Tài liệu Luận văn xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật pcr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Long Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108 Thái Nguyên - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cửa tôi dưới sự hưỡng dẫn của TS. Nguyễn Văn long. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả Phạm Quỳnh Trang ii LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 Học viên Phạm Quỳnh Trang iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................ix MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................2 CHƯƠNG I......................................................................................................................3 TỔNG QUAN..................................................................................................................3 1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc ...............................................................................3 1.1. Giác mạc ...........................................................................................................4 1.1.1. Biểu mô ....................................................................................................4 1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann ...................................................................5 1.1.3. Nhu mô ......................................................................................................5 1.1.4. Màng Descemet .........................................................................................5 1.1.5. Nội mô .......................................................................................................5 1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc ...........................................................6 1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc ...........................6 1.3.1. Triệu chứng cơ năng ..................................................................................6 1.3.2. Triệu chứng thực thể..................................................................................7 2. Microsporidia .........................................................................................................8 2.1. Giới thiệu chung ............................................................................................... 8 2.2. Bệnh học và nguy cơ ......................................................................................11 2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia ...............................................12 2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc........................................................................12 2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia ....................................................13 2.5.1. Chẩn đoán phân biệt ...................................................................................13 2.5.2. Chẩn đoán xác định .................................................................................14 iv 3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ............................................................................19 3.1. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam hiện nay..................................................................................................................19 3.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ..........20 Chương II.......................................................................................................................22 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................22 1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 22 2. Hóa chất, thiết bị ....................................................................................................22 2.1. Hóa chất ..........................................................................................................22 2.2. Thiết bị, máy móc ........................................................................................... 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................24 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số .....................................................24 2.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ ........................................................................................................................... 25 2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................25 2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic.............................................26 2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và Realtime PCR ....................................................................................................28 2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR ................30 CHƯƠNG III .................................................................................................................36 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................................ 36 3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR ........................................................................................................36 3.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ..................39 3.