Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại gia lâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ HẢI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, NĂNG SUẤT LÚA TẠI GIA LÂM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ HẢI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINHĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, NĂNG SUẤT LÚA TẠI GIA LÂM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ:60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI, 2015 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong các công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên Phạm Thị Hải Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i Lời cảm ơn Sau một thời gian làm việc và thực tập tại Viện sinh học nông nghiệp, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ tại Viện, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các anh chị đồng nghiệp, bạn bè, cùng toàn thể cán bộ bộ môn bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, ban chủ nhiệm Khoa và các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh họcđã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bố, Mẹ, anh chị em và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Học viên Phạm Thị Hải Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan ............................................................................................................... i Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH................................................................................................ vii TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... ix CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3 1.1. Khát quát về vi khuẩn nội sinh.............................................................................3 1.1.2. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ..............................................................4 1.1.3. Một số vi khuẩn nội sinh .................................................................................13 1.2. Tổng quan về cây lúa .........................................................................................20 1.2.1. Vị trí phân loại ................................................................................................20 1.2.2. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................21 1.2.3. Nhu cầu về dinh dưỡng của cây lúa ................................................................22 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................28 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................28 2.1.1. Đối tượng vật liệu nghiên cứu .........................................................................28 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ............................................................................28 2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................28 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................31 2.2. Nội dụng nghiên cứu ..........................................................................................31 2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lúa. ...........................................31 2.2.2. Đánh giá khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt. ....................31 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.2.3. Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố(thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................31 2.2.4. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. ......................................................................................31 2.2.5. Đánh giá tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất lúa trồng tại Gia Lâm. ..................................................................31 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................32 2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn ................32 2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào. ...........................32 2.3.3. Xác định khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh. ......................................................................................................34 2.3.4. Xác định ảnh hưởng của thời gian và pH đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .......................................39 2.3.5. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao. .........................................39 2.3.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng ....................................................40 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................43 3.1. Phân lập và xác định các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh lúa phân lập được. .......................................................................................43 3.2. Xác định khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn. ........................................................................................................................44 3.2.1. Khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn ..............................................44 3.2.2. Khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn. ............................................47 3.2.3. Khả năng tổng hợp IAA ..................................................................................50 3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năngcố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. ..........................................................53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.3.1.