Tài liệu Nghiên cứu bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................ vii ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về công nghệ nano................................................................................ 3 1.1.1. Khái niệm công nghệ nano ................................................................................3 1.1.2. Đặc tính của hệ tiểu phân nano .........................................................................3 1.1.3. Kỹ thuật bào chế hệ nano ..................................................................................4 1.1.3.1. Kỹ thuật phân chia (top-down) ......................................................................5 1.1.3.2. Kỹ thuật kết tụ tiểu phân (bottom – up) .........................................................6 1.2. Đặc điểm hấp thu qua da của hệ nano ..................................................................8 1.2.1. Đặc điểm sinh lý của da ....................................................................................8 1.2.2. Đặc điểm hấp thu của hệ nano ..........................................................................8 1.3. Ưu điểm của hệ tiểu phân nano ............................................................................9 1.3.1. Tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng .....................................................................9 1.3.2. Tăng độ ổn định dược chất ..............................................................................10 1.3.3. Tăng tính an toàn .............................................................................................10 1.4. Nhược điểm của hệ tiểu phân nano ....................................................................10 1.5. Tổng quan về bạc và tiểu phân nano bạc ....................................................................... 11 1.5.1. Giới thiệu chung về bạc................................................................................................ 11 1.5.2. Tác dụng của tiểu phân nano chứa bạc ...........................................................14 1.5.3. Hệ giải phóng ion bạc kéo dài – tiểu phân nano bạc clorid ............................17 1.5.4. Một số sản phẩm ứng dụng tiểu phân nano chứa bạc trong y dược và mỹ phẩm ..........................................................................................................................18 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................19 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị................................................................................................... 19 ii 2.1.1. Nguyên vật liệu ...............................................................................................19 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................20 2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................. Error! Bookmark not defined.0 2.3.1. .Điều chế tiểu phân nano bạc clorid ..............................................................200 2.3.1.1. Phương pháp điều chế hệ tiểu phân nano bạc clorid ....................................20 2.3.1.2. Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân nano bạc clorid......................................................................................................................211 2.3.1.3. Phương pháp xác định thế zeta của tiểu phân nano bạc clorid ..................221 2.3.1.4. Phương pháp đánh giá hình dạng của tiểu phân nano bạc clorid.............22 2.3.2. Phương pháp bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid ..............................22 2.3.2.1. Lựa chọn tá dược ..........................................................................................22 2.3.2.2. Quy trình bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid .................................23 2.2.2.3. Phương pháp đánh giá gel chứa tiểu phân nano bạc clorid........................233 2.3.2.4. Đánh giá khả năng giải phóng ion Ag+ từ gel chứa tiểu phân nano bạc clorid .25 2.4. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel chứa tiểu phân nano bạc clorid. .... 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................28 3.1. Điều chế, xác định kích thước, phân bố kích thước, thế Zeta và hình dạng tiểu phân nano bạc clorid ......................................................................................................................... 28 3.2. Bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid .................................................................. 30 3.2.1. Lựa chọn tá dược tạo gel .................................................................................30 3.2.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tạo gel đến thể chất gel ...........................30 3.2.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tạo gel đến kích thước tiểu phân nano AgCl ..........................................................................................................................31 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược giữ ẩm đến kích thước tiểu phân nano bạc clorid trong gel....................................................................................................33 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược bảo quản đến kích thước tiểu phân nano bạc clorid trong gel....................................................................................................34 3.2.4. Đánh giá một số đặc tính lý-hóa của gel chứa tiểu phân nano bạc clorid ......36 3.2.5. Hàm lượng dược chất trong gel nano AgCl ....................................................37 3.3. Đánh giá khả năng giải phóng ion Ag+ từ gel chứa tiểu phân nano bạc clorid .......... 38 iii 3.4. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel chứa tiểu phân nano bạc clorid...... 39 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................411 4.1. Điều chế tiểu phân nano bạc clorid .............................................................................. 411 4.2. Bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid ................................................................ 411 4.3. Đánh giá một số đặc tính của gel chứa tiểu phân nano bạc clorid ...................422 4.4. Đánh giá khả năng giải phóng ion Ag+ từ gel chứa tiểu phân nano bạc clorid ........ 433 4.5. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel chứa tiểu phân nano bạc clorid.... 433 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Số nguyên tử có trong hạt nano bạc ........................................................ 13 Bảng 2.1. Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu ....................................................19 Bảng 3.1. Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và thế zeta của hỗn dịch nano bạc clorid .................................................................................................28 Bảng 3.2. Độ nhớt và thể chất của gel bào chế với một số tá dược ở các nồng độ khác nhau ..................................................................................................................30 Bảng 3.3. Tỷ lệ poloxamer 188 (P188) và polxamer 407 (P407) trong các mẫu gel khảo sát .....................................................................................................................31 Bảng 3.4. Đường kính trung bình và phân bố kích thước của tiểu phân AgCl trong gel bào chế với các tá dược tạo gel khác nhau .........................................................32 Bảng 3.5. Đường kính trung bình và phân bố kích thước của tiểu phân AgCl trong gel bào chế với các nồng độ glycerin khác nhau .....................................................33 Bảng 3.6. Đường kính trung bình và phân bố kích thước của tiểu phân AgCl trong gel bào chế với các nồng độ nipagin khác nhau .......................................................34 Bảng 3.7. Công thức bào chế 100 (g) gel nano bạc clorid 0,13% (kl/kl) ................35 Bảng 3.8. Đường kính trung bình, phân bố kích thước và thế Zeta của gel nano bạc clorid 0,13% so với silvasorb gel (kl/kl) theo thời gian ...........................................36 Bảng 3.9. Độ hấp thụ nguyên tử của các dung dịch bạc chuẩn ............................... 37 Bảng 3.10. Kết quả định lượng hoạt chất trong gel nano bạc clorid........................ 38 Bảng 3.11. Lượng ion bạc giải phóng từ gel nano bạc clorid so với Silvasorb gel theo thời gian ............................................................................................................ 38 của gel nano bạc clorid trên S. aureus Bảng 3.12. Đường kính vòng vô khuẩn và E. coli so với dạng thuốc mỡ thân nước và Silvasorb® Gel® .............................40 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ bào chế tiểu phân nano ....................................................................4 Hình 1.2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn ...........................................................14 Hình 1.3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn ...................... 