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ........................... 39 3.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR .....................41 3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia .........................................43 3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt ................................................................ 46 v KẾT LUẬN ...................................................................................................................53 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện các tác nhân gây ra tai nạn về mắt trong lao động sản xuất (theo thống kê hàng năm của BV Mắt TP HCM)(%) .................................. 3 Hình 2. Thiết đồ cắt dọc giác mạc......................................................................... 4 Hình 1.3. Hình ảnh minh họa Microsporidia ...................................................... 10 Hình 1.4. Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman ..... 18 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia.. ............................................................................ 36 Hình 3.2. Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc của bệnh nhân KHUYEN. .............................. 37 Hình 3.3. Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới. ................................ 38 Hình 3.4. Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia bằng phản ứng Realtime PCR. ............................................................................ 39 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR phát hiện Vittaforma corneae.. ............................................................................ 40 Hình 3.6. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime phát hiện Vittaforma corneae. ..................................................................................... 41 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR phát hiện Microsporidia. ..................................................................................... 42 Hình 3.8. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR phát hiện Microsporidia. ............................................................................ 42 Hình 3.9a. Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13....... 43 Hình 3.9b. Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13 trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia. ....................................... 44 Hình 3.10. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45 vii Hình 3.11. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45 Hình 3.12. A,B. Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47 Hình 3.13 A. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47 Hình 3.13 B. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 48 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi MF1&MF2 .......................................................................................................... 28 Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R ................................. 29 Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT ....................................................... 30 Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp ..................................................................................................................... 30 Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp ................................................................................................. 31 Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp ........................................................................................................ 32 Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp ......................................................................................... 32 Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 33 chuẩn dương ........................................................................................................ 33 Bảng 2.9. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 34 chuẩn dương ........................................................................................................ 34 Bảng 3.1. Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính với Vittaforma corneae ................................................................................ 40 Bảng 3.2. Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR....... 49 Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng...... 50 ix DANH MỤC VIẾT TẮT AND Axit deoxyribonucleic RNA Axít ribonucleic SUU Small-subunit VLGM Viêm loét giác mạc 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Viêm loét giác mạc là một bệnh phổ biến nhất trong các bệnh về mắt. Bệnh phân bố trên toàn thế giới với tỷ lệ từ 17% đến 36% trong bệnh viêm loét giác mạc nói chung. Tuy vậy, tại các quốc gia có khí hậu nóng, ẩm tỷ lệ bệnh cao hơn, như ở Ấn độ tỷ lệ bệnh từ 44% đến 47%. Mặt khác, bệnh cũng có liên quan đến các chấn thương giác mạc và việc sử dụng thuốc không đúng chỉ định Giác mạc không chỉ dễ bị viêm loét do những tác nhân từ bên ngoài mà cũng có thể là do mắt chưa được chăm sóc và bảo vệ đúng cách từ bên trong. Có nhiều tác nhân gây ra vết loét bị nhiễm trùng; thường là do sự tấn công của các loại vi khuẩn (tụ cầu, liên cầu, phế cầu, lậu cầu, trực khuẩn mủ xanh, Moraxella,.), do nấm (Aspergillus fumigatus, Fusarium solant, Candida albicans, Histoblasma,..), do virus (Herpes simplex, Herpes zoster) hoặc do ký sinh trùng (Acanthamoeba). Theo các báo cáo gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do Microsporidia ngày càng tăng, nhất là ở các nước vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm như nước ta, chiếm 0,4% các trường hợp mắc viêm giác mạc do vinh sinh vật gây ra [13]. Loài kí sinh này có thể gây bệnh ở mọi lứa tuổi và nguồn nước không đảm bảo vệ sinh là tác nhân lây truyền bệnh. Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Bệnh nhân bị nhiễm Microsporidia biểu hiện các triệu chứng trên lâm sàng như: tiêu chảy cấp, viêm thành phế nang, viêm loét giác mạc, viêm phế quản, viêm thận, viêm niệu đạo, viêm tuyến tiền liệt, viêm gan, viêm não, viêm cơ và viêm phúc mạc. Triệu chứng phổ biến hay gặp nhất ở người liên quan đến bệnh tiêu hóa kết hợp nhiễm HIV. Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia. Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực 2 hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron microscopy). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụng thường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia, tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế về kháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại bỏ trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về việc sử dụng công nghệ sinh học phân tử trong việc hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh viêm loét giác mạc do Microsporida gây ra. Do đó, để hỗ trợ giúp đỡ cho khả năng chẩn đoán nhanh phát hiện Microsporida chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR.” 1.Mục tiêu của đề tài: Xây dựng và tối ưu hóa phản ứng PCR và Realtime PCR để phát hiện ra Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc. 2. Nội dung nghiên cứu - Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR trên mẫu bênh phẩm viêm giác mạc. - Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật Realtime PCR trên mẫu bênh phẩm viêm giác mạc. - Áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR vào việc phát hiện Micrisporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc tại Việt Nam. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc Viêm loét giác mạc (VLGM) là bệnh nhiễm trùng nặng ở mắt do vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, virut, kí sinh trùng.v.v… Bệnh viêm loét giác mạc thường tiến triển nặng, gây nhiều biến chứng và khi khỏi để lại sẹo dày ở giác mạc gây mờ đục giác mạc, làm giảm thị lực nghiêm trọng [1, 8]. Ở các nước phát triển như Mỹ, Tây Âu tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm chiếm khoảng 3% trong tổng số các nguyên nhân gây viêm loét giác mạc. Tỷ lệ này cao hơn ở các nước đang phát triển như: Ấn Độ, Nê-pan, Băng-la-đét...(dao động từ 20% đến 60%) [8, 9, 13, 14]. Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt trung ương trong 10 năm (1998 - 2007) trong số 3210 bệnh nhân viêm loét giác mạc được điều trị nội trú thì viêm loét giác mạc chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 50,8% [1]. Có nhiều nguyên nhân gây ra viêm loét giác mạc như: vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng, Microsporidia… Tỷ lệ gặp các tác nhân gây bệnh này thay đổi theo thời gian do có sự thay đổi về môi trường, kinh tế, các yếu tố nguy cơ và sự hiểu biết của người dân.Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu tại bệnh viện mắt Trung ương những năm 1991- 1996 thì tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm khá cao 42,11% nhưng vào năm 2004- 2005 thì tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm lại được ghi nhận nhiều hơn 59,8% trong khi vi khuẩn chỉ chiếm 29,4%. Điều trị viêm loét giác mạc tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ trầm trọng của bệnh. Việc điều trị viêm loét giác mạc ở nước ta hiện nay tương đối hiệu quả. Song tỉ lệ biến chứng sẹo thủng giác mạc, giảm thị lực thậm chí mù lòa tăng lên rất nhiều nếu việc chẩn đoán và điều trị không kịp thời. Nhất là khi điều kiện kĩ thuật giúp chẩn đoán ở các cơ sở chưa phát triển và bệnh nhân chưa ý tức được sự nguy hiểm của bệnh viêm loét giác mạc. Điều này không chỉ gây nên gánh nặng cho bản thân người bệnh mà còn làm tăng gánh nặng cho gia đình và toàn xã hội [2, 6, 7]. 4 1.1. Giác mạc Giác mạc là một màng xơ trong suốt, không có mạch máu, chiếm 1/5 diện tích phía trước của vỏ nhãn cầu diện tích khoảng 123mm vuông. Bán kính độ cong giác mạc trung bình ở người Việt Nam trưởng thành là 7,71±0,24mm Đường kính ngang bằng 12mm, đường kính dọc bằng 11mm. Độ dày là 0,509mm ở trung tâm, 0,74mm ở sát vùng rìa. Ranh giới giữa giác mạc và củng mạc là vùng rìa giác mạc bề rộng của vùng rìa chừng 1mm. Đây là vùng có cấu tạo giải phẫu rất đặc biệt và vai trò sinh lý rất quan trọng của nhãn cầu [1, 8, 19]. Giác mạc được cấu tạo gồm 5 lớp từ trước ra sau, bao gồm: - Lớp biểu mô giác mạc - Lớp màng Bowman - Lớp nhu mô - Lớp màng Descemet - Lớp nội mô Hình 1.1. Thiết đồ cắt dọc giác mạc 1.1.1. Biểu mô Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, liên tiếp với biểu mô của kết mạc nhãn cầu và dễ tách ra khỏi màng Bowmann ở dưới, dày khoảng 32-50 µm, gồm 5-7 hàng tế bào không sừng hoá, có dạng trụ ở lớp đáy, càng lên phía trước càng dẹt đi [1, 8]. Biểu mô giác mạc là lớp bảo vệ, ngăn không cho các vi sinh vật xâm nhập vào nhu mô giác mạc. Tuy nhiên, khi biểu mô toàn vẹn, các thuốc cũng rất khó thấm qua biểu mô, nhất là các thuốc không tan trong nước [1, 8]. 