Tài liệu Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 phân lập tại rừng quốc gia hoàng liên

  • Số trang: 73 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 635 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRỊNH THÀNH TRUNG Hà Nội - Năm 2013 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ..................................... 3 1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens ............................................ 3 1.1.2. Lịch sử phát hiện ................................................................................. 4 1.1.3. Phân loại .............................................................................................. 5 1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên ....................................... 5 1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS .......................... 5 1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp .............................................................. 5 1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh ...................................................................... 6 1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh .................................................................... 6 1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics............................................................... 7 1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG .............................. 7 1.3.1. Xylanase .............................................................................................. 7 1.3.2. α-amylase .......................................................................................... 10 1.3.3. Protease ............................................................................................. 13 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG ................................................ 15 2.2. NGUYÊN LIỆU ....................................................................................... 15 2.2.1. Chủng vi sinh vật ............................................................................... 15 2.2.2. Môi trƣờng......................................................................................... 15 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................. 16 2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động .................................................................. 16 2.3.2. Phân tích trình tự đa gen .................................................................... 16 2.3.3. Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu ............................ 18 2.3.4. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh enzyme ngoại bào cao ............................................................................. 20 2.3.5. Phƣơng pháp xác định protein ............................................................ 21 2.3.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào .............................. 21 2.3.7. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào.......................................... 25 2.3.8. Xác định đặc tính enzyme ngoại bào .................................................. 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 28 3.1. LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU ................................. 28 3.1.1. Tuyển chọn chủng.............................................................................. 28 3.1.2. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA ......................................... 28 3.1.3. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen................................................ 29 3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 ..................................... 30 3.2.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................. 30 3.2.2. Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901 ............................................... 31 3.3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO ...................... 38 3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp ........................ 38 3.3.2. Tinh sạch enzyme ngoại bào bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion ... 41 3.3.3. Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel .......................... 43 3.3.4. Xác định trọng lƣợng phân tử xylanase bằng điện di SDS-PAGE ...... 44 3.3.5. Hiệu quả tinh sạch xylanase từ chủng SP 1901 .................................. 45 3.4. ĐẶC TÍNH ENZYME ............................................................................. 46 3.4.1. Nhiệt độ tối ƣu ................................................................................... 46 3.4.2. Khả năng bền nhiệt ............................................................................ 47 3.4.3. pH tối ƣu............................................................................................ 48 3.4.4. Khả năng bền axít .............................................................................. 49 3.4.5. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất............................................... 50 3.4.6. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................ 51 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác nhau. 33 Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại đƣờng…………………………………. 34 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng…………………………………... 35 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phƣơng pháp sử dụng kit API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) của chủng SP 1901………………………………….……………………………… 40 Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bƣớc tinh sạch……………………… 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme xylanolytic………………………………….………………………… 8 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin……………………. 11 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide……… 13 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang BSA………………………………. 21 Hình 2.2. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang xylose…………………………….. 22 Hình 2.3. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang glucose……………………………. 23 Hình 2.4. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang L-tyrosine………………………… 24 Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….………….. 28 Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis………………………………….…………………………………….. Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm 30 gram (b) và soi nổi (c) ………………………………….……………………. Hình 3.4. pH sinh trƣởng tối ƣu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả năng chịu dịch dạ dày (c). Khả năng chịu muối mật (d) …………………………… Hình 3.5. Khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng IAA của chủng SP 1901 sau 24, 48 và 72 giờ………………………………….……………………… 31 31 32 Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a). Ảnh hƣởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trƣởng của cây ngô sau 10 ngày trồng (b) ………………………………….………………………… Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a). 32 Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ……………………… Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API ZYM………………………………….……………………………………… Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn 36 Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ……………………………………… Hình 3.10. Khả năng sinh trƣởng trên các môi trƣờng khác nhau (a, b) và hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi trƣờng ở các giờ khác nhau………………………………….………………. 38 37 39 Hình 3.11. Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể tại các giờ khác nhau………………………………….