15 Hình 1.4: Ion bạc liên kết với các base của DNA ....................................................15 Hình 1.5. Thuốc kháng khuẩn dùng cho vết bỏng chứa tiểu phân nano bạc clorid..17 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano bạc clorid ................................... 21 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid………....…23 Hình 3.1: Kích thước và phân bố kích thước của hỗn dịch nano bạc clorid ..........288 Hình 3.2. Thế Zeta của hỗn dịch tiểu phân nano bạc clorid ..................................299 Hình 3.3. Tiểu phân nano bạc clorid chụp bằng kính hiển vi điện tử quét ..............29 Hình 3.4. Sơ đồ qui trình bào chế gel nano bạc clorid hàm lượng 0,13% ............... 35 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa cường độ hập thụ và nồng độ của bạc ..... 37 Hình 3.6: Lượng ion bạc giải phóng từ gel nano bạc clorid so với Silvasorb gel theo thời gian (giờ) ...........................................................................................................39 Hình 3.7. Tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel nano bạc clorid trên S. aureus (bên trái) và E. coli (bên phải) so với dạng thuốc mỡ thân nước và Silvasorb® Gel .......40 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AAS Atomic Absorbtion Spectrometric (phổ hấp thu nguyên tử) ADN Acide désoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique ARS Atomic resonance spectography (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) DĐVN Dược điển Việt Nam DSC Differentiel scanning calometry (Phân tích nhiệt vi sai) KTTP Kích thước tiểu phân PDI Poly dispersity index (Chỉ số đa phân tán) PBKT Phân bố kích thước PVA Polyvinyl alcohol SEM Scanning electron microscope (Kính hiển vi điện tử quét) TEM Transmission electronic microscope (Kính hiển vi điện tử truyền qua) TB Trung bình USP The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ). X X-ray diffraction (nhiễu xạ tia X) vii ĐẶT VẤN ĐỀ Đã từ lâu, bạc được biết đến như một nguyên tố có khả năng khử trùng mạnh nhất tồn tại trong tự nhiên. Cách đây khoảng 200 năm các nhà khoa học xem huyết thanh người là một dịch keo, vì vậy keo bạc đã được sử dụng rộng rãi làm chất kháng khuẩn để chữa các bệnh nấm da, điều trị các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng, làm thuốc nhỏ mắt,… Bước sang thế kỷ 20, sự ra đời và phát triển của các thuốc kháng sinh, kháng khuẩn đã đẩy dần các thuốc có nguồn gốc từ bạc vào lãng quên. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển vượt bậc của công nghệ Nano, việc sử dụng bạc và các hợp chất của bạc dưới dạng hạt có kích thước nano trong ngành y tế đang được quan tâm trở lại và mở ra khả năng thay thế các thuốc kháng sinh thông thường đang có nguy cơ bị đề kháng cao. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng ở kích thước nano, bạc tăng hoạt tính sát khuẩn lên gấp nhiều lần. Chúng có khả năng tiêu diệt nhiều loài nấm, vi khuẩn và virus kể cả các chủng kháng kháng sinh chỉ trong vòng vài phút tiếp xúc, khả năng đề kháng của vi sinh vật đối với bạc và các hợp chất của nó là rất thấp. Tuy nhiên tiểu phân nano bạc nguyên tố có nhược điểm là khả năng giải phóng ion bạc thấp, chính vì thế chưa có một thuốc kháng khuẩn thực sự nào được phát triển từ tiểu phân nano bạc nguyên tố. Trong lịch sử, bạc được sử dụng làm thuốc dưới nhiều dạng khác nhau như: bạc nitrat, bạc protacgon, bạc sulfadiazine,… Mỗi loại đều có ưu nhược điểm riêng. Dung dịch bạc nitrat cho nồng độ ion bạc cao nhưng thường cao quá gây độc và tác dụng ngắn; bạc protacgon có màu không được ưa chuộng, độ ổn định thấp; bạc sulfadiazin sử dụng dưới dạng kem khó vệ sinh vết thương, thời gian tác dụng ngắn. Gần đây nhờ ứng dụng công nghệ nano, các nhà khoa học dược đã phát triển thành công thuốc sử dụng tiểu phân nano của muối ít tan của bạc cho mục đích chống nhiễm khuẩn. Các thuốc này có ưu điểm là kiểm soát được tốc độ giải phóng ion bạc ở mức tối ưu, trong thời gian dài, thuốc dạng gel dễ sử dụng và dễ vệ sinh. Các nghiên cứu theo hướng này chưa được triển khai trong nước. 1 Nhằm phát triển thuốc chống nhiễm khuẩn ngoài da có tác dụng tối ưu và kéo dài, khoa Y Dược – ĐHQGHN đã điều chế và xác định các đặc tính của tiểu phân nano bạc clorid. Các thử nghiệm sinh học in vitro đã chứng tỏ các tiểu phân này có tác dụng tốt hơn bạc sulfadiazin trên các vi khuẩn Gram dương và Gram âm thử nghiệm [3]. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bào chế gel chứa tiểu phân nano bạc clorid” nhằm các mục tiêu sau: 1. Bào chế được gel chứa tiểu phân nano bạc clorid hàm lượng 0,13% và xác định một số đặc tính của hệ. 2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel bào chế được trên một số chủng vi sinh vật. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về công nghệ nano 1.1.1. Khái niệm công nghệ nano Công nghệ nano là khoa học sáng tạo ra các nguyên liệu, thiết bị và hệ thống hữu ích nhờ thao tác, sắp sếp ở mức nguyên tử, phân tử và cầu trúc siêu phân tử giới hạn kích thước 1-100 nm, đồng thời khai thác các đặc tính và hiện tượng mới xuất hiện khi vật chất ở kích thước nano [1], [2], [3], [9], [28] . Công nghệ nano có ba thuộc tính quan trọng là thao tác thực hiện ở mức nano, kích thước vật liệu ở mức nano và kết quả của công nghệ nano là tạo ra vật liệu, thiết bị và hệ thống hưu ích mới [5] . 1.1.2. Đặc tính của hệ tiểu phân nano - Kích thước tiểu phân nano: Kích thước và phân bố kích thước tiểu phân là một trong những đặc điểm quan trọng nhất của hệ tiểu phân nano. Yếu tố này ảnh hưởng đến khả năng giải phóng thuốc từ hệ nano và độ ổn định của tiểu phân nano. Đồng thời, đặc điểm này ảnh hưởng tới quá trình sinh học của thuốc trong cơ thể và khả năng đưa thuốc tới đích. Trong một số nghiên cứu trên thế giới tiểu phân nano có thể được chế tạo dưới 1000 nm đến vài chục nano mét [28], [20]. - Bề mặt tiểu phân và sự kết tụ tiểu phân nano: Tiểu phân có kích thước càng nhỏ diện tích bề mặt tiểu phân càng lớn, số phân tử ở bề mặt tiểu phân càng nhiều do đó tốc độ hòa tan càng lớn. Khi tiểu phân ở kích thước nano diện tích tiếp xúc bề mặt càng tăng lên, lực hút Van der Waals càng lớn nên khả năng kết tụ rất cao [20], [28]. [23]. Tiểu phân nano khi vào hệ tuần hoàn dễ bị hệ thống miễn dịch nhận biết và loại ra khỏi hệ tuần hoàn bời các bạch cầu. Chính bề mặt sơ nước của tiểu phân là yếu tố quyết định cho sự hấp phụ của các thành phần máu, chủ yếu là protein gây ra hiện tượng opsonin hóa. Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính dược chất, kéo dài thời gian lưu thuốc trong hệ tuần hoàn và đưa thuốc tới đích, bề mặt tiểu phân nano được cải thiện để hạn chế tối đa hiện tượng opsonin hóa. Điều này có thể đạt được bằng việc bao màng thân nước quanh tiểu phân nano bằng polymer thân nước có khả năng phân hủy sinh học như: poly ethylen glycol, poly hexadecyl cyanoacrylat hoặc poly ethylen glycol/poly lactic acid ... [20]. 3 Điện tích bề mặt tiểu phân cũng là một đặc tính quan trọng tạo nên tính chất đặc biệt của hệ tiểu phân nano. Điện tích bề mặt này ảnh hưởng đến tương tác tĩnh điện các tiểu phân với nhau và với những thành phần trong dịch sinh học hoặc bề mặt màng sinh học. - Từ tính và tính chất qung học của tiểu phân nano: Đa số tiểu phân nano thể hiện tính chất từ và quang rất đặc biệt. Thí dụ, vật liệu sắt từ trở nên siêu thuận từ khi kích thước nhỏ hơn 20 nm, tức là chúng không giữ được từ tính vì thiếu vùng từ. Tuy nhiên, chúng chịu tác dụng trong từ trường. Nhưng vật liệu như vậy rất hữu ích cho thuốc giải phóng tại đích [12]. Tiểu phân kim loại (điển hình là vàng và bạc) có tính chất quang học phụ thuộc vào kích thước tiểu phân. Màu sắc tiểu phân thay đổi theo kích thước là do sự cộng hưởng bề mặt. Nhưng nguyên liệu này thích hợp cho chế tạo bộ phận cảm biến trong các thiết bị chuẩn đoán hình ảnh [12], [28]. 1.1.3. Kỹ thuật bào chế hệ nano Có hai chiều hướng ngược nhau để bào chế tiểu phân nano dược chất: đi từ tiểu phân lớn (bột siêu mịn – micronized powder) nghiền thành tiểu phân nano (top-down) và đi từ phân tử nhỏ kết tủa thành tiểu phân nano lớn hơn (bottom-up) [6]. Tiểu phân micro Tiê Nghiền Tiểu phân nano Kết tủa Phân tử Hình 1.1. Sơ đồ bào chế tiểu phân nano - Kỹ thuật phân chia (top-down): dùng kỹ thuật nghiền và biến dạng để biến vật liệu thể khối với tiểu phân thô thành tiểu phân kích thước nano. Kỹ thuật này gồm hai nhóm chủ yếu là nghiền bi và đồng nhất hóa dưới áp suất cao [26], [28] 4 - Kỹ thuật kết tụ tiểu phân (bottom-up): hình thành vật liệu nano từ nguyên tử hoặc ion. Kỹ thuật kết tụ tiểu phân bao gồm phương pháp vật lý, hóa học hoặc kết hợp cả hai phương pháp hóa lý. Kỹ thuật này chủ yếu dựa trên quá trình kết tủa dược chất từ dung dịch [12], [26]. 1.1.3.1. Kỹ thuật phân chia (top-down) a. Phương pháp nghiền Để nghiền dược chất tới kích cỡ nano (nanosizing), người ta dùng phương pháp nghiền bi (ball-milling, pearl-milling), có thể nghiền khô hoặc nghiền ướt tùy theo bản chất dược chất và mục đích bào chế. - Phương pháp nghiền khô: Áp dụng cho các dược chất có cấu tạo bền chắc, chịu được nhiệt độ cao như tiểu phân kim loại, cần thu dược chất dưới dạng bột khô. Dược chất đem nghiền thường là bột siêu mịn. Thiết bị nghiền là các máy nghiền bi chuyên dụng năng lượng cao (high-energy ball milling) chế từ các vật liệu bền chắc đặc biệt như thép không rỉ mạ bề mặt, zircon oxyd,... [6] - Phương pháp nghiền ướt: là phương pháp nghiền trong môi trường lỏng, thực chất đây là phương pháp bào chế hỗn dịch nano. Hiện nay phương pháp nghiền ướt hay được dùng hơn nghiền khô để tránh tác động của nhiệt và rút ngắn thời gian nghiền, đồng thời trực tiếp tạo ra dạng bào chế. Sau khi nghiền 30 đến 60 phút có thể thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân trung bình dưới 200 nm [6]. Dược chất trong môi trường nước có chứa chất diện hoạt, chất ổn định được đưa vào thiết bị nghiền bi có chứa vật liệu nghiền (bi thép, thủy tinh, zircon oxyd hoặc polyme cứng đặc biệt). Tốc độ quay của thiết bị rất lớn trong thời gian dài tạo ra lực chia cắt phá vỡ tiểu phân từ kích thước micro xuống kích thước nano [28], [37]. b. Đồng nhất hóa dưới áp suất cao Thực chất, đây cũng là phương pháp nghiền trong môi trường lỏng, kết hợp nghiền và đồng nhất hóa tiểu phân. Tiểu phân được phân chia bằng cách nén qua một khe hẹp dưới áp lực cao trong các thiết bị đồng nhất hóa (homogenizer) để thu được kích thước nhỏ và đồng nhất hơn [6]. Áp suất sử dụng khoảng từ 1000 đến 1500 bar 5 (100 – 150 Mpa, 14504 – 21756 psi). Tùy thuộc vào đặc tính của thuốc, số lần đồng nhất có thể từ 10 đến 20 lần. Phương pháp đồng nhất hóa bằng áp suất cao dựa trên kỹ thuật piston hở hoặc vòi phun tạo dòng [28], [37]. Lực phân chia tiểu phân chủ yếu là lực khoan: hỗn dịch được nén qua khe hẹp áp lực cao tạo ra lực trượt lớn làm giảm áp suất tĩnh của nước, nước bốc hơi từ trong lòng tiểu phân tạo bọt khí, khi ra khỏi khe hẹp bọt khí vỡ chia nhỏ tiểu phân. Ngoài ra còn có lực nén ép, lực va đập [6]. 1.1.3.2. Kỹ thuật kết tụ tiểu phân (bottom – up) Dược chất và polyme được hòa tan trong dung môi thành dung dịch. Các tiểu phân nano được kết tủa bằng cách loại nhanh dung môi hoặc bằng cách thay đổi dung môi trong điều kiện khuấy trộn tốc độ cao [7], [14], [20], [21]. Phương pháp này đòi hỏi nghiêm ngặt kiềm soát các yếu tố của quá trình, đồng thời phải tránh được sự lớn lên của tinh thể trong quá trình kết tinh. Hơn nữa, vấn đề loại dung môi sau quá trình cũng cần phải chú ý nếu sử dụng dung môi có khả năng gây độc. Về mặt lý thuyết, các phân tử trong hạt nano thường kết tinh ở dạng vô định hình nên nguy cơ tái kết tinh làm tăng kích thước tiểu phân rất dễ xảy ra. Đó là một trong những đặc điểm lớn cần giải quyết khi nghiên cứu phát triển hệ nano bằng phương pháp kết tủa [14], [39].  Kỹ thuật kết tủa bao gồm các phương pháp sau:  Phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi  Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi  Phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn và chất lỏng nên: Phương pháp này sử dụng dung môi siêu tới hạn để tạo ra tiểu phân nano. Có rất nhiều dung môi siêu tới hạn được sử dụng như: ethylen, trifluoromethan, carbon dioxid, dinitrogen monoxid, toluen, isopropanol, nước. Trong đó, carbon dioxid được ứng dụng nhiều nhất [14][28]  Phương pháp tự nhũ hóa hay khuếch tán dung môi: sử dụng dung môi hữu cơ tan một phần trong nước. Polyme được hòa tan trong dung môi hữu cơ như propylen carbonat, dung môi này được bão hòa nước để đảm bảo trạng thái cân 6 bằng nhiệt động học nguyên liệu giữa hai chất lỏng. Dung môi hữu cơ sẽ khuếch tán ra pha ngoại và tạo ra siêu vi cầu hoặc siêu vi nang phụ thuộc vào tỷ lệ polyme và thuốc [14]  Phương pháp polyme hóa: monomer được polymer hóa nhờ các tác nhân vật lý (tia gama, tia UV ...) hoặc hóa học (xúc tác, điều chỉnh pH môi trường) để tạo ra tiểu phân nano trong dung dịch nước. Có hai kiểu chính: polyme hóa nhũ tương và polyme hóa bề mặt. Dược chất được kết hợp bằng cách hòa tan trong dung môi polyme hóa hoặc hấp phụ trên các tiểu phân nano sau quá trình polyme hóa kết thúc [14], [20].  Phương pháp keo tụ hay gel ion hóa: sử dụng những polyme tự nhiên như chitosan, gelatin, natri alginat, agarose để làm chất mang. Những hợp chất cao phân tử tự nhiên này được hòa tan trong dung môi thích hợp, được nhũ hóa và gây keo tụ tiểu phân dưới tác động của nhiệt độ, tác nhân hóa học, tương tác tĩnh điện hay tạo phức [14]  Phương pháp hóa muối  Phương pháp phun sấy Trong các phương pháp kể trên, ngành công nghiệp dược phẩm thường áp dụng một số phương pháp sau:  Phương pháp nhũ hóa và bay hơi dung môi: Phương pháp này gồm hai bước: Bước một là tạo nhũ tương dầu trong nước. Polyme và dược chất hòa tan trong pha dầu được phân tán trong nước sử dụng chất diện hoạt và đồng nhất hóa năng lượng cao. Bước hai là loại dung môi dầu bằng bay hơi ở nhiệt độ cao và áp suất giảm hoặc tiếp tục khuấy, đồng thời các siêu vi cầu được tạo ra. Các phân tử dược chất phân tán trong mạng lưới polyme. Kích thước của tiểu phân có thể kiểm soát bằng tốc độ khuấy, loại và tỷ lệ chât gây phân tán, độ nhớt của pha dầu và pha nước, nhiệt độ. Nhiều kiểu nhũ tương được áp dụng nhưng nhũ tương dầu trong nước hay được dùng. Các dược chất hay được áp dụng là albumin, testosteron, loperamid, ciprofloxacin, prazinquantel, cyclosporin A, Acid nucleic, nimodipin, piroxicam và indomethacin. Các polyme hay được dùng là 7 ethylcellulose (EC), cellulose acetat phthalat, poly ε-caprolacton (PCL), poly methacrylat và poly hydroxybutyrat (PHB) [14]  Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi: Phương pháp này cũng gồm hai bước. Bước một là hòa tan dược chất vào dung môi thích hợp. Bước hai là phối hợp từ từ dung dịch dược chất vào môi trường nước đồng thời khuấy trộn với tốc độ thích hợp để thu được hỗn dịch nano. Phương pháp này thường được sử dụng để bào chế dược chất dạng nano, trong một số trường hợp đặc biệt có thể tạo ra vi cầu hoặc vi nang khi đưa thêm chất mang vào dung dịch dược chất hoặc môi trường nước. 1.2. Đặc điểm hấp thu qua da của hệ nano 1.2.1. Đặc điểm sinh lý của da Da người là cơ quan có bề mặt tiếp xúc lớn (bình thường có diện tích khoảng 2 m2) và lưu lượng tuần hoàn khá dồi dào, khoảng 1/3 lượng máu tuần hoàn của cơ thể qua da [1]. Xét theo chiều ngang, da người gồm các lớp chính [30], [36]:  Lớp “film mỡ”: bám trên bề mặt da, ít hay nhiều tùy loại da: có thể tương tác bất lợi hoặc ngăn cản dược chất đi qua.  Lớp vảy sừng: gồm các lớp tế bào mỏng dẹt đã keratin hóa, đan khít với nhau tạo ra một màng hữu cơ sơ nước.  Lớp biểu bì: dày khoảng 20 µm, đóng vai trò chủ chốt trong sự hấp thu thuốc.  Lớp trung bì và hạ bì: có đặc tính thân nước Các tổ chức phụ của da bao gồm nang lông, tuyến mồ hôi, tuyến bã nhờn tạo ra các kênh tự nhiên thông ra bề mặt da. Dược chất được thấm qua da chủ yếu theo các con đường sau: vòng qua khe giữa các tế bào của các lớp của da, xuyên trực tiếp qua tế bào, qua các tổ chức phụ của da). Cơ chế vận chuyển chủ yếu của dược chất qua da là khuếch tán thụ động. 1.2.2. Đặc điểm hấp thu của hệ nano Trước đây, hệ nano có cấu trúc tiểu phân hoặc giọt kích thước dưới 500 nm được ứng dụng chủ yếu trong dạng thuốc uống và thuốc tiêm. Hiện nay, hệ nano đang được được ứng dụng ngày càng nhiều trong dạng thuốc dùng trên da và niêm mạc nhờ có rất 8 nhiều lợi điểm về giải phóng và hấp thu thuốc. Đối với việc sử dụng hệ nano trên da, dược chất có thể cho tác dụng tại chỗ hoặc hấp thu qua da để gây tác dụng ở những vùng sâu hơn hoặc tác dụng toàn thân. Lớp sừng là một trong những hàng rào bảo vệ hữu hiệu của cơ thể con người, vì thế đây là rào cản chính cản trở hấp thu thuốc qua da. Để đưa dược chất vượt qua hàng rào bảo vệ này, những hệ nano bao gồm nano nhũ tương, liposome, tiểu phân nano và nano lipid rắn đang được nghiên cứu và phát triển. Ví dụ, hệ nano dùng để kéo dài thời gian lưu giữ của của kem chống nắng trong lớp sừng và giúp vitamin A nằm lâu ở lớp trên của da. Hay hệ nano octyl methoxycinnamat với poly (ε-caprolacton) làm tăng cường đáng kể tốc độ và mức độ thấm dược chất trên da lợn. Các hệ thống này có thể tăng cường khả năng hấp thu thuốc qua da, nhưng cơ chế chưa được chứng minh rõ ràng [31]. R. Alvarez – Roman và cộng sự (2004) nghiên cứu tính thấm của tiểu phân nano polystyren (đường kính tiểu phân 20 và 200 nm) qua da lợn bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu điểm cho thấy tiểu phân nano polystyren tích lũy ưu tiên trong lỗ chân lông, sự tích lũy này tăng theo thời gian, tiểu phân kích thước nhỏ hơn lưu giữ tại lỗ chân lông nhiều hơn. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tiểu phân nano còn được lưu giữ trong nếp gấp của da. Tuy nhiên, hình ảnh cắt ngang cho thấy ngoài thấm qua nang lông, hệ tiểu phân nano không thấm qua da bằng đường khác, do bị lớp sừng cản trở [31], [32]. 