5 1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann Màng đáy là một màng rất mỏng nằm sát ngay dưới lớp tế bào đáy của biểu mô (thực chất do tế bào đáy tạo thành), dày khoảng 40-60 µm [1, 8]. Màng Bowmann là một màng trong suốt, dày khoảng 12µm và khá dai. Mặt trước có giới hạn rõ rệt, mặt sau khó phân tách với nhu mô giác mạc. Màng này khi bị tổn thương thì không có khả năng hồi phục, ở vùng tổn thương sẽ để lại sẹo mỏng [2, 19]. 1.1.3. Nhu mô Nhu mô chiếm 90% bề dày giác mạc, cơ bản được tạo thành bởi các lá sợi collagen xếp song song nhau, các giác mạc bào (keratocytes) và các chất ngoại bào. Ngoài ra trong nhu mô giác mạc còn có một số bạch cầu di động giữa các lá collagen và các sợi thần kinh không myelin xuất phát từ thần kinh mi (thuộc nhánh mắt của dây thần kinh số V) đi theo hình nan hoa vào lớp giữa nhu mô ở trung tâm giác mạc, sau đó chia nhánh theo kiểu phân đôi và đi lên các lớp nông giác mạc, qua màng Bowmann và tận cùng bằng các đầu tiếp nhận cảm giác ở giữa các tế bào biểu mô. Do đó tổn thương giác mạc càng nông thì các triệu chứng chủ quan của bệnh nhân càng mạnh [1, 8]. Khi nhu mô tổn thương sẽ để lại sẹo dày. 1.1.4. Màng Descemet Màng Descemet được cấu tạo bởi các sợi collagen dạng lưới. Màng Descemet chỉ dày 6µm, tách khỏi nhu mô dễ dàng và có thể được tái tạo bởi lớp nội mô. Màng Descemet rất dai, có tính đàn hồi cao nên khi bị rách hai mép dễ thun lại và tách rời nhau khỏi chỗ tổn thương [2]. Màng Descemet tương đối bền vững, có thể tồn tại kể cả khi giác mạc bị hoại tử gần hết nhu mô [1, 8]. 1.1.5. Nội mô Nội mô gồm một hàng tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 20 µm, dày 4 - 6 µm với một nhân lớn chiếm gần hết tế bào, liên kết với nhau bằng những liên kết chặt và liên kết dạng khe hở [1]. Tế bào nội mô không phân chia và số 6 lượng tế bào nội mô giảm dần theo tuổi tác: lúc sinh mật độ tế bào là 4000 tế bào/mm2, số lượng tế bào giảm xuống còn khoảng 1400 - 2500 tế bào/mm2 ở người trưởng thành. Khi mật độ tế bào chỉ còn 400 - 700 tế bào/mm2 hoặc thấp hơn thì các tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bù trừ. Giác mạc sẽ bị ngấm nước và trở nên phù đục mất đặc tính trong suốt [3, 8]. 1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc - Chấn thương: làm tổn thương một phần hay toàn bộ giác mạc. + Chấn thương nông nghiệp: là yếu tố thường gặp nhất, chủ yếu do các tác nhân thực vật (cành cây, gai, mảnh gỗ, hạt thóc, lá lúa,…). + Chấn thương công nghiệp: các dị vật bắn vào giác mạc (phoi tiện, mảnh sắt vụn, đá….). - Các bệnh mãn tính trên bề mặt nhãn cầu (hở mi, lông xiêu, lông quặm, viêm giác mạc do herpes…) làm khô giác mạc và xước giác mạc. - Liệt dây thần kinh số V: làm cho giác mạc mất cảm giác. Vì vậy, giác mạc không được bảo vệ bởi phản xạ nhắm mắt. - Các yếu tố nguy cơ khác: sử dụng kính tiếp xúc, phẫu thuật ở giác mạc và kết mạc, suy giảm miễn dịch, sử dụng thuốc kháng sinh và các thuốc corticosteroid mà không có sự kiểm soát của các bác sĩ chuyên khoa mắt, bệnh nhân có tiền sử mắc bệnh nấm ở da, niêm mạc, nội tạng… [8, 19]. 1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc Viêm loét giác mạc do kí sinh trùng có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng. Tuy nhiên, bệnh có các triệu chứng đặc trưng. Do đó, các triệu chứng có thể giúp định hướng chẩn đoán nguyên nhân trong trường hợp chưa có kết quả cận lâm sàng [1, 3, 19]. 1.3.1. Triệu chứng cơ năng - Dấu hiệu kích thích mắt: sợ ánh sáng, cộm, chói, chảy nước mắt, co quắp mi. - Đau nhức: đau âm ỉ tại mắt, đau có thể lan ra xung quanh hốc mắt hoặc lan lên đầu. 7 - Nhìn mờ: thị lực giảm nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ tổn thương trên giác mạc [19]. 1.3.2. Triệu chứng thực thể Các dấu hiệu thường gặp: - Kết mạc cương tụ rìa hoặc toàn bộ. - Đặc điểm của ổ loét giác mạc: + Vị trí: có thể ở vùng rìa, cạnh trung tâm, trung tâm hoặc toàn bộ giác mạc. + Màu sắc: thường có màu trắng xám và giác mạc xung quanh mờ đục do phù nề. + Kích thước: từ những chấm nhỏ đến toàn bộ giác mạc. + Hình thái: * Bờ ổ loét: thâm nhiễm như lông hoặc dạng sợi, trong nhu mô giác mạc có những đường phân nhánh tỏa theo hình nan hoa từ bờ của ổ loét ra nhu mô xung quanh được gọi là thẩm lậu dạng ngón tay hay dấu hiệu chân giả. * Bề mặt ổ loét: bề mặt gồ cao, toàn bộ hoặc phần lớn đáy ổ loét cao hơn giác mạc xung quanh, không có hoại tử mềm mà thô ráp khô như một miếng màng cứng, dạng vảy. * Áp xe giác mạc: ổ áp xe đặc chiếm hết bề dày nhu mô và tiến triển vào tiền phòng. * Mảng nội mô: là mảng xuất tiết trắng, dày bám mặt sau nội mô, có thể xuất hiện trong trường hợp viêm loét giác mạc không phải do nấm. Một số trường hợp biểu mô đã hàn gắn hoàn toàn nhưng mảng này vẫn còn tồn tại thì nghĩ nhiều đến nấm. * Vòng thâm nhiễm: hay còn gọi là vòng miễn dịch, là vòng trắng bao quanh ổ loét, thường có một khoảng giác mạc lành ngăn cách với ổ loét, có thể đây là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh. * Tổn thương vệ tinh: ở cạnh ổ loét và có vẻ như tách rời ