực phẩm. Rong biển là một nguồn cung cấp phong phú polysaccharide nói chung và các ionic polysaccharide nói riêng. Trên thế giới có khoảng 6000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Bên cạnh khả năng cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học quý báu như các polymer sinh học (fucoidan, laminaran, alginate), rong biển còn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloid, phlorotannin, acetogenin và terpene. Hoạt tính sinh học của ionic polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phân tử, sự phân bố trọng lượng phân tử, cấu trúc và thành phần hóa học, đặc biệt phụ thuộc vào vị trí và hàm lượng của các nhóm chức trong phân tử của chúng. Các ionic polysaccharide có khả năng tạo thành các dạng cấu trúc khác nhau. Từ một monosaccharide có thể tạo nên nhiều loại polysaccharide bởi các kiểu liên kết glycoside khác nhau dẫn tới tính chất của các polysaccharide khác nhau và tạo nhiều hoạt tính sinh học, ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Hoạt tính sinh học của polysaccharide còn phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của rong biển. Cùng một loại rong biển, cùng một loại polysaccharide nhưng thu thập ở các vị trí địa lý khác nhau sẽ cho các polysaccharide có các tính chất và hoạt tính sinh học khác nhau. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển đã được một số nhà khoa học tiến hành. Các nghiên cứu này tập trung theo hướng khai thác rong, chiết tách các polysaccharide từ các rong thu được, xác định thành phần, cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Tuy vậy, các nghiên cứu về cấu trúc hóa học của các ionic polysaccharide có hoạt tính sinh học chiết tách từ nguồn rong biển Việt Nam vẫn còn chưa nhiều. Nh m góp phần đi sâu vào việc nghiên cứu về 2 thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của các ionic polysaccharide để mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam, chúng tôi chọn đề tài luận án là “N u u tr v s t t t s u v t t r u S r ssu s w u v S r ssu sw rtz t N ”. Những nội dung chính của luận án là: - Thu thập hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii ở các vùng biển của Việt Nam. - Xây dựng quy trình chiết tách fucoidan và alginate từ các loài rong này. - Xác định thành phần hóa học của các fucoidan và alginate. - Xác định cấu trúc bao gồm cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan và alginate. - Khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập được từ hai loài rong này. 2. §èi t-îng nghiªn cøu cña luËn ¸n Đối tượng nghiên cứu của đề tài là fucoidan và alginate phân lập được từ các mẫu rong thu thập tại các vùng biển của Việt Nam. 3. Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n 3.1. Lần đầu tiên cấu trúc của fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2, C-4 và một phần của C-3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1-4). Đây là một fucoidan có cấu trúc mới vì đa số các fucoidan chỉ bị sulfate hóa ở 1 hoặc 2 vị trí của fucose, trong khi fucoidan này cả 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte hóa. 3.2. B ng cách sử dụng cùng các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của ionic polysaccharide được nghiên cứu. Kết quả này góp phần nâng các nghiên cứu về polysaccharide có nguồn gốc từ rong biển Việt Nam lên một bước cao hơn và sâu hơn. 3.3. Lần đầu tiên ở Việt Nam hoạt tính sinh học in vivo của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii đã được nghiên cứu. 4. Bè côc cña luËn ¸n Luận án gồm 128 trang với 24 bảng số liệu, 29 hình, 7 sơ đồ, 144 tài liệu tham khảo và 15 phụ lục. Bố cục của luận án: Đặt vấn đề (2 trang), 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu (41 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (12 trang), Chương 3: Thực nghiệm (19 trang), Chương 4: Kết quả và Thảo luận (37 trang), Kết luận (2 trang), kiến nghị (1 trang), Các công trình đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (12 trang), Danh mục các phụ lục (1 trang). II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. Chương 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:  Đặc điểm thực vật, phân bố, tình hình khai thác và ứng dụng của rong biển.  Các ionic polysaccharide có trong rong biển  Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án Ch-¬ng 2 ĐỐI TƯỢNG vµ Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. Nguyªn liÖu + Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum thu thập tại bán đảo Sơn Trà – Thừa Thiên - Huế. + Fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập tại vịnh Nha Trang. + Alginate từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập tại vịnh Nha Trang. 2.2. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng là:  Chiết tách các ionic polysaccharide từ rong biển b ng các phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố trên thế giới để đưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của đề tài.  Phương pháp chính để xác định thành phần và cấu trúc hóa học của các ionic polysaccharide là kết hợp các phương pháp sắc ký (GC, LC), phương pháp hóa học và phổ hiện đại (IR, NMR, MS, LS, SAXS).  Thử hoạt tính sinh học: khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính hạ mỡ máu của ionic polysaccharide chiết tách được b ng cách tham khảo các phương pháp đã công bố trên thế giới và quy trình cụ thể tại Việt Nam. 4 Kết hợp giữa con đường nghiên cứu b ng phương pháp hóa học với sự phát triển hiện nay của các phương pháp hoá lý trong nghiên cứu cấu trúc, việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide bao gồm các bước chủ yếu: 1. Xác định thành phần monosaccharide b ng con đường thuỷ phân mạch cacbohydrat để cắt các liên kết glycoside. Vị trí các nhóm thế có trong mạch được xác định b ng phổ hồng ngoại (IR) 2. Ghi dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 3. Xác định trật tự liên kết glycoside và các vị trí nhóm thế b ng phương pháp phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp phân tích hóa học. 4. Nghiên cứu cấu trúc không gian b ng phương pháp tán xạ ánh sáng (Light scattering-LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (Small angel X-ray scattering-SAXS). Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Trong luận án này, các chất phân lập được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính hạ mỡ máu và hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB, LU, MCF-7, SK-Mel 2 và dòng tế bào thường NIH/3T3. Ch-¬ng 3: Thùc nghiÖm 3.1. Thu thập và phân loại rong biển Hai mẫu rong thu thập được bao gồm: Rong nâu Sargassum henslowianum dùng để chiết fucoidan, thu hái ở bán đảo Sơn Trà – Thừa Thiên Huế, tháng 8 năm 2011. Rong nâu Sargassum swartzii dùng để chiết alginate và fucoidan, thu hái ở Nha Trang – Khánh Hòa, tháng 3 năm 2011. Các mẫu rong được giám định và xác định tên khoa học bởi TS. Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Sau khi thu hái, mẫu được rửa dưới vòi nước máy để loại muối, cát và phơi trong bóng râm. Rong được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 40-50oC, cắt nhỏ, nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.2. Xác định thành phần hóa học của rong Phân tích protein thô, chất béo thô theo AOAC 3.3. Chiết tách các ionic polysaccharide Chúng tôi đã chọn lựa được phương pháp thích hợp để chiết fucoidan và alginate phù hợp cho việc phân tích cấu trúc và cho hiệu suất cao. 3.4. Xác định thành phần hóa học của ionic polysaccharide 3.4.1. Xác định hàm lượng sulfate 5 Xác định hàm lượng sulfate b ng phương pháp đo độ đục. 3.4.2. Xác định hàm lượng acid uronic Xác định hàm lượng acid uronic b ng phương pháp carbazole. 3.4.3. Xác định thành phần đường Xác định thành phần đường theo phương pháp của Bilan. 3.5. Các phương pháp để xác định cấu trúc Sử dụng các phương pháp vật lý hiện đại như Phổ hồng ngoại, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Phổ khối lượng đo tại Trung tâm phân tích và kiểm nghiệm chất lượng – Chi cục Bảo vệ thực vật Hà Nội. Phép đo tán xạ ánh sáng tiến hành trên máy ALV 5000 tại Đại học công nghệ Kyoto, Nhật Bản, Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ được được tiến hành tại BL-10C, Photon Factory, Tsukuba, Nhật Bản. 3.6. Thử hoạt tính sinh học Các phép thử hoạt tính sinh học đều được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Ch-¬ng 4 kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 4.1. Thành phần hóa học của rong Thành phần hóa học chính của rong bao gồm protein, lipid, sulfate, alginate, laminaran, fucoidan bị ảnh hưởng rất lớn bởi môi trường. Kết quả nghiên cứu về thành phần chính của 2 loại rong Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii được tóm tắt trong Bảng 4.1. B 4.1. T p ầ ó r (%w) Protein Lipid Sulfate Alginate Laminaran Fucoidan Sargassum henslowianum Sargassum swartzii 2,9 0,5 6,0 35,8 0,04 2,2 7,0 0,5 5,9 29,5 0,29 0,82 Kết quả phân tích thành phần hóa học chính của 2 loài rong trên Bảng 4.1 cho thấy r ng hàm lượng protein trong các mẫu rong nghiên cứu dao động 2,9 đến 7,0%, hàm lượng lipid < 2%. Các loài rong khác nhau thì có hàm lượng các chất khác nhau. Theo một số tác giả công bố thì hàm lượng protein trong rong biển dao động từ 3-14% và hàm lượng lipid < 4%. Như vậy, các mẫu rong trong nghiên cứu của chúng tôi nhìn chung có hàm lượng protein nhỏ hơn, hàm lượng lipid là tương đương so với các công bố trên. 6 Thành phần polysaccharide chủ yếu trong rong nâu bao gồm alginate, laminaran và fucoidan. Trong 2 mẫu rong mà chúng tôi nghiên cứu có chứa alginate (từ 29,5 đến 35,8%), laminaran < 0,5% và fucoidan chứa từ 0,82% (Sargassum swartzii) đến 2,2% (Sargassum henslowianum). So sánh với kết quả phân tích hàm lượng polysaccharide trong một số loài rong trên thế giới thì 2 loài rong Sargassum swartzii và Sargassum henslowianum sinh trưởng ở bờ biển Việt Nam có hàm lượng laminaran thấp hơn, fucoidan là tương đương và hàm lượng alginate là tương đối cao. Điều này một lần nữa khẳng định các yếu tố địa lý nơi cây rong sinh trưởng như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối đã ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong. 4.2. Cấu trúc hóa học của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum Kết quả xác định thành phần hóa học của fucoidan được đưa ra trên Bảng 4.2. Giống như các fucoidan khác, fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum có thành phần bao gồm 4 loại đường trong đó chủ yếu là 2 loại fucose và glucose. Hàm lượng sulfate khá cao hứa hẹn mẫu fucoidan sẽ có các hoạt tính tốt. B 4.2. Kết qu ut p ầ ó u phân ập t r u Sargassum henslowianum Thành phần đường Uronic Hàm lượng Hiệu suất (% mol) acid Sulfate (% rong (% khối (% khối Fuc Man Gal Xyl Glc lượng) lượng) khô) 1,8 1 0,05 0,05 0,38 0,92 5,8 25,20 Vị trí của nhóm sulfate gắn vào fucoidan được xác định b ng phổ IR của mẫu fucoidan (Hình 4.1). Dải hấp thụ tại 3423 cm-1 là của nhóm OH, dải hấp thụ tại 1235 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate ester. Dải hấp thụ ở 1628 cm−1 xác nhận sự có mặt của uronic acid. Dải hấp thụ tại 842 cm-1 là do nhóm sulfate tại vị trí C-4 của vòng fucopyranose. Bên cạnh đó, trên phổ xuất hiện 1 vai tại khoảng 820cm-1 chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí C-2/C-3 của vòng fucose. Mẫu fucoidan được thủy phân nhẹ b ng cách sử dụng TFA 0,75M ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian là 60 phút. Kết quả thu được mẫu oligosaccharide (ký hiệu HF) để có thể nghiên cứu cấu trúc b ng phương pháp phổ NMR và ESIMS. 7 Hình 4.1. P ổ IR u p ập t r u S. henslowianum Phổ 1H, 13C-NMR của fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum henslowianum lần lượt được đưa ra ở Hình 4.2 và Hình 4.3. Trên phổ 1H-NMR cho thấy phổ rất phức tạp với độ rộng vạch lớn và trùng chập, điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp. Vùng phổ trong khoảng từ 5,0-5,5ppm là đặc trưng cho proton , khẳng định sự có mặt của -fucopyranosyl. Tín hiệu tại 1,3 và 1,2ppm được gán cho C-6 ứng với nhóm CH3 của L-fucopyranose. Trong khi phổ 1H-NMR có độ phân giải kém thì phổ 13C-NMR (Hình 4.3) có độ phân giải tương đối tốt, các vạch được tách ra khỏi nhau. 2 tín hiện ở vùng carbon anomeric 99,0 và 95,0 ppm và 3 tín hiệu 18,64, 18,22 và 17,68ppm ở trường cao, điển hình của nhóm α-Lfucopyranoside. Tín hiệu tại 99,0ppm và 18,64 được gán cho α(1→3)-Lfucopyranose. Tín hiệu tại 95,0 và 17,68 ứng với α(1→4)- Lfucopyranose. Kết hợp với kết quả phân tích thành phần đường, tín hiệu tại 102,4 được gán cho α-D-glucopyranosyl. Tín hiệu tại 102,4ppm ứng với α-D-glucopyranosyl. Kết hợp với phổ ESI-MS sẽ được trình bày dưới đây, chúng tôi cho r ng tín hiệu yếu ở 18,22ppm thể hiện cho α(1→3, 4)- L-fucopyranose. 8 Hì 4.2. P ổ 1H-NMR u t S r ssu s w u Hì 4.3. P ổ 13C-NMR u t S r ssu s w u 9 Phổ ESI-MS của HF được đưa ra trên Hình 4.4. Pic cơ sở tại m/z 243 là của monosulfate fucose [FucSO 3]-. Tín hiệu tại m/z 225 đươc gán cho [FucSO 3-H2O]-. Tín hiệu tại m/z 389 là của [Fuc 2SO3]-. Tín hiệu tại m/z 549 gán cho[Fuc 2(SO 3)3]-. Hai tín hiệu ở m/z 405 và 507 là của [FucGluSO 3]− và [FucGlu(SO3)2]−. Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243 đưa ra trên Hình 4.5. Bérangère Tissot và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí nhóm sulfate lên phổ MS, các tín hiệu tại m/z 183 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí C-4 và tín hiệu tại m/z 139 là do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của α-L-Fucose Một tín hiệu có cường độ yếu tại tại m/z 169 là minh chứng r ng fucoidan bị sulfate hóa tại vị trí số 3 của fucose. Đây là một đặc trưng riêng chỉ có ở fucoidan đang nghiên cứu vì hầu hết các nghiên cứu về fucoidan đã được công bố thì chỉ có nhóm sulfate tại 1 hoặc 2 vị trí của fucose. Phổ ESI-MS/MS của mảnh tại m/z 389 được đưa ra trên Hình 4.6. Mảnh 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside (dạng Y) có cường độ mạnh. Hai mảnh khác cũng có cường độ mạnh tại m/z 139 (0,2X), 225 (B1) và 1 mảnh cường độ yếu tại m/z 183 (0,2A). Các kết quả này chứng tỏ r ng fucoidan đang nghiên cứu bị sulfate hóa tại vị trí C-2 và C-4 của fucose. Ngoài ra trên phổ còn có các mảnh tại m/z 371 là do mảnh 389 bị loại nước. Các tín hiệu tại 285 và 315 là do sự cắt mạch 0,2X1 and 0,3X1 (Hình 4.6), chứng tỏ sự có mặt của α(1→3)- L-fucose. Mặt khác trên phổ không thấy sự tồn tại của các mảnh dạng 0,2A (m/z 204, 329, 431), là biểu hiện cho sự có mặt của (1→4)-α-L-fucose, các mảnh này đặc trưng cho fucoidan tách ra từ rong nâu Ascophyllum nodosum và Fucus evanescens. Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGluSO3]- tại m/z 405 (Hình 4.7) là rất phức tạp. Các tín hiệu mạnh nhất là sự cắt mạch Y1 tại m/z 243 và 259 từ phân cắt của fucose monosulfate và glucose. Ion dạng B1 tại m/z 225 là do sự mất nước của monosulfate α-L-Fucp và tại m/z 241 từ sự mất nước của monosulfate glucose, cả 2 tín hiệu này đều có cường độ khá mạnh. Liên quan đến các nghiên cứu về liên kết glycoside, một nghiên cứu trước đây của các phân mảnh của disaccharide của heparin cho thấy cơ chế hình thành các ion 0,2A2 yêu cầu hydro tự do ở nhóm hydroxyl C-3, để hỗ trợ việc cắt mạch tại liên kết C-2-C-3. Bên cạnh đó ion 0,2A2 tại m/z 345 và 0,2X0 ion có cường độ lớn có thể là b ng chứng của liên kết (1-4). Các ion dạng 0,2A1 và 3,5 A1 tại m/z 199 và 153, có thể là do sulfate tại vị trí số 4 của glucose. Các kết quả này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên. 10 Hì 4.4. P ổ ESI-MS sulfate u t S r ssu s r s w s t yp u Hì 4.5. P ổ ESI-MS/MS [Fu SO3]- t Hì 4.6. P ổ ESI-MS/MS [Fu 2SO3]- t i m/z 389 /z 243 11 Hì [Fu GluSO3]- t 4.7. P ổ ESI-MS/MS /z 405 O OH CH3 OH OH O C 1 , m /z 2 4 3 O H 3C OSO 0,3 A 1 , m /z 1 5 3 0,2 B 1 , m /z 2 2 5 OH 3 OH A 1 , m /z 1 8 3 O OH CH3 OH OSO 3 Z 1 , m /z 2 2 5 O O H 3C Y 1 , m /z 2 4 3 OH OH OH 0,2 X 1 , m /z 2 8 5 12 Hì 4.8. Sự p u t r u S. henslowianum ự v p ổ ESI-MS/MS Phổ ESI-MS với kỹ thuật ion hóa nhiều lần là một phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của ionic polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng. Các kết quả từ phổ MS cho phép kết luận r ng fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum thu thập tại bán đảo Sơn Trà, Thừa Thiên-Huế có mạch chính tạo thành từ α(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết (1-4). 4.3. Cấu trúc không gian của fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii và phức của nó với protein (Bovine Serum Albumin BSA) Hoạt tính sinh học của fucoidan không những bị ảnh hưởng bởi cấu trúc hóa học mà còn quyết định bởi cấu trúc không gian của phân tử. Trong số các loài rong nâu, Sargassum swartzii là một trong các loài rong có sản lượng lớn nhất ở nước ta. Đã có các công trình khác nghiên cứu về thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của fucoidan chiết tách từ loài rong này. Nh m có các nghiên cứu đầy đủ hơn về fucoidan từ loài rong nâu có sản lượng lớn này, trong luận án, cấu trúc không gian của fucoidan được chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập ở biển Nha Trang, ký hiệu FSW được nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành chiết tách và làm sạch fucoidan ở đây như quy trình tách chiết và làm sạch fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum ở trên. Kết quả phân tích thành phần hóa học của fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii được đưa ra ở Bảng 4.4. B 4.4. T p ầ ó fucoidan t ết t r u Sargassum swartzii Fucose 3,6 Thành phần đường (% mol) Galactose Mannose Xylose 3,2 1,9 1 Glucose Uronic acid % khối lượng Hàm lượng Sulfate % khối lượng 0,3 6,3 24,7 13 -6 × 10 23.0 F u co id a n in 0 .1 M N a C l F u co id a n in 0 .1 M N a C l 21 D a p p II / µ m ²/s K c /R × g /m o l 20.0 17.0 14.0 18 15 12 11.0 9 8.0 0.00 0.00 3.00 6.00 9.00 (q²+kc) × µm² M w (c): 1 .2 4 3 e + 0 5 g /m o l M w (q ²): 1 .2 4 3 e + 0 5 g /m o l A 2 : 1 .4 2 3 e -0 6 m o l d m ³/g ² R g : 5 .0 9 7 e + 0 1 n m 3.00 6.00 12.00 9.00 (q²+kc) × µm² 3 × 10 D z(c): 1 .1 4 3 e + 0 1 µ m ²/s D z(q ²): 1 .1 4 3 e + 0 1 µ m ²/s kD : 4 .2 0 5 e -0 2 d m ³/g C < S ²> : 1 .1 0 2 e -0 3 µ m ² 12.00 3 × 10 C :\A L V 5 0 0 0 W \T h u y\F 0 6 1 2 2 5 .sta C :\A L V 5 0 0 0 W \T h u y\F 0 6 1 2 2 5 .sta b a Hì 4.9. Sắ đồ p ép đ t x s tĩ (SLS) v độ (DLS) u t r âu Sargassum swartzii a) SLS, b)DLS Hì 4.10. Kết qu đ SAXS t u ị FSW 1 / tr ướ v tr 0,5 M N C : ( ) Đồ t ị Kr t y v (b) Đồ t ị Gu r Phương pháp tán xạ ánh sáng bao gồm cả tán xạ ánh sáng tĩnh (static light scattering SLS) và tán xạ ánh sáng động (dynamic light scattering DLS) được đo đồng thời để có thể thu được các thông tin chi tiết về mặt cấu trúc. Hình 4.9 đưa ra sắc đồ tán xạ ánh sáng của fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii. Từ đó, thu được các thông tin cấu trúc: trọng lượng phân tử, bán kính từ hồi chuyển Rg, bán kính động học Rh và giá trị  của mẫu fucoidan. Kết quả đưa ra trong Bảng 4.5. B 4.5. Kết qu đ t x s fucoidan t ết t r nâu Sargassum swartzii Rg Rh Dung môi dn/dc Mw x 10-3  (ml/g) (nm) (nm) (=Rg/Rh) NaCl 0,1M 0,119 124 51,0 21,5 2,4 14 Trọng lượng phân tử trung bình của fucoidan nghiên cứu là 124 kDa, hiện nay phương pháp tán xạ ánh sáng là một phương pháp xác định trọng lượng phân tử của polymer một cách chính xác. Giá trị  là 2,4 chỉ ra r ng cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử FSW là cấu trúc dạng hình que. Cấu trúc không gian của fucoidan ở kích thước cỡ nano được xác định b ng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS của dung dịch fucoidan 1mg/ml trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M được biểu diễn qua 2 biểu đồ Kratky và Guinier (Hình 4.10. a và b). Hàm lượng sulfate của mẫu fucoidan là 24,7% (Bảng 4.4) cho thấy mật độ nhóm sulfate trên mạch phân tử của fucoidan là khá cao. Qua biểu đồ Kratky, mẫu đo trong dung dịch nước cho thấy có pic tạo thành do lực đẩy tĩnh điện và pic này bị giảm cường độ khi dung dịch được thêm NaCl, điều này cho thấy sự có mặt của các nhóm sulfate. Qua biểu đồ Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc có thể tính được. Bán kính này khoảng 1,3nm ứng với phân tử polysaccharide có dạng hình que, đối với các polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh như carageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng 1nm điều này cho thấy FSW có khả năng là polysaccharide phân nhánh. Fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập ở biển Nha Trang có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Trong lĩnh vực hóa sinh, phức tạo thành giữa các polymer tự nhiên như protein, polysaccharide, acid nucleic đóng một vai trò quan trọng, quyết định chức năng sinh học của chúng. Mặc dù nhiều nghiên cứu về tương tác giữa sulfate polysaccharide và protein đã được công bố, nhưng hiểu biết chi tiết về ảnh hưởng của cấu trúc polysaccharide đến cấu trúc của protein vẫn chưa được làm sáng tỏ. Điểm đẳng điện (IP) của BSA là 4,7. Đối với hệ Bovine Serum Albumin - Fucoidan (BSA-Fucoidan), cả 2 thành phần protein và polysaccharide đều mang điện âm tại pH cao hơn điểm đẳng điện của protein và mang điện dương tại pH thấp hơn điểm đẳng điện của protein. Để quan sát sự tương tác và quá trình thay đổi cấu trúc của albumin trong phức với fucoidan tại 2 giá trị pH 7,4 và 4,0. Chúng tôi sử dụng tán xạ ánh sáng, một trong những phương pháp rất hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc của phân tử polymer trong dung dịch. 15 Trên hình 4.11 đưa ra sắc đồ của phép đo LS đối với hệ BSAFucoidan tại pH 7,4. Hình 4.11a là phép đo SLS và hình 4.11b là DLS. -6 × 10 8.40 49 A -F , p H 7 .4 , B u ff+ F u c D a p p II / µ m ²/s K c /R × g /m o l 7.80 7.20 A -F , p H 7 .4 , B u ff+ F u c 47 44 42 6.60 39 6.00 0.0 1.5 3.0 (q²+kc) × µm² 4.5 0.0 6.0 1.5 3 × 10 3.0 4.5 (q²+kc) × µm² M w (c): 1 .6 3 6 e + 0 5 g /m o l M w (q ²): 1 .6 4 7 e + 0 5 g /m o l D z(c): 3 .9 2 8 e + 0 1 µ m ²/s D z(q ²): 3 .9 2 4 e + 0 1 µ m ²/s A 2 : 7 .1 6 0 e -0 8 m o l d m ³/g ² R g : 3 .0 5 5 e + 0 1 n m kD : 1 .4 1 4 e -0 2 d m ³/g C < S ²> : 2 .2 0 1 e -0 4 µ m ² 6.0 3 × 10 C :\A L V 5 0 0 0 W \T h u y\A -f7 4 b .sta C :\A L V 5 0 0 0 W \T h u y\A -f7 4 b .sta Hì 4.11. Sắ đồ p ép đ t x s đố vớ BSAFucoidan t pH 7,4 ) SLS, b) DLS Kết quả của phép đo tán xạ ánh sáng của BSA và phức BSAFucoidan được đưa ra trong Bảng 4.6. B 4.6. Kết qu đ t x s BSA v p BSAFucoidan pH 7,4 4,0 Dung môi H2O Dung dịch đệm Dung dịch đệm + Fucoidan Dung dịch đệm Dung dịch đệm + Fucoidan Phức BSA BSA BSAFucoidan BSA BSAFucoidan dn/dc (ml/g)  Rg (nm) Rh (nm) (Rg/Rh) 0,170 Mw x 10-3 (g/mol) 66,0 26,8 3,6 7,4 0,180 125,4 24,6 5,9 4,2 0,160 164,7 30,5 6,3 4,8 0,164 186,5 20,9 6,5 3,2 0,140 211,8 54,0 57,1 0,95 Tại pH 7,4, trọng lượng phân tử của albumin đo được (125,4kDa) cao gần gấp đôi so với giá trị đưa ra của nhà sản xuất (66,4kDa) và giá trị đo được trong dung môi nước (66,0kDa). Điều này có thể giải thích do khuynh hướng dễ bị dimer hóa của albumin do trong phân tử của nó có chứa 17 cầu disulphit và 1 nhóm SH tự do rất dễ tạo liên kết dimer cộng hóa trị. Tại pH 7,4, cả albumin và fucoidan đều mang điện âm, do vậy giữa chúng tồn tại một lực đẩy, thông số cấu trúc và đại lượng  của BSA và BSA-Fucoidan nhận được từ phép đo tán xạ ánh sáng là gần 16 b ng nhau. Điều đó chứng tỏ r ng tương tác tĩnh điện giữa fucoidan và albumin là yếu. Giá trị  là rất cao (xem Bảng 4.6), với các giá trị như vậy, thì cả BSA và phức BSA-Fucoidan đều có cấu trúc hình que. Giá trị  giảm từ 4,2 tại pH 7,4 xuống 3,2 tại pH 4,0, điều đó chứng tỏ sự phụ thuộc vào pH của cấu hình albumin. Tại pH 4,0 albumin mang điện dương và fucoidan mang điện âm. Tại pH này albumin hình thành trimer như được chỉ ra b ng giá trị cao gấp 3 lần của trọng lượng phân tử (Bảng 4.6). Tại pH 4,0, phức BSA-Fucoidan tạo thành rất nhanh ngay khi nồng độ của cả protein và polysaccharide rất nhỏ. Phức có giá trị  = 0,95 nhỏ hơn 1, điều này khẳng định cấu trúc hình cầu của albumin. Như vậy, tại pH 4,0, b ng việc tạo phức với fucoidan, một polysaccharide mang nhóm sulfate, cấu hình của albumin đã chuyển từ cấu hình que sang cấu trúc hình cầu khi dung dịch trở nên môi trường acid. Phức tạo thành ngay ở nồng độ rất nhỏ và xảy ra nhanh, chứng tỏ fucoidan tương tác mạnh với albumin, điều này có thể gây ra bởi tương tác tĩnh điện Coulomb giữa các nhóm sulfate của polysaccharide với các vị trí liên kết trên phân tử protein. 4.4. Cấu trúc hóa học của alginate từ rong nâu Sargassum swartzii Phổ IR của alginate tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii thể hiện các dao động đặc trưng của 2 acid G và M. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của alginate được đưa ra trên Bảng 4.7. B 4.7. Kết qu p t p ổ IR t t ết t Sargassum swartzii Nhóm dao động Hình dạng -OH hóa trị (có liên kết H) -CH hóa trị Rộng, rất mạnh COO- hóa trị Nhọn, trung bình Nhọn, rất mạnh C-O-C hóa trị Nhọn, rất mạnh Guluronic cm-1 Manuronic cm-1 3428,99 3428,99 2936,49 2936,49 1414,79 1630,24 1027,77 1086,61 Thông tin nhận được từ phổ dao động được xem là kĩ thuật bổ sung trong việc nhận biết các loại polysaccharide từ rong biển, alginate khác nhau ở tỉ lệ và sự sắp xếp các đơn vị acid mannuronic và acid guluronic. Do đó, để xác định sự có mặt của đơn vị acid này cần dựa vào các dải phổ đặc trưng của chúng: trong khi các gulunonic cho dải hấp 17 thụ trong khoảng 1027,77 cm-1, các đơn vị mannuronic cho dải hấp thụ trong khoảng 1086,61 cm-1. Hình 4.12. P ổ IR t t ết t S r ssu sw rtz So sánh phổ hồng ngoại của mẫu alginate chiết tách được với phổ hồng ngoại của mẫu alginate của hãng OSAKA Hayashi pure Chemical Industries Ltd., Japan có thể thấy phổ của các mẫu alginate điều chế được thể hiện các pic dao động đặc trưng hoàn toàn tương tự với phổ này. Chúng tôi sử dụng phổ NMR để khẳng định cấu trúc của mẫu alginate tách