1.3. Ưu điểm của hệ tiểu phân nano 1.3.1. Tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng Tiểu phân nano do có kích thước nhỏ, năng lượng tự do bề mặt lớn và diện tích tiếp xúc lớn nên khả năng và tốc độ hòa tan tăng, nhờ đó làm tăng sinh khả dụng của thuốc. Điều này giúp làm giảm liều điều trị của nhiều thuốc như thuốc chống ung thư, chống nấm, NSAIDs ... [19], [24]. Các tiểu phân nano (đặc biệt là tiểu phân nano có dược chất gắn với chất mang) dễ dàng đi qua được tế bào, xâm nhập vào máu, hệ thống nội bào, gan, tủy xương, màng ruột, lớp niêm mạc,... Điều này có ý nghĩa đặc biệt đối với các dược chất có đặc tính sinh dược học kém như tính thấm qua biểu mô tế bào kém, tan kém trong nước như Flubiprofen [16]. 9 Hệ nano đã được chứng minh là có khả năng làm tăng hấp thu thuốc qua mao mạch ở não. Những hệ này được bào chế từ nhiều loại chất mang khác nhau như poly (alkylcyanoacrylat), polyacetat, polysaccharid, polysorbat [20]. Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng hệ nano làm tăng vận chuyển các thuốc như insulin, protein, vaccin,... qua khoang mũi. Hệ nano vận chuyển thuốc qua mũi bao gồm: hệ vận chuyển mang lipid (liposome và hệ nano kết hợp lipid khác) và hệ vận chuyển với chất mang polyme (polyester, polysaccharid) [12]. 1.3.2. Tăng độ ổn định dược chất Khi có chất mang bao ngoài, những dược chất bị phân hủy bởi dịch dạ dày, tạo phức chelat với cation kim loại như insulin, glutathiol, cloricromen,... sẽ được bảo vệ và tăng ổn định. Các polyme thường dùng là chitosan, poly methyl methacrylat, alginat...[24]. Ví dụ: Kumar và cộng sự nghiên cứu hệ nano poly (D,L-lactid-coglycolid) chứa insulin đã chứng minh rằng hệ nano kéo dài tác dụng hạ đường huyết của insulin tới 72 giờ [29]. Hệ nano giúp ổn định cấu trúc hỗn dịch. Khi KTTP nhỏ, hỗn dịch được tạo ra dễ dàng hơn, cấu trúc hóa lý của hỗn dịch ổn định hơn. Ưu điểm này làm tăng khả năng ứng dụng dược chất kém tan vào chế phẩm hỗn dịch, đặc biệt là thuốc tiêm tĩnh mạch và nhãn khoa. Hỗn dịch tương đối bền vững khi giá trị tuyệt đối của thế zeta từ 30-60 mV, rất bền khi giá trị tuyệt đối của thế zeta từ 60-90 mV [24]. 1.3.3. Tăng tính an toàn Khi độ tan và tốc độ hòa tan của dược chất tăng sẽ làm giảm liều dùng, giúp tiết kiệm dược chất, giảm tác dụng phụ và tăng độ ổn định của chế phẩm [20]. Hơn nữa, đối với các thuốc điều trị ung thư, tiểu phân nano giải phóng dược chất tại đích có thể làm giảm độc tính của thuốc và tăng khả năng điều trị [26]. 1.4. Nhược điểm của hệ tiểu phân nano - Chế tạo khó khăn Vật liệu cứng như kim cương, oxyd sắt, oxyd silic với nhiệt độ nóng chảy trên 1.000oC thì dễ tạo ra tiểu phân kích thước từ 1 đến 100 nm. Trái lại, các vật liệu mềm chủ yếu là nguyên liệu làm thuốc có nhiệt độ nóng chảy dưới 300oc khó tạo ra tiểu phân dưới 100 nm [12], [28]. 10  Khó khăn trong bảo quản Trong quá trình bảo quản, các tiểu phân của hệ nano dễ bị đông tụ và kết dính với nhau tạo nên tiểu phân lớn hơn để giảm năng lượng tự do bề mặt, nhất là hệ nano gồm các tiểu phân có kích thước 10-1000 nm [27].  Độc tính trường diễn Trong hầu hết các nghiên cứu, nano tiểu phân bạc được cho là không độc hại với cơ thể người. Tuy nhiên, do có kích thước nhỏ (tương đương với kích thước của virut) nano tiểu phân bạc có thể thâm nhập, di chuyển vào bên trong tế bào và ảnh hưởng đến các sinh vật sống. Asharani PV và Cộng sự (2005) đã nghiên cứu độc tính của nano tiểu phân bạc ở các kích thước khác nhau lên tế bào gan chuột cống. Các tác giả nhận thấy sau 24 giờ tiếp xúc, ti thể của các tế bào có kích thước và hình dạng bất thường. Các nghiên cứu invitro chứng minh rằng nano tiểu phân bạc có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản, phát triển và DNA. Nghiên cứu trên cá ngựa vằn cho thấy nano tiểu phân bạc tinh khiết, kích thước 12 nm có khả năng gây sai lệch nhiễm sắc thể và tổn thương DNA ức chế sự tăng sinh của tế bào và ảnh hưởng đến sự phát triến sớm của phôi [10]. 1.5. Tổng quan về bạc và tiểu phân nano bạc 1.5.1. Giới thiệu chung về bạc Bạc là nguyên tố hóa học trong bảng tuần hoàn nguyên tố có số nguyên tử bằng 47 và được ký hiệu là Ag. Ký hiệu của bạc Ag có nguồn gốc từ chữ Argentum trong tiếng Latinh. Một số đặc điểm của nguyên tố này: - Cấu hình electron: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1 - Bán kính nguyên tử: 0,288 nm - Bán kính ion Ag+: 0,23 nm - Khối lượng nguyên tử: 107,8683 đvC Bạc là nguyên tố có khả năng khử khuẩn mạnh nhất tồn tại trong tự nhiên và đã được sử dụng để phát triển thuốc chống nhiễm khuẩn từ các đây 200 năm. Trong lịch sử, dung dịch keo bạc được sử dụng rộng rãi để chữa các bệnh nấm trên da, điều trị các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng và làm thuốc nhỏ mắt ... thuốc có nguồn cốc từ bạc có phổ kháng khuẩn rộng và rất hiếm khi bị vi khuẩn kháng tác dụng [4]. 