Chuyên ngành: Vi sinh
Khóa luận tốt nghiệp
vật
PHẦN MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử
như: ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt
trội với độ dẻo dai, bề chắc.[17]
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá
trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế
bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang,
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm.
Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời
thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo
điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13]
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các
kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A.
xylinum BHN 2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu
cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng ứng dụng cho
trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người.
SV: Nguyễn Duy Khanh
1
Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí
trong quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài:
“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn Acetobacter xylinum BHN 2 ”
2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài
- Nghiên
cứu
khuẩn
ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi
A. xylinum BHN 2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí
nghiệm.
- Khảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuẩn
A. xylinum BHN 2 .
- Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo
màng BC được tốt nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu
khuẩn
ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi
A. xylinum BHN 2 .
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp
nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
- Nghiên cứu
ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp
nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
- Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng
A. xylinum BHN 2 từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng.
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum
thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một
số tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21]
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc
điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi
trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN2
Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc
đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên,
dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
[18]
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum
Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6. Nhiệt
độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.
Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn
ngay cả trong môi trường tối ưu.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung
thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
[12]
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A. xylinum bao gồm: Oxy
hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính;
Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid;
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng
hợp cellulose.[12]
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial
cellulose hay màng BC.
* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch
thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh
tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những
sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon
(Yamanaka et.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm.
Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải
ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành
cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi
cấy.[15]
Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số
kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ
học cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu
đầu tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế
kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu
trúc và đặc tính của cellulose.[22]
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng
BC từ vi khuẩn A.xylinum
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như
tổng hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của
Thạc sỹ
Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng
nguồn cacbon có
Acetobacter xylinum HN5 thì
ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của
Acetobacter xylinum là glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu,
Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l
cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum BHN 2 .[14]
1.2.2.
Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Vi sinh vật và tất cả
các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình
sống để xây dựng tế bào. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có
ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan
trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ
trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ
đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường
cho hiệu suất màng BC cao nhất.[14]
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O
MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị
Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những
enzim này xúc tác cho các phản
ứng chuyển hóa các chất trong quá trình
hình thành màng BC.[14]
1.2.4.
Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn
có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn
Acetobacter xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ
cho sản lượng BC cao nhất.[14]
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A.xylinum
1.3.1.
Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.
Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh
hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn.
Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC,
độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận
màng. Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng
đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường
nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu
năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào.
Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các
tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt
nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich
thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu
cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao
nhất.
Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ
giống và thời gian lên men.[14]
1.3.2.Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên
quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của
quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế
độ thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp
oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng
BC cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt
rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[19]
Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh
hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành
dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện
áp suất oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực
của lớp màng BC.[20]
1.3.3.Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25-300C. Ở nhiệt độ
thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động
và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men
sẽ giảm.[21]
1.3.4.Độ PH
Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp.
Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid
hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn
chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21]
1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh,
độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,
khả
năng giữ nước và hút nước cao, bề
mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ
thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương
thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng
BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như
y học, thực phẩm,
mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, công nghiệp.[22]
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng
ngày. Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội
tạng, để lại di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe
của người bệnh. Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi
năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là
bỏng nước sôi. Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng,
acid, vôi tôi nóng.[6]
Việc điều
trị
tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa
đặc biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác
dụng làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều
kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng
sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các
biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân,
ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử
vong cao),
loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình
thành mô hạt và biểu mô hóa hình thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da
trong phẫu thuật.[6]
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1989,
dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown
(1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ
nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh
học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) đã dùng
BC làm vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki
và cộng sự (2006) dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ
chất để cố định protêin hay cho sắc kí.[5]
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC
là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs
(1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005),
Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng
đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí
bản quyền về làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas
và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm
mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.[5]
1.5.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến.
Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng như
màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử
SV: Nguyễn Duy Khanh
10
dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ
năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã
có một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu
nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng
sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam.[9]
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp
dụng từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong
thiên nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như
chữa các
vết thương, vết loét…
Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất
có nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.[14]
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 : “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý
của màng BC
từ
Acetobacter xylinum, ứng dụng trong
trị
bỏng
”
của
Trần như Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo
màng BC của chủng A.xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường
thích hợp cho chủng A.xylinum BHN2 lên men tĩnh.
+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo
màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ
4,5-5,5.
+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO4:
2 g/l; KH2PO4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l.
- Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng
A.xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất.
- Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của
màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí
120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệu
chứng kích ứng.
- Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày
điều trị.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1.Vật liệu chính
Đối tượng nghiên cứu là các chủng A. xylinum BHN 2 được phòng thí
nghiệm Thực vật - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham
Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2.Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
- Nguồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose,
Fructose, Dihyroxyaceton, Axit acetic.
-
Nguồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH4)2SO4
- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4.
- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả.
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder
(Đức). Nồi hấp Tommy
(Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml.
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…
2.1.3.Môi trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
CaCO3 : 10g
Agar: 20g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Cao nấm men: 3g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 1000ml.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.
Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN 2
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử
dụng phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ
số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa
giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh
trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử
khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135
vòng/phút trong 24 giờ.
2.2.2.
Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN 2
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C
trong 20 phút để
tránh phân dã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím
trong 15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào
môi trường lên men 5% giống đã hoạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong
7-10 ngày.
2.2.3.
Phương pháp bảo quản chủng giống
A.xylinum BHN 2 trên môi
trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy
trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3
– 4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền
giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4]
2.2.4.
Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ
chủng A. xylinum BHN 2
2.2.4.1.
Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng
BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN
2
S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2)
V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3)
Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể
tích dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt
nhất từ chủng A.xylinum BHN 2 , chúng tôi tiến hành theo các bước sau:
- Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đổi thể tích từ
đơn vị ml sang đơn vị cm3. Sau đó tính tỷ lệ S/V.
+ Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15
x 10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là
S= 15 x 10= 150 (cm2).
+ Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì
ta phải quy đổi ml sang cm3. Ta đã biết 1ml=1cm3. Ta có bảng sau:
Bảng 1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu
S (cm2)
V ( ml =cm3)
S/V (cm-1)
150
150
1,0
150
167
0,9
150
187.5
0,8
150
215
0,7
150
250
0,6
150
300
0,5
- Bước 2: Tiến hành lên men
bề
mặt tạo màng BC
từ
chủng
A.xylinum
BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày,
độ dai, cân nặng, trọng lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt
nhất.
2.2.4.2.
.
Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC
Độ chịu kéo(độ dai)(tensile strenght): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử
chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu
chuẩn.[14]
Độ bền kéo(độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động
tăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới
hạn cho sự
đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σk. Độ
bền kéo
được ứng dụng rất nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế
chế tạo máy, xây dựng, khoa học vật liệu.[14]
Để xác định độ dai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là NNiutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách:
+ Cố định đầu trước của màng
+ Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau
+ Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu
N.
2.2.4.3.
Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp
nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V thích
hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các
tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân
nặng, trọng lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ
2.2.4.4.
S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum
BHN 2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-400C đến tỷ lệ S/V thích
hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các
tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân
nặng, trọng lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.5.
Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong
cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và
ứng dụng”
như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp
lại thí nghiệm.
X 1 X
n i 1
n
i
n
* Trung bình bình phương các sai
lệch
( X
2 X )
i1
n 1
m
n
* Sai số đại diện của trung bình cộng
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
C
v
.
i
x100
X
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn
A. xylinum BHN 2 .
Sau một thời gian nghiên cứu lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng
A.xylinum BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ
nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô tuyệt đối để tìm S/V thích
hợp tạo màng BC tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.1
như sau:
Bảng 3.1. Nghiên cứu tỉ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ
vi khuẩn A. xylinum BHN 2 (Ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt và thể
tích lên men)
Tỷ
SV: Nguyễn Duy Khanh
Đặc điểm màng
20
- Xem thêm -