chiết được từ rong nâu Sarrgasum swartzii. Phổ 13C-NMR được đưa ra trên Hình 4.13. Phổ 13C có 12 pic ứng với 12 nguyên tử carbon của 2 phân tử M và G, hai pic ở trường thấp nhất lần lượt được gán cho carbon anomer G1 (103,28) và M1 (102,22), do đây là những vị trí mà nguyên tử C liên kết với nhiều nguyên tử O nhất và sự che chắn của nguyên tử oxy từ liên kết axial là mạnh hơn từ liên kết equatorial. Carbon G6, M6 của nhóm carboxyl n m ở vùng trường thấp do mật độ điện tử lệch về phía các nguyên tử oxy có độ âm điện lớn trong nhóm nên có độ chuyển dịch hóa học lớn nhất trong phổ tương ứng ở 177,65 và 177,46ppm. Kế tiếp là tín hiệu của carbon C4 cộng hưởng ở khoảng 80-82ppm, tín hiệu này bị đẩy về phía trường thấp so vói các carbon còn lai do cũng là carbon tham gia liên kết glycoside, do vậy khẳng định được r ng liên kết glycoside trong phân tử alginate là liên kết 1→4. Ba carbon còn lại đều nối với nhóm OH nên có đặc điểm gần giống nhau. 18 Nhưng do cấu hình của hai gốc mannuronate và guluronate khác nhau, độ dịch chuyển hóa học có khác nhau, tín hiệu cộng hưởng của C2, C3 và C5 n m khá gần nhau trong phân tử guluronate trong khi đó phổ của mannuronate, pic cộng hưởng C5 lại tách ra xa hơn và lệch về phía trường yếu. Kết quả phân tích phổ 13C được đưa ra trong Bảng 4.8 và có sự phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố. B 4.8. Kết qu p t p ổ 13C-NMR t t ết t rong nâu Sargassum swartzii acid D-mannuronic (M) acid L-guluronic (G) Hình 4.13. P ổ 1H-NMR C1 102,22 103,28 C2 72,64 67,81 t t C3 74,01 71,79 C4 80,62 82, 56 ết t r C5 78,72 69,95 C6 177,46 177,65 u S. swartzii Việc nghiên cứu cấu trúc và giải phổ 1H-NMR của alginate sẽ thuận lợi hơn với sự hỗ trợ của các phổ hai chiều 2D-NMR - HSQC (Hình 4.14). Phổ HSQC là một công cụ hữu hiệu giúp ích cho việc gán phổ 1H-NMR khi đã phân tích được phổ 13C-NMR. Trên phổ HSQC, carbon anomer G-C1, với độ dịch chuyển hoá học 103,28ppm sẽ xác định được proton anomer tương ứng G-H1 có độ dịch chuyển hoá học 5,05ppm. Đây là độ dịch chuyển hoá học đặc trưng của H anomer. Lần lượt với các tín hiệu carbon khác sẽ xác định được vị trí cộng hưởng của proton G-H2 đến G-H5. 19 Đối với gốc M, điểm khởi đầu trên phổ HSQC cũng là carbon anomer M-C1 tại 102,22ppm, có liên hệ với proton A-H1 tại 4,65ppm,, pic này có cường độ rất bé. Đây là giá trị cộng hưởng đặc trưng của proton anomer H. Từ đây cho phép khẳng định liên kết glycoside tại carbon anomer của guluronate G là liên kết kiểu  và của manuronate là kiểu . Hì 4.14. P ổ HSQC t t ết t r u S.swartzii Việc phân tích và gán phổ ở trên cho phép một lần nữa khẳng định cấu trúc của alginate là được tạo thành từ hai gốc acid β-Dmannuronic và acid α-L-guluronic qua liên kết glycoside 1→4 với các số liệu phổ 1H-NMR như đưa ra trên Bảng 4.9. B 4.9. Kết qu p t p ổ 1H-NMR t t ết t rong nâu Sargassum swartzii H1 H2 H3 H4 H5 H6 D-mannuronic acid (M) 4,65 3,97 3,73 3,89 3,71 - L-guluronic acid (G) 5,05 3,89 4,02 4,12 4,45 - 20 Hì 4.15. P ổ 1H-NMR t t ết t r u S. sw rtz Tỷ lệ M/G là thông số cấu trúc quan trọng đối với alginate vì các ứng dụng của chúng là tùy vào tỷ lệ này. Với độ phân giải tốt của phổ 1H-NMR của mẫu alginate mà chúng tôi ghi được (Hình 4.16), cho thấy không những chỉ xác định được tỷ lệ M/G mà còn có thể xác định được tỷ lệ của các mảnh khối trong co-polymer này, bao gồm bốn mảnh bộ đôi (FMM, FMG, FGM và FGG) và bốn mảnh bộ ba (FMGG, FGGG, FGGM và FMGM). Ở đây, chúng tôi áp dụng kết quả nghiên cứu của Fenoradosoa kết hợp với nghiên cứu của David để xác định tỷ lệ M:G và phân bố các chuỗi trong mẫu alginate nghiên cứu. Hình 4.16. Phổ 1H-NMR c a alginate t rong nâu Sargassum swartzii
- Xem thêm -