………………………… 39 Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trƣờng có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể…………………… 40 Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký 41 trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….………… Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký 42 trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… 42 Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36…………………… 45 Hình 3.20. Nhiệt độ hoạt động tối ƣu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901…………………………………………………………… Hình 3.21. Khả năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… Hình 3.22. pH hoạt động tối ƣu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ 46 chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23. Khả năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… Hình 3.24. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901………………………………………………… Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ cơ chất xylan bởi xylanase của chủng SP 1901…………………………………… 47 49 50 52 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS Dinitrosalicylic IAA Indole-3-acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở nên rất phổ biến. Con ngƣời đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con ngƣời đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm nhƣ vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con ngƣời. Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã đƣợc sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công nghiệp thực phẩm, con ngƣời đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật còn đƣợc ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nƣớc thải trong sản xuất công nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời. Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến dƣới nƣớc, từ nƣớc ngọt đến nƣớc mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dƣơng. Ngoài các loài vi khuẩn gây bệnh cho con ngƣời nhƣ B. anthracis và B. cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nhƣ y dƣợc học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi trƣờng. Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau: (i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên. (ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dƣới loài. 1 (iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn. (iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis [45]. B. subtilis đƣợc Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là ―Vibrio subtilis‖. Năm 1872, nhà sinh học ngƣời Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis. Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi. Từ đó đến nay, B. subtilis đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ ―Subtilis therapy‖ (điều trị bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi để phòng ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy. Hiện nay, B. subtilis đã đƣợc chứng minh có tiềm năng to lớn trong nhiều lĩnh nhƣ chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trƣờng [8]. Vi khuẩn B. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trƣờng tự nhiên. Phần lớn cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là ―trực khuẩn cỏ khô‖. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B. subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng và chao [12]. B. subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó. Công trình nghiên cứu của Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme tƣơng đối hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein. Ngoài ra, B. subtilis còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nhƣ bacitracin, bacilysin, bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những chất này có tác dụng ức chế sinh trƣởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác. Chúng tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và nấm gây bệnh [9]. Nhóm B. subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. velezensis. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh đó, phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào 3 và bào tử cũng nhƣ các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thƣờng đƣợc gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B. subtilis [45]. Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài và dƣới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong nhóm này đã đƣợc phân tách thành các loài phụ nhƣ B. subtilis đƣợc phân thành B. subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp. inaquosorum; B. amyloliquefaciens đƣợc phân thành B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42]. Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phƣơng pháp phân loại hiện đại. Hiện nay ở Việt Nam hầu nhƣ chƣa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dƣới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen. 1.1.2. Lịch sử phát hiện B. amyloliquefaciens đƣợc Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chƣa đƣợc xếp loại trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới đƣợc công bố [43]. Thời gian đầu, loài vi khuẩn này đƣợc xem là dòng khác của B. subtilis hay loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều đặc điểm tƣơng đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng các phƣơng pháp phân loại thông thƣờng rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm 1987, B. amyloliquefaciens mới đƣợc tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả lai DNA lần lƣợt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus [43]. Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã đƣợc công bố. Năm 2010, Borriss và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng kỹ thuật microarray, tính tƣơng đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM7 không 4 có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật. Dựa vào kết quả thu đƣợc, Borriss đã đề xuất tách B. amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum (có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) và B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens (không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) [23]. 1.1.3. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc: Giới: Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Nhóm: Bacillus subtilis Loài: Bacillus amyloliquefaciens 1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên B. amyloliquefaciens thƣờng có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dƣơng, sinh nội bào tử, có khả năng di động và kích thƣớc tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23]. 1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp Loài vi khuẩn này đƣợc biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại enzyme ngoại bào đa dạng. Từ những năm 1943, B. amyloliquefaciens đã đƣợc sử dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease [43]. Enzyme từ B. amyloliquefaciens nhƣ amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý nhƣ khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa [21]. 5 Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật có khả năng sinh phytase đã đƣợc công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã đƣợc biểu hiện thành công trên chủng B. subtilis MU331 [31]. Phytase là enzyme phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng do hàm lƣợng phosphate dƣ thừa thải ra môi trƣờng nƣớc [29]. 1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã đƣợc biết đến nhờ khả năng sinh các chất kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi bậc hai khác nhƣ chất kháng virus, chất kháng ung thƣ và chất ức chế miễn dịch [47]. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide đƣợc tổng hợp qua ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn hẹp và thƣờng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã đƣợc công bố từ loài B. amyloliquefaciens nhƣ bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38]. Bacylicin là chất dipeptide đƣợc tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm Lanticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động nhƣ chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dƣơng. 1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng Indole-3-acetic axít (IAA). Chất này sẽ tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật nhƣ quang hƣớng động, địa hƣớng động, ƣu thế chồi ngọn và sự tƣợng rễ. Yao và cộng sự (2012) đã thử nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông. 6 Kết quả cho thấy, sản lƣợng bông thu hoạch đƣợc tăng 30% so với đối chứng bổ sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng indole-3-acetic axít của chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lƣợng tƣơi của bèo tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi khuẩn B. amyloliquefaciens đã đƣợc chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trƣởng thực vật [31]. 1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as safe; GRAS) và có thể dùng nhƣ probiotics để bổ sung vào thức ăn hoă ̣c nƣớc uố ng nhằm cân bằ ng hê ̣ vi sinh đƣờng ruô ̣t , qua đó ngăn ngƣ̀a và phòng chố ng các bê ̣nh tiêu chảy thƣờng gă ̣p . Ngoài ra , vi sinh vật trong probiotics còn tăng cƣờng khả năng chuyển hóa lactose, điề u hòa hê ̣ thố ng miễn dich ̣ và tăng cƣờng sƣ́c khỏe con ngƣời [48] [49]. Nhiều bằng chứng cho thấy B. amyloliquefaciens đã đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotics [53]. 1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 1.3.1. Xylanase 1.3.1.1. Cấu trúc xylan Xylan là thành phần chính của hemicellulose và là polysaccharide phổ biến thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Chúng đƣợc tìm thấy trong thành tế bào thực vật [50]. Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic giữa đƣờng xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39]. 7 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme xylanolytic [34]. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl đƣợc nối với nhau bằng liên kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Thông thƣờng, xylan chiếm khoảng 15-30% trọng lƣợng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần. Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lƣợng khô của chúng [35]. Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tƣơng hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đƣờng [34]. 1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57]. Các loại xylanase đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ƣa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [39]. 1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic (hình 1.1.). 8 Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể nhƣ sau:  β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase Enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó, β -1,4-endoxylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh ra, chẳng hạn nhƣ các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55]. Ferulic axít esterase là enzyme ngoại bào exoglycosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đƣờng xylose [57]. Trong số các cơ chất, xylobiose thƣờng là cơ chất tốt nhất [39]. Hầu hết các ferulic axít esterase đƣợc nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế ngƣợc bởi xylose, một sản phẩm thủy phân của chúng.  α-L-Arabinofuranosidase α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và 1,5-αL-arabinofuranosyl trong arabinoxylan giải phóng arabinose. Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide [55].  α-D-Glucuronidase α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axít glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39].  Acetyl xylan esterase Acetyl xylan esterase là enzyme có thể cắt đứt liên kết giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [34]. Enzyme này thƣờng đƣợc sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm. 1.3.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase Xylanase đƣợc ứng dụng trong sản xuất nƣớc hoa quả và làm trong rƣợu. Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 60- 9 70oC) nên có thể ngăn chặn đƣợc sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nƣớc hoa quả ở nhiệt độ cao [27]. Xylanase còn đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ trong công nghệ sản xuất bánh nƣớng, hỗ trợ quá trình đƣờng hóa lignocellulose (một polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn đƣợc sử dụng để loại lignin khỏi bột giấy. Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng. Xylanase giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11]. Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm môi trƣờng. 1.3.2. α-amylase 1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt nhƣ khoai lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin. Amylose đƣợc cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin đƣợc cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. 10 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14]. Glycogen đƣợc ví nhƣ tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống với tinh bột nhƣng mức độ phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các phân tử glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside. Ở các vị trí phân nhánh glucose nối với nhau băng liên kết α-1,4-glucoside. Glycogen có ở động vật và ngƣời, chúng tập trung chủ yếu ở gan. 1.3.2.2. Nguồn sản sinh α-amylase Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm sợi là những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có ƣu điểm chịu nhiệt tốt hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85-95oC [34]. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Có 6 loại amylase đƣợc xếp vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase gồm α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Exoamylasse gồm có β-amylase và glucoamylase. 1.3.2.3. Đặc tính hoạt động của α-amylase Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự hiện diện của ion canxi trong phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động đƣợc. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu 11 nhiên không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy. Quá trình thủy phân tinh bột bở α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: dextrin hóa  đƣờng hóa  phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen  sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờng hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dƣới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì không phân cắt đƣợc liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đƣờng nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1]. 1.3.2.4. Ứng dụng của α-amylase Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã đƣợc con ngƣời sử dụng từ rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, ngƣời ta thƣờng bổ sung α-amylase vào bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của α-amylase sẽ làm tăng lƣợng đƣờng khử, lƣợng đƣờng khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2]. Cả α-amylase và β-amylase đều đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh mì. Các loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đƣờng, nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO2, làm tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2]. Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thƣờng sử dụng α-amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp đƣợc sản 12
- Xem thêm -