Tài liệu Nghiên cứu bệnh do potyvirus gây ra trên cây hoa trồng bằng củ tại hà nội

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- NGUYỄN THỊ THU NGHIÊN CỨU BỆNH DO POTYVIRUS GÂY RA TRÊN CÂY HOA TRỒNG BẰNG CỦ TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI - 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan! Bản luận văn tốt nghiệp này ñược hoàn thành bằng sự nhận thức chính xác của bản thân. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Trân trọng cám ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình ñiều tra, tiến hành các thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình ñến tất cả các bạn bè, người thân và gia ñình ñã luôn ñộng viên và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2011 Tác giả Nguyễn Thị Thu Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt v Danh mục bảng biểu vii Danh mục các hình vii 1 MỞ ðẦU i 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích - Yêu cầu 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Cây hoa ñược trồng bằng củ 3 2.2 Potyvirus 4 2.3 Các phương pháp cơ bản dùng trong xác ñịnh virus 10 2.4 Bệnh virus hại cây hoa có củ 12 2.5 Tính kháng tập nhiễm hệ thống 17 2.5.1 ðịnh nghĩa 17 2.5.2 Tác nhân gây kích kháng 18 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 23 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Bệnh virus trên cây hoa trồng bằng củ 34 4.1.1 Mô tả triệu chứng 34 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iii 4.1.2 ðiều tra tình hình bệnh virus trên hoa trồng bằng củ vụ ñông xuân 2011 4.2 36 Kết quả kiểm tra virus (TMV và CMV) trên một số mẫu bệnh cây hoa trồng bằng củ. 37 4.3 Xác ñịnh virus bằng RT-PCR dùng mồi ñặc hiệu chi Potyvirus 39 4.3 Xác ñịnh LMoV trên hoa bằng RT-PCR dùng mồi ñặc hiệu 42 4.4 Xác ñịnh potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn ñỏ 44 4.4.1 RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gen potyvirus 44 4.4.2 Kết quả dòng hóa sản phẩm RT-PCR 46 4.4.3 Kết quả giải trình tự 50 4.4.4. Kết quả tìm kiếm chuỗi tương ñồng trên ngân hàng gien 54 4.4.5 Phân tích gen CP 56 4.4.6 Phân tích phả hệ dựa trên vùng CP 57 4.4.7 Kết quả xác ñịnh phổ ký chủ của virus mới 63 4.5 Kết quả ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích kháng trên cây loa kèn trắng. 64 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 69 5.1 Kết luận 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 71 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ðHNNHN NCBI : ðại học Nông nghiệp Hà Nội : National Center for Biotechnology Information OD Optical density Reverse Transcriptional – Polymerase Chain RT-PCR : KHT : Kháng huyết thanh LKð : Loa kèn ñỏ LKT Reaction Loa kèn trắng Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 3.1 Các mồi dùng trong nghiên cứu 4.1 Triệu chứng chính của 3 bệnh giống bị nhiễm virus trên 3 cây 25 hoa trồng bằng củ 34 4.2 Tỷ lệ bệnh virus trên một số cây hoa trồng bằng củ. 36 4.3 Kiểm tra ELISA một số Virus trên các mẫu bệnh thu thập 38 4.4 Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ñặc hiệu Potyvirus 40 4.5 Kết quả kiểm tra RT-PCR với mồi ñặc hiệu LMoV trên các mẫu hoa loa kèn ñỏ và hoa loa kèn trắng 43 4.6 Kết quả RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gen potyvirus trên hoa loa kèn ñỏ 45 4.7 Kiểm tra PCR khuẩn lạc của 2 mẫu LKð-1 và 4 47 4.8 Kiểm tra sản phẩm Miniprep bằng enzyme cắt giới hạn 49 4.9 Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR 50 4.10 Kết quả tìm kiếm trên ngân hang gen bằng phần mềm Blast 54 4.11 So sánh trình tự gen CP của mẫu virus dòng LKð-1-3 với các mẫu virus gần gũi nhất trên ngân hàng gen 58 4.12 Danh tính các potyvirus ñược sử dụng trong phân tích phả hệ 59 4.13 Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên hoa loa kèn ñỏ 63 4.14 Tỉ lệ bệnh trước và sau khi xử lý chất kích kháng 66 4.15 Hiệu lực phòng trừ của các chất kích kháng 67 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hình thái virion của potyvirus (http://viralzone.expasy.org/) 5 2.2 Tổ chức bộ gien và chiến lược dịch mã của potyvirus 6 3.1 Bản ñồ giới hạn Vector pTZ57R/T 4.1 Bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng (1, 2), biến dạng lá hoa ly (3) khảm lá hoa loa kèn ñỏ (4) 4.2 22 35 Kết quả kiểm tra virus CMV và TMV trên cây hoa Loa kèn trắng, loa kèn ñỏ, Ly bằng ELISA 39 4.3 Sơ ñồ bộ gen potyvirus và vị trí tương ñối của 2 cặp mồi 39 4.4 RT-PCR phát hiện potyvirrus trên loa kèn trắng và loa kèn ñỏ dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev. 41 4.5 Vị trí cặp mồi ñặc hiệu LMoV trên bộ gen potyvirus 42 4.6 Phát hiện LMoV bằng RT-PCR trên các mẫu loa kèn trắng và loa kèn ñỏ bị bệnh khảm lá. 4.7 Sơ ñồ tổ chức bộ gen potyvirus và vị trí tương ñối của 3 mồi NIbFor1, N1 và mồi N1T. 4.8 43 45 Kết quả RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gien potyvirus trên hoa loa kèn ñỏ 46 4.9 Nuôi tế bào vi khuẩn E.coli ñã ñược biến nạp plasmid tái tổ hợp 47 4.10 Kiểm tra PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi Vector SeqFor/Vector SeqRev 4.11 48 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI. M là thang DNA (GeneRuler 1 kp, Fermentas) với các băng tham khảo ñược chỉ rõ bằng mũi tên. 4.12 49 Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần ñồ thị trình tự 53 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vii 4.13 Trình tự amino acid của protein CP của 3 mẫu virus và motif DAG ở ñầu N cần cho lan truyền qua vector 4.15 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen CP của các potyvirus. Chỉ trình bày giá trị boostrap > 50% (1000 lần lặp). 4.16 64 Thí nghiệm ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích kháng trên ruộng cây loa kèn trắng 4.18 62 Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên cây hoa loa kèn ñỏ 4.17 57 65 So sánh triệu chứng ở cây ñược xử lý chất kích kháng Salicylic acid 1.0 mM (1) và cây ở công thức ñối chứng (2) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 67 viii 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Hoa ñóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm vừa mang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế. Hiện nay ở nước ta, trong chương trình chuyển dịch cơ cấu cây trồng, cây hoa lại càng ñược quan tâm. Hàng năm có nhiều giống hoa ñược lai tạo và nhập nội, nhiều tiến bộ kỹ thuật mới ñược nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên diện tích trồng hoa ngày càng ñược nâng cao. Hoa ñược trồng lâu ñời và tập trung một số vùng trồng hoa truyền thống như Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), ðằng Hải, ðằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn (Thanh hoá), Gò Vấp, Hóc Môn (TP. Hồ Chí Minh)...với tổng diện tích trồng khoảng 3500 ha. Trong các loại hoa tươi ñược tiêu thụ ở Việt Nam thì hoa ly, lily trắng, lay ơn là những loại hoa trồng bằng củ ñược ưa chuộng nhất. ðây có thể ñược coi là những loài hoa cao cấp không chỉ bởi vẻ ñẹp, sự sang trọng mà còn bởi chi phí ñầu tư cho sản xuất cũng như chăm sóc vô cùng tốn kém. Chủng loại của chúng ngày càng ña dạng và phong phú theo thị hiếu của người tiêu dùng .Ngày nay, việc sản xuất hoa trồng bằng củ chịu nhiều thiệt hại ñáng kể do virus gây ra. Hầu hết các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus - chi lớn nhất trong sáu chi của họ Potyviridae. Bệnh do Potyvirus gây thiệt hại nghiêm trọng ñến thẩm mỹ và kinh tế cho nhà trồng hoa. Chi virus này xuất hiện phổ biến ở các nước nhiệt ñới và cận nhiệt ñới như Việt Nam. Virus có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau ở cây ký chủ như khảm, ñốm, sáng gân, lùn cây, héo, còi cọc…. Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về Potyvirus trên Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 1 cây hoa trồng bằng củ .Vì vậy, ñể có thể góp phần cung cấp thêm thông tin về loài virus này ñể từ ñó có biện pháp phòng trừ hợp lý, ñạt hiệu quả cao, dưới sự hướng dẫn của TS. Hà Viết Cường, bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu bệnh do Potyvirus gây ra trên cây hoa trồng bằng củ tại Hà Nội”. 1.2. Mục ñích - Yêu cầu 1.2.1. Mục ñích
ðiều tra bệnh do Potyvirrus trên cây hoa trồng bằng củ.