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. ..................................................53 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .................................................................55 3.3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .................................................................58 3.4. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................60 3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ......................................................................................................60 3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................61 3.4.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. ................................................................................................................62 3.5. Ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng cố định đạm phân giải lân, tổng hợp IAA mạnh lên sự sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại Gia Lâm............................................................................................................................64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................71 Kết luận .....................................................................................................................71 Kiến nghị ...................................................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................73 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001) ............................28 Bảng 2.2: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ ..................................................35 Bảng 2.3: Thành phần của dãy đường chuẩn PO43- ..................................................37 Bảng 2.4: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA ....................................................38 Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm ...............................................................................41 Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được. ...43 Bảng 3.2: Đường chuẩn NH4+ (mg/l) ........................................................................45 Bảng 3.3 : Đường chuẩn PO43- ..................................................................................48 Bảng 3.4: Đường chuẩn IAA ....................................................................................50 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón đến chiều cao, số nhánh tối đa, số bôngcủa lúa lai TH 3-3 ...............................................................65 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón tới năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của lúa lai TH3-3 .....................................................66 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn và phân bón đến chiều cao, số nhánh tối đa, số bông của lúa thuầnBắc thơm 7 ..................................................................68 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón tới năng suất và các yếu tố cấu thànhnăng suất của lúa thuần Bắc thơm 7 .........................................69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Tổng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn(Spaepen et al., 2007)............................................................................................................................9 Hình 1.2: Cây lúa ......................................................................................................20 Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn. ............................................44 Hình 3.2: Đồ thị đường chuẩn NH4+ .........................................................................46 Hình 3.3: Đồ thị biểu hiện hàm lượng NH4+tổng hợp của các chủng vi khuẩn ........46 Hình 3.4: Khả năng tổng hợp NH4+của các chủng vi khuẩn. ....................................47 Hình 3.5: Phương trình đường chuẩn PO43- ..............................................................48 Hình 3.6: Hàm lượng PO43- phân giải của các chủng vi khuẩn .................................49 Hình 3.7: Khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn .......................................49 Hình 3.8: Phương trình đường chuẩn IAA................................................................51 Hình 3.9: Hàm lượng IAA tổng hợp của các chủng vi khuẩn ..................................52 Hình 3.10: Khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn ...................................52 Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................54 Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................55 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến năng phân giải lân của các........................57 chủng tuyển chọn ......................................................................................................57 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. .....................................................................................................57 Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn .................................................................................................................58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii Hình 3.18. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của các .........................59 chủng vi khuẩn tuyển chọn. ......................................................................................59 Hình 3.19: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp IAA của các chủngvi khuẩn tuyển chọn .................................................................................................................60 Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ......................................................................................................62 Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ..................................................................................................63 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii TỪ VIẾT TẮT C2H2 acetylene C2H4 ethylene ARA-Acetylene Reduction Assay K Kali IAA Indole-3-acetic acid IAAld Indole-3-acetaldehyde IAM Indole-3-acetamide IAN indole-3- axetonitril IPA Indole-3-pyruvate IPDC Indole-3-pyruvate decarboxylase NBRIP NationalBotanical Research Institute's phosphate NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu N Nitrogen P Phosphor TSO Tryptophan side-chain oxidase RMR Rennie medium supplemented with rice and malate Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại. Chúng thường được tìm thấy trong những cây ngũ cốc quan trọng, nhiều loài có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, phân giải lân khó tan, kích thích cây tăng trưởng và làm tăng năng suất cây trồng (Muthukumarasamy et al., 2002a, Prabudoss và Stella, 2009). Một số chủng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm soát bệnh cây, nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis, Phytophthora spp., Pythium spp, Rhizoctonia solani, và Verticillium spp (Prabudoss và Stella, 2009). Ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự phát triển của thực vật, chủ yếu là từ những thay đổi hình thái và sinh lý của cây qua việc rễ thực vật được chủng vi khuẩn sẽ tăng số lượng rễ tơ, làm tăng cường độ hô hấp, tăng hoạt động của enzym trong dịch trích rễ làm tăng sự tổng hợp kích thích tăng trưởng của cây (Muller et al., 1989),tăng cường khả năng hấp thu nước và chất khoáng cho cây làm tăng sự phát triển, năng suất cây. Lúa là cây lương thực chính cho nhiều người đặc biệt là các nước Châu Á.Để tăng năng suất lúa cần rất nhiều phân bón đặc biệt là các loại phân bón hóa học nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Ngoài ra, các loại phân bón hóa học hầu như cây trồng không hấp thu hết được sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái... gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái, môi trường canh tác nông nghiệp(Kannaiyan, 1999). Để giảm tải việc sử dụng quá nhiều phân hóa học, việc sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh có các khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất cây trồng. Trên thế giới, nhiều vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng rễ và thân cây lúa như Azospirillum sp., Burkholderiasp., Enterobacter sp., Herbaspirilliumsp.Klebsiella sp…(Koomnok et al., 2007; Mano và Morisaki, 2008). Ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đã có nhiều nghiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh ở cây lúa như phân lập được Burkholderia vietnamiensi, Azospirillum lipoferum từ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam(Van et al., 1994; Cao Ngọc Điệp et al., 2007). Tuy nhiên, việc nghiên cứu và hiểu biết về các loài vi khuẩn nội sinh hữu ích ở cây lúa trồng ở đồng bằng sông Hồng chưa được tập trung nghiên cứu. Vì các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại Gia Lâm”được thực hiện. Mục tiêu đề tài - Phân lập, tuyển chọn được các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây lúa có các khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao. - Đánh giá được tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được đến sinh trưởng, năng suất một số giống lúa trồng tại Gia Lâm. Yêu cầu: - Phân lập được các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lúa. - Đánh giá đượckhả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt. - Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố (thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Đánh giá được tác độngcủa các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất của một số giống lúa trồng tại Gia Lâm. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 CHƯƠNGI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Khát quát về vi khuẩn nội sinh 1.1.1. Giới thiệu Mối quan hệ giữa vi khuẩn có ích và thực vật trong đó có các nhóm vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật là chủ đề của nhiều nghiên cứu gần đây. Hầu hết các nghiên cứu này đều tập trung vào vi khuẩn vùng rễ của thực vật trong đó có các vi khuẩn nội sinh (Ryan et al., 2008). Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kì sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Schulz và Boyle., 2005). Hơn 300 loài thực vật trên trái đất có vi khuẩn nội sinh (Strobel et al.,2004). Tuy nhiên một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và đã tìm thấy nhiều loại vi khuẩn nội sinh với nhiều khả năng tốt (Ryal et al., 2008).Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae, Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus,Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobactervà Paenibacillus (Elmerich., 2007). Tuy nhiên, chúng cũng có thể xâm nhập vào các mô thông qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh., 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002) thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cáchmạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự phát triển của thực vật, chủ yếu là từ những thay đổi hình thái và sinh lý của cây qua việc rễ thực vật được chủng vi khuẩn sẽ tăng số lượng rễ tơ, làm tăng cường độ hô hấp, tăng hoạt động của enzym trong dịch trích rễ làm tăng sự tổng hợp kích thích tăng trưởng của cây trồng(Muller et al., 1989), tăng cường khả năng hấp thu nước và chất khoáng cho cây làm tăng sự phát triển, năng suất cây trồng.Hiện nay, các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 sinh có khả năng tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí, tổng hợp kích thích tố auxin giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường, tănghàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh, phân giải lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp (Hill et al.,1972; Hallmann et al., 1997; Kobayashi và Palmudo.,2000). Ngoài ra vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp các chất kiểm soát sinh học hay chất kháng sinh chống lại các mầm bệnh như vi khuẩn, nấm… gây bệnh cho cây trồng (Ryal et al., 2008). 1.1.2. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Là nhóm vi khuẩn tiền nhân liên kết với thực vật, chúng hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn ở các mô bên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật chủ mà ngược lại chúng còn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sinh trưởng thực vật cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Một số chủng vi khuẩn nội sinh có thể hạn chế sự phát triển của mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với tác động của các nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997). 1.1.2.1. Khả năng cố định đạm Đạm là chất dinh dưỡng cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của cây trồng. Trong không khí có khoảng 78% là khí nitơ nhưng cây trồng không thể hấp thu trực tiếp khí Nitơtrong không khí được. Cây trồng chỉ có thể hấp thu đạm có sẵn trong đất ở dạng ammonium và nitrate thông qua rễ của chúng. Các vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng chuyển hóa Nitơ trong không khí thành dạng đạm mà cây có thể hấp thu được nhờ quá trình cố định đạm sinh học. Cố định đạm sinh học là quá trình chuyển Nitơ trong không khí thành dạng đạm nguyên tử rồi thành dạng đạm vô cơ ammonia - dạng đạm mà cây trồng có thể hấp thụ được, sau đó vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng acid amin hữu cơ để vi khuẩn sử dụngnhờ sự xúc tác của enzyme nitrogenase (Santi et al., 2013). Nitrogenase là một loại enzyme phức hợp gồm 2 thành phần: Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 -Protein chứa sắt hay nitrogenase khửhay thành phần II gồm 2 tiểu phần giống nhau mỗi tiểu phần có khối lương phân tử 29000đvC, ở giữa có 4 nguyên tử sắt và 4 nguyên tử lưu huỳnh không ổn định với axit. -Đơn phân protein lớn hơn chứa sắt và molipden hay thành phần I có khối lượng 220000 đvC gồm 2 nguyên tử Mo và 30 nguyên tử sắt và nhiềunguyên tử lưu huỳnh không ổn định với axitgồm 4 tiểu phần gồm 2 loại, một loại có khối lượng phân tử 50 đvC và một loại có khối lượng phân tử 60000 đvC (Nguyễn Lân Dũng, 2007). Phản ứng cố định đạm: N2 + 8H+ + 8e− + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Quátrình này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau: N2 + 2 H+ → [NH=NH] + 2 H+ → [NH-NH] + 2 H+ → 2 NH3 Phản ứng cố định đạm xảy ra theo trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong Ferredoxin. Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N2để tạo thành HN=NH. Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra H2N=NH2 từ HN=NH, và cuối cùng tạo NH3 từ H2N=NH2. Tùy theo nhóm vi sinh vật mà Ferredoxin khử sẽ được cung cấp điện tử từ quá trình quang hợp hoặc hô hấp hay lên men. Quá trình này được điều khiển bởi các gen nif (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). Ngoài ra, trong quá trình vận chuyển e– cần năng lượng do ATP cung cấp. ATP kết hợp với protein chứa Fe qua 1 cầu Mg và sau đó được thuỷ phân thành ADP và Pi.Sự thuỷ phân đã làm thay đổi hình dạng của protein enzyme, e– được vận chuyển lên phức hệ Fe–Mo. Để vận chuyển 1e– cần 2 ATP. Hoạt tính của enzyme nitrogenase có thể được xác định nhờ hoạt tính khử axetylen (ARA-Acetylene Reduction Assay). Theo Dilworth (1966), enzyme nitrogenase cũng khử C2H2 (acetylene) thành C2H4 (ethylene). Tại phòng thí nghiệm về lý thuyết để khử một phân tử N2 cần 6e, còn để khử 1 phân tử C2H2 chỉ cần 2e do đó phải khử 3 phân tử C2H2 mới tương đương với việc khử một phẩn tử N. Căn cứ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 vào lượng C2H4sinh ra mà người ta xác định được lượng nitơ cố đinh được của loại vi sinh vật có định nitơ. Nitrogenase dễ bất hoạt trong môi trường hiếu khí ở nhiệt độ thấp (0oC). Phản ứng cố định nitơ phân tử nhờ hệ nitrogenase diễn ra ở nhiệt độ bình thường và áp suất khí quyển, nhưng cần rất nhiếu năng lượng của tế bào: cần 147,2 Kcal trong điều kiện kị khí để giải phóng được 2 NH3(trung bình cần 15 đến 20 phân tử ATP để giải phóng 2 NH3). Hệ enzyme cố định nitơ không hoạt động hay hay hoạt động yếu khi có oxi khí quyển, hay sự có mặt của các hợp chất nitơ khác. Enzym nitrogenase được điều khiển bởi hệthốnggennif(nilàchữviếttắtcủanitrogen–nitơvàflàfixing–cốđịnh) trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. Ở Klebsiella pneumonia chức năng hoạtđộng của nitrogenase được xác định ở 17 gen (gen Nit, operon Nit) và ở 7 -8 operon. Người ta chuyển được gen cố định đạm từ vi khuẩn trên sang E.coli(Postgate., 1998) nhờ tiếp hợp. Ở một số sự cộng sinh như Klebsiella sp. với cây lúa hay Azospirillum sp. với bắp, việc bổ sung nguồn carcbon như sodium malate là rất cần thiết cho hoạt động của enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm (Santi et al., 2013). 1.1.2.2. Khả năng phân giải lân khó tan Lân là một trong những dưỡng chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển của cây trồng và cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân dưới dạng hòa tan trong đất. Tuy nhiên, nồng độ lân hòa tan trong đất thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (10M H2PO4-) (Goldstein., 1994). Lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân bón dạng hòa tan mà cây trồng dễ sử dụng nhưng lượng lân vô cơ hòa tan này nhanh chóng bị cố định và kết tủa thành dạng không hòa tan và trở nên không có giá trị đối với cây trồng (Rodríguez và Fraga., 1999). Bên cạnh đó, nhều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen,… có hàm lượng lân trong đất khá cao nhưng cây lại không hút được để sử dụng do lân ở dạng khó tan. Phân hữu cơ trong đất chủ yếu ở dạng inositol phosphate (phytate đất). Nó được tổng hợp bởi vi sinh vật và cây và là dạng hữu cơ ổn định của P trong đất, chiếm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 trên 50% tổng số P hữu cơ (Paul và Clark., 1988).Hợp chất P hữu cơ khác trong đất là dạng phosphomonoeste, phosphodieste bao gồm phospholipid và acid nucleic, và phosphotrieste. Sự chuyển hoá các hợp chất photpho hữu cơ thành muối của H3PO4được thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân huỷ photpho hữu cơ. Những vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzym photphatase để xúc tác cho quá trình phân giải.Sự chuyển hóa các hợp chất phosphate hữu cơ thành muối của H3PO4theo sơ đồ sau (Bạch Phương Lan., 2004). 1. Nucleoprotein 2. Lơxitin Nuclein Glixerphosphate Acid nucleic Nucleotic H3PO4 H3PO4 Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoeste hoặc phosphoanhydride. Phosphohydrolase acid, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’nucleotidase, 5’-nucleotidase, hexose phosphatase và phytase. Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ. Các hợp chất lân vô cơ được hình thành do quá trình phân giải lân hữu cơ (còn gọi là quá trình khoáng hóa lân hữu cơ), phần lớn là các muối phosphat khó tan mà cây trồng không thể hấp thu như Ca3(PO4)2, FePO4, Al2(PO4)3, Những dạng khó tan này trong những môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển hóa thành dạng dễ tan(Trần Cẩm Vân., 2005). Về cơ chế của quá trình phân giải photpho vô cơ do vi sinh vật cho đến nay vẫn còn nhiều tranh cãi. Nhưng đại đa số các nhà nghiên cứu đều cho rằng: sự sinh sinh axit trong qúa trình sống của một số nhóm vi sinh vật đã làm cho nó có khả năng chuyển các hợp chất photpho từ dạng khó tan sang dạng có thể hoà tan (Kucey et al.,1989; Rashid et al.,2004). Một số vi khuẩn có khả năng phân giải lân do chúng có thể tiết ra các acid hữa cơ hòa tan các hợp chất lân khó tan (Yahya and Al- Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 Aseawi., 1989).Các acid hữu cơ này có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu là acid gluconic và acid 2-ketogluconic (Goldstein., 1995; Rodríguez và Fraga., 1999). Các acid hữu cơ khác như acid glycolic, acid oxalic, acid malonic và acid succinic cũng được nhận diện trong một số vi khuẩn có khả năng phân giải lân (Banik and Dey., 1982; Illmer và Schinner., 1992). Đa số các vi sinh vật có khả năng phân giải lân vô cơ yếu sinh CO2 trong quá trình sống, CO2sẽ phản ứng với H2O có trong môi trường trở thành H2CO3,H2CO3 sẽ phản ứng với photphat khó tan thành photphat dễ tan theo phương trình sau: Ca3(PO4)2+ 4 H2CO3+ H2O> Ca(H2PO4)2 + H2O + 2 Ca(HCO3)2 Hầu hết các vi sinh vật phân huỷ lân vô cơ trong quá trình sống đều làm giảm pH môi trường. Tuy nhiên, gần đây có một vài tác giả đã công bố tìm ra một vài chủng vi khuẩn phân giải lân mà trong quá trình nuôi cấy không làm giảm pH môi trường. Ngoài cơ chế acid hóa, theo Moghimi và Tate (1978), các vi khuẩn còn có thể phân giải lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion. Trong đó, phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp phân giải lân khó tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức. 1.1.2.3. Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) Indole-3-acetic acid (IAA) là một loại auxin phytohormone tự nhiên mà nhiều loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp được (Spaepen et al., 2007). IAA chi phối sự phân chia tế bào ở giai đoạn đầu phát tiển của cây trồng, sự giản dài tế bào, phân hóa sinh mô và phát triển quả và hạt.Ngoài ra, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự tạo thành lông rễ (Theologis và Ray., 1982; Gray et al., 2001). Theo Spaepen và Vanderleyden (2011) trên 80% vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ có khả năng tổng hợp IAA. Nhiều loài vi khuẩn cố định đạm sống tự do, vi khuẩn sống cộng sinh có cơ chế tổng hợp IAA từ tiền chất chính là L-tryptophan như Azospirillum brasilense (Somers et al., 2005), Azotobacter (Ahmad etal., 2005) và Enterobacter cloacae (Koga et al., 1991). Từ tiền chất là L-tryptophan, có ít nhất 5 lộ trình được Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 mô tả cho sự tổng hợp ợp IAA, trong đó vi khuẩn tổng hợpp IAA chủ yyếu qua ba lộ trình là lộ trình indole-33-acetamide (IAM), lộ trình indole-3-pyruvate pyruvate (IPA) và llộ trình Tryptamine (TAM) và các lộ trình khác như, lộ trình ình Tryptophan side side-chain oxidase (TSO) và lộ trình ình indole-3-acetonitrile indole (IAN) (Spaepen Spaepen và Vanderleyden Vanderleyden., 2011). Hình 1.1: Tổng ng quát các llộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khu khuẩn (Spaepen et al., 2007) Con đường tổng hợp ợp IAA từ t lộ trình Indole-3-acetamide(IAM) Con đườngtổng hợp ợp IAA theo lộ l trình indole-3-acetamit acetamit (IAM) được đánh giá tốt nhất và đặc trưng cho o sự s tổng hợp IAA của vi khuẩn. Lộ trình ình indole indole-3-acetamide (IAM) là lộ trình được tìm ìm thấy th ở vi khuẩn cộng sinh cố định đạm m của các lo loài thuộc giống Rhizobium và Bradyrhizobium. Đầu tiên, ên, enzyme tryptophan-2- monooxygenase (được ợc mã m hóa bởi gene iaaM) chuyểnn tryptophan th thành IAM, tiếp theo IAM được thủy y phân thành th IAA và ammonia bởi enzyme an IAM hydrolase (được mã hóa bởi gene iaaH) iaaH (Spaepen và Vanderleyden., 2011). Theo Glickmann et al (1998), Pseudomonas syringae cũng tổng hợp IAA theo lộ trình ình này. Tryptophan→indole indole-3-acetamide(IAM)→IAA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9