11 Các thuốc từ bạc đều có chung một nguyên tắc là thuốc cần phải giải phóng bạc dưới dạng ion để cho tác dụng kháng khuẩn [11]. Nhiều dạng bạc được sử dụng để làm thuốc, điển hình là: Dung dịch keo bạc Đây là dạng được sử dụng phổ biến nhất trước năm 1960, các tiểu phân ion bạc tinh khiết, tích điện, được phân tán trong môi trường keo. Các ion tích điện đẩy nhau, vì thế chúng được phân tán đồng nhất trong môi trường ngay cả khi đã bôi thuốc lên vết thương [4], [5]. Phức hợp bạc protein Phức hợp bạc với các protein phân tử nhỏ làm tăng tính ổn định của ion bạc trong dung dịch. Tuy nhiên khả năng kháng khuẩn kém ion bạc và do có một số nhược điểm nhất định nên vào những năm 1960 chúng nhanh chóng được thay thế bởi các muối tan của bạc. Muối tan của bạc Bạc nitrat 0,5% đã từng là một dung dịch điển hình và phổ biến nhất để trị các bết bỏng ngoài da. Dung dịch muối bạc thể hiện tính kháng khuẩn cao, ít bị vi sinh vật kháng lại và nó còn có khả năng giảm viêm bề mặt vết thương. Tuy nhiên, dung dịch muối bạc không ổn định, dễ chuyển sang màu xám khi tiếp xúc với ánh sáng. Ở nồng độ lớn hơn 1% dung dịch bạc nitrat có khả năng gây độc với tế bào và các mô; nitrate làm giảm khả năng liền vết thương và khi bị khử thành nitrit sẽ tạo ra các chất oxi hóa gây độc tế bào, giảm khả năng tái tạo tế bào biểu mô. Bạc nitrat giải phóng ion bạc ở nồng độ cao nhưng nhanh, nên phải thay miếng băng dán thường xuyên (đến 12 lần/ngày) [4], [5]. Bạc sulfadiazin Bạc sulfadiazine (tên thương mại: Flammazine, Silvadene) được sử dụng nhiều trong những năm 1970. Bạc nitrat và natri sulfadiazin được phối hợp để tạo thành bạc sulfadiazine sử dụng làm thuốc. Phức hợp này tác dụng lên thành tế bào vi khuẩn. Tác dụng kháng khuẩn là tác dụng hiệp đồng của cả ion bạc và của sulfadiazine. Các dạng thuốc phối hợp các sulfamit khác nhau với bạc đã được nghiên cứu thử nhiệm in vitro, kết quả cho thấy bạc sulfadiazine cho tác dụng tốt nhất. Điều này có thể được giải thích là do sự liên kết mạnh của bạc sulfadiazine với DNA của vi sinh vật. Sự đề 12 kháng của vi khuẩn trên dòng sản phẩm này cũng đã được ghi nhận. Sản phẩm có thể làm giảm khả năng tái tạo biểu mô. Độc tính đối với tủy xương của thuốc bạc sulfadiazine chủ yếu là do propylene glycol có trong dạng thuốc gây nên [13] [39]. Bạc sulfadiazine cung cấp đủ lượng bạc cần thiết nhưng tác dụng duy trì yếu, tuy nhiên so với bạc nitrate, bạc sulfadiazine đã có sự cải thiện đáng kể (chỉ phải thay miếng băng dán 2 lần/ngày) [5]. Tiểu phân nano bạc nguyên tố Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn. Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano. Bảng 1.1: Số nguyên tử có trong hạt nano bạc Kích thước hạt nano bạc (nm) Số nguyên tử 1 31 5 3900 20 250000 Nano bạc là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có nhiều đặc tính độc đáo: - Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh. - Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất. - Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene). - Độ ổn định học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ, và các tác nhân oxy hóa khử thông thường. 13 - Chi phí cho quá trình sản xuất thấp. Dạng tiểu phân nano bạc có thể dùng để chế tạo băng dán vết thương, vết bỏng. Tiểu phân nano bạc giải phóng Ag0, dạng này khó bị bất hoạt bởi ion chloride hay chất hữu cơ so với dạng ion. Khi bạc bị tiêu hao do phản ứng với các tế bào đích hoặc bị bất hoạt bởi các protein hay anion trong dịch vết thương, bạc lại được bổ sung liên tục giúp duy trì ổn định hàm lượng bạc [4], [11]. 1.5.2. Tác dụng của tiểu phân nano chứa bạc  Tác dụng diệt khuẩn Bạc là tác nhân kháng khuẩn phổ rộng, có khả năng chống nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, gồm cả chủng vi sinh vật Staphyllococcus aureus kháng sinh methacillin và Entercocci kháng vincomycin. Các thuốc từ bạc đều có chung một nguyên tắc là thuốc cần phải giải phóng bạc dưới dạng ion để cho tác dụng kháng khuẩn [4]. Dạng kim loại bạc tương đối trơ và khó hấp thu bởi tế bào động vật có vú cũng như tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, trong dịch vết thương hoặc các chất bài tiết khác bạc được ion hóa và trở nên có hoạt tính. [11], [13]. Hình 1.2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả 14