Tìm hiểm khả năng phòng trừ bệnh khảm lá hoa loa kèn trăng (Lily mottle virus, LMoV) bằng chất kích kháng. 1.2.2. Yêu cầu
ðiều tra xác ñịnh virus trên cây hoa trồng bằng củ (hoa Loa kèn trắng, hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly) tại Hà Nội.
Kiểm tra ELISA trên các mẫu bệnh trên cây hoa Loa kèn trắng, hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly.
Kiểm tra RT-PCR, PCR trên một số mẫu bệnh trên cây hoa Loa kèn trắng, cây hoa loa kèn ñỏ.
Nhân dòng và giải trình tự mẫu loa kèn ñỏ phản ứng RT-PCR dương tính.
Phân tích trình tự.
ðánh giá khả năng lây nhiễm virus trên một số cây kí chủ.
ðánh giá hiệu quả phòng trừ LMoV bằng chất kích kháng. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây hoa ñược trồng bằng củ Cây hoa trồng bằng củ thuộc hơn 800 chi khác nhau, rất ña dạng về hình thái, có thể thuộc nhiều họ thực vật khác nhau như: Liliaceae (white lily, easter lily, tulip, hoa hiên), Iridaceae (lay ơn, diên vĩ, nghệ tây - Crocus spp.), Agavaceae (hoa huệ, thùa), Amaryllidaceae (loa kèn ñỏ, thủy tiên, náng, ngọc trâm), Asteraceae (thược dược), Cannaceae (chuối hoa)… Cây hoa trồng bằng củ ñược ñánh giá là loài hoa sang trọng, có giá trị thẩm mỹ cao nên ñược nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Cây hoa trồng bằng củ có ñóng góp ñáng kể cho ngành công nghiệp trang trí toàn cầu, ñược sử dụng ñể sản xuất thương mại hoa và củ. Các cây hoa có thể ñược dùng làm hoa cắm lọ trong gia ñình, văn phòng, ñược sử dụng nhiều trong các ngày lễ tết, trang trí hội trường, làm quà tặng,… Ngoài giá trị thưởng thức, nhiều loài còn có tác dụng chữa bệnh. Chẳng hạn như, hoa hiên có vị ngọt, tính mát, thường dùng làm thuốc lợi tiểu, giảm ñau, chữa sốt, thân thể bị vàng, tiểu tiện khó khăn, lỵ, chảy máu cam, sưng ñau khớp xương, nôn ra máu…(Võ Văn Chi, 1999). Trên thế giới, giá trị của ngành công nghiệp sản xuất hoa ước tính trên 1 tỷ ñô la, và loài phổ biến là tulip và lily. Việc nhập khẩu và sử dụng hoa trồng bằng củ ñóng một vị trí ñáng kể trong sản xuất hoa cắt toàn cầu. Hà Lan, nước ñứng ñầu thế giới về sản xuất củ hoa, năm 2005 ñã ñạt 29.491 ñôla Mỹ/ha, giá trị xuất khẩu là 34.048 ñô la/ha. Tổng giá trị xuất khẩu năm 2005 ñạt 756 tỷ ñô la/ha, tron khi tổng giá trị xuất khẩu có các nước liên minh Châu Âu ñạt trên 837 tỷ ñô la. Có ít nhất là 15 quốc gia sản xuất củ tulip, vùng sản xuất lớn nhất là Hà Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 3 lan với 10. 800 ha (chiếm 88 % diện tích toàn thế giới). Củ tulip cũng ñược sản xuất ở Nhật bản (300 ha), Pháp (293 ha), ðức (155 ha), New Zealand (122 ha). Trong các nước sản xuất củ Lily, vùng lớn nhất là Hà Lan với 4. 280 ha chiếm 77%, tiếp ñó là Pháp (401 ha), Chi Lê (205 ha), Mỹ (200 ha), Nhật Bản (189 ha) và New Zealand (110 ha). (Benschop , 2010) Tại Việt Nam hiện có nhiều vùng trồng hoa như: ðà Lạt (Lâm ðồng), Mê Linh (Vĩnh Phúc), Tây Tựu, ðằng Hải (Hải Phòng), Sapa (Lào Cai)... ðà Lạt là nơi hiện ñang có diện tích trồng Lily nhiều nhất so với các ñịa phương khác trên cả nước (chiếm khoảng 8% trong tổng diện tích trồng hoa), còn ở Hà Nội, Hải Phòng chỉ mới trồng mang tính chất thử nghiệm. Tình hình phát triển hoa Lily ở ðà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu ñãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa Lily nói riêng, một phần do kỹ thuật trồng Lily của ðà Lạt tương ñối cao nên hoa sinh trưởng phát triển khá tốt. Lily, trong ñó hoa loa kèn (Lilium longiforum var Rairan) là giống hoa mới có nguồn gốc tại Hà Lan. Hiện nay cây hoa loa kèn trồng khá phổ biến ở Việt Nam. ðây là giống loa kèn cho hoa to, màu trắng, có mùi thơm dịu, thích hợp với các ñiều kiện ñất ñai, khí hậu thời tiết ở các tỉnh phía Bắc nước ta, ñặc biệt là vùng ñồng bằng sông Hồng. Thời gian từ trồng ñến thu hoạch ngắn, chỉ từ 80 ñến 90 ngày tùy theo từng thời vụ. Giống ưa cường ñộ ánh sáng trung bình; có khả năng chịu nóng khá, ưa khí hậu lạnh và ẩm, nhiệt ñộ thích hợp ban ngày 20-28oC, ban ñêm 13-17oC (có khả năng chịu ñược tới 32-35oC). 2.2. Potyvirus 2.2.1. Giới thiệu Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng 200 loài. Như vậy, cùng với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyvirus là chi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 4 virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật. Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cây có ý nghĩa kinh tế. Ví dụ: • Papaya ringspot virus (PRSV) là bệnh virus số 1 hại ñu ñủ và bầu bí. • Turnip mosaic virus (TuMV) hại cây rau họ thập tự và ñược xem là virus quan trọng thứ 2 trên cây rau. • Bean common mosaic virus (BCMV) trên cây họ ñậu. • Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác. • Plum pox virus (PPV) là virus quan trọng nhất trên cây quả hạch như ñào, táo, lê, mận. Phần lớn virus trong họ có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số ít lại có phổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm. 2.2.2. ðặc ñiểm phân tử virus (virion)  Phân tử potyvirus có hình sợi mềm, kích thước 11-15 x 650-950 nm (Dougherty, 1988). Mỗi phân tử virion ñược cấu tạo từ 1700-2000 tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn ñối xứng xung quanh phân tử RNA genome (Shukla et al., 1998). Hình 2.1: Hình thái virion của potyvirus (http://viralzone.expasy.org/) Acid nucleic: Tất cả các potyvirus có chứa 1 phân tử RNA genome sợi ñơn, cực (+), kích thước khoảng 10 kb (Shukla et al., 1998). Tổ chức bộ gen của các potyvirus giống nhau, tính từ trái sang phải là:  ðầu 5’ chứa 1 vùng không dịch mã (5’UTR).  Một khung ñọc mã ORF (open reading frame) ñơn, lớn gọi là Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 5 ORF chính (major ORF).  ðầu 3’ chứa 1 vùng không dịch mã (3’UTR) và 1 chuỗi polyA (Hari, et al., 1979; Takahashi, et al., 1997). Hình 2.2: Tổ chức bộ gien và chiến lược dịch mã của potyvirus (http://viralzone.expasy.org/)  Protein:  Bộ gen virus chứa 1 ORF lớn, mã hóa 1 polyprotein.  Polyprotein sẽ ñược xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng: protein P1, protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro), protein P3, protein 6K1, protein thể vùi tế bào chất (CI), protein 6K2, protein VPg (viral protein genome-linked, Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Riechmann et al., 1989; Murphy et al., 1990), protein NIa-pro (major protease of small nuclear inclusion protein - NIa), protein NIb (large nuclear inclusion protein) và protein vỏ (coat protein, CP) (Shukla et al., 1998). Protein VPg gắn vào ñầu 5’ của RNA genome.  Thể vùi: các potyvirus thường tạo các thể vùi ñặc trưng.  Tất cả các potyvirus ñều hình thành thể vùi trong tế bào chất hình trụ.  Thể vùi tế bào chất hình thành từ protein CI (cytoplasmic inclusions, CI), có hình dạng ñặc trưng (hình vòng bánh xe, hình phiến,…) cho potyvirus và do ñó có giá trị chẩn ñoán.  Một số virus lại hình thành thể vùi trong nhân gọi là thể vùi nhân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 6 (nuclear inclusion, NI). Thể vùi nhân ñược cấu tạo bởi 2 protein là NIa và NIb. Một số virus cũng hình thành thể vùi trong nhân nhưng hình dạng thể vùi không xác ñịnh gọi là thể vùi vô ñịnh hình (amorphor inclusion, AI) ñược cấu tạo bởi protein HC-Pro. 2.2.3. Chức năng các protein P1  P1 là 1 proteinase. P1 là vùng biến ñộng nhất của bộ gen. P1 có hoạt tính proteinase và sẽ tự cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã ñể giải phóng P1.  P1 tương tác với RNA. P1 có khả năng liên kết với RNA của virus, do vậy nó có vai trò trong quá trình vận chuyển virus.  P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông qua cơ chế câm gen). HC-Pro  HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector. Vai trò này của protein HC-Pro ñược thể hiện qua cơ chế bắc cầu. HC-Pro ñóng vai trò là một phân tử cầu nối, trong ñó phần ñầu N của nó (thông qua motif bảo thủ cao KITC) sẽ liên kết với receptor ở bề mặt phía trong của vòi aphid, còn phần trung tâm của nó (thông qua motif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ của virion. Nhờ cầu nối này mà phân tử virus ñược giữ lại ở phần vector.  HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào. HC-Pro là một protein vận chuyển (MP) của potyvirus. HC-Pro làm tăng kích thước giới hạn (size exclusion limit, SEL) của sợi liên bào và do ñó cho phép RNA của virus có thể di chuyển giữa các tế bào.  HC-Pro có hoạt tính proteinase. ðầu C của HC-Pro có hoạt tính proteinase, cho phép nó tự cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3.  HC-Pro cần cho sự tái bản (thông qua motif IGN).  HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào. ðây là một chức năng quan trọng của potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 7 P3 P3 cũng là vùng biến ñộng và ít ñược nghiên cứu chức năng. P3 ñược biết là quy ñịnh tính gây bệnh của virus thông qua tương tác với các protein khác của virus. CI  CI là thành phần chính của phức hợp tái bản virus. CI có hoạt tính helicase, hoạt tính liên kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP. Tất cả các hoạt tính này ñều cần thiết cho CI tháo xoắn cấu trúc trung gian sợi kép của RNA virus trong quá trình tái bản.  CI cần cho sự di chuyển của virus giữa các tế bào. Quá trình di chuyển giữa các tế bào yêu cầu năng lượng. Do CI có hoạt tính ATPase nên nó ñảm nhận vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển virus qua các tế bào. Ngoài ra, CI tương tác trực tiếp với plasmodesmata và phức hợp ribonucleoprotein của virus ñể tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển. 6K1 và 6K2  6K1 tương tác với P3 ñể quy ñịnh tính gây bệnh của virus.  6K2 là một protein mỏ neo giúp liên kết bộ máy tái bản của virus vào mạng lưới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái bản. VPg  VPg chính là phần ñầu N của NIa. VPg cũng là một protein cấu trúc vì ngoài protein CP, nó có mặt trong phân tử virus. VPg liên kết vào ñầu 5’ của RNA virus và bảo vệ phân tử RNA khỏi bị phân hủy.  VPg cần cho quá trình tái bản bộ gen virus, di chuyển hệ thống của virus trong cây.  VPg tương tác với yếu tố khởi ñầu dịch mã của tế bào như eIF4E và eIF(iso)4E, do ñó cho phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 8 tháo vỏ ñể thực hiện quá trình dịch mã. Cần chú ý là potyvirus có bộ gen RNA sợi ñơn cực (+), phân tử RNA genome của virus không ñược mũ hóa nên quá trình dịch mã ORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã ñộc lập mũ CAP.  VPg là một protein Avr cho potyvirus. Nhiều gen kháng của thực vật ñối với potyvirus ñã ñực chứng minh là các gen lặn, ví dụ như pvr1 (ớt), mo1 (rau diếp), sbm1 (ñậu) và rym4/5 (lúa miến). Các gen này thực chất mã hóa yếu tố khởi ñầu dịch mã eIF4E. Khi các gen này (ở trạng thái ñồng hợp tử), mang các ñột biến phá vỡ tươnng tác VPg - eIF4E ñã dẫn tới kiểu hình kháng. NIa-Pro NIa-Pro là phần ñầu C của protein NIa. Nó là một protease chính của virus. ðầu C của NIa-Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP ñể giải phóng ra các protein chức năng ñơn lẻ. Nib NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp). ðây là một chức năng quan trọng cho phép bộ gen virus ñược tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và ngược lại. CP  CP của potyvirus ñã ñược nghiên cứu rất kỹ. Protein CP có thể ñược chia làm 3 phần (ñầu N, trung tâm và ñầu C). ðầu N là phần nhô lên bề mặt phân tử, khá biến ñộng về trình tự và chứa các epitope ñặc hiệu cho virus ở mức loài và mức chủng. Phần trung tâm và ñầu C bảo thủ hơn và mức biến ñộng của 2 phần này tương ñương mức biến ñộng chung trên toàn bộ bộ gen. Chính vì vậy, CP, ñặc biệt phần ñầu C và trung tâm hay ñược sử dụng trong ñánh giá ña dạng virus.  CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector. ðầu N của CP Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 9 chứa 1 motif bảo thủ cao (DAG). Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên kết với HC-Pro theo lý thuyết bắc cầu ñể lan truyền qua vector rệp muội.  CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào. CP cùng với HC-Pro là 2 protein vận chuyển (MP) của potyvirus. Cả 2 protein này ñều làm tăng kích thước giới hạn (SEL) của lỗ liên bào và do ñó cho phép virus di chuyển giữa các tế bào.  CP là một protein cấu trúc tạo virion.  CP ñiều khiển quá trình tái bản RNA virus. 2.2.4. Lan truyền  Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững.  Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây; OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - ñậu ñỗ), qua phấn hoa (BCMV - ñậu ñỗ).  Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học. 2.3. Các phương pháp cơ bản dùng trong xác ñịnh virus 2.3.1. Chiết tách acid nucleic tổng số Hiện nay có rất nhiều quy trình chiết tách acid nucleic tổng số khác nhau nhưng nói chung ñều gồm các bước cơ bản sau: Bước 1: phá vỡ màng tế bào cũng như màng nhân nhằm giải phóng acid nucleic. Bước 2: ức chế hoạt ñộng của các enzym thủy phân acid nucleic bằng EDTA. EDTA sẽ liên kết với các ion hóa trị 2 như: Mg2+, Cu2+, Mo2+, …là những ion cần thiết cho sự hoạt ñộng của enzym. Bước 3: kết tủa protein, lipid và các tạp chất bằng hóa chất hoặc ly tâm. Bước 4: kết tủa acid nucleic tổng số. Bước 5: rửa tủa bằng cồn tuyệt ñối hoặc cồn 75%, ñể khô và hòa tan Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 10 tủa bằng nước cất vô trùng, bảo quản trong tủ -20°C. 2.3.2. Tinh chiết phân tử virus Nguyên lý cơ bản của tinh chiết phân tử virus là ly tâm ở các tốc ñộ khác nhau. Các loài virus khác nhau có quy trình tinh chiết khác nhau. 2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR ñược Kary Mullis và cs phát minh vào năm 1985, là một phương pháp phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch ñại một ñoạn DNA bên ngoài cơ thể sống trong thời gian ngắn. Thành phần phản ứng PCR gồm có: 1. DNA mẫu (template): ñoạn DNA cần khuếch ñại. 2. Cặp mồi (primer): nhân tố khuếch ñại, xác ñịnh ñiểm bắt ñầu và kết thúc vùng cần khuếch ñại. 3. DNA-polymerase chịu nhiệt: tổng hợp DNA. 4. Nucleotides - dNTPs (A, T, G, C): là nguyên liệu ñể tổng hợp DNA mới. 5. Dung dịch ñệm, MgCl2: môi trường cho DNA-polymerase hoạt ñộng. Phản ứng PCR ñược thực hiện theo một chu trình nhiệt ñịnh sẵn tròng máy PCR. Quy trình phản ứng PCR khoảng từ 20 - 30 chu kỳ nhiệt. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: 1. Giai ñoạn biến tính (denaturation): nhiệt ñộ tăng lên 94 - 96°C ñể tách hai sợi DNA ra. Thời gian: 1-2 phút. 2. Giai ñoạn gắn mồi (annealing): nhiệt ñộ giảm xuống 45 – 60°C ñể mồi có thể gắn vào sợi DNA ñơn. Thời gian: 30 - 60s. 3. Giai ñoạn tổng hợp (elongation): nhiệt ñộ tăng lên 70 - 72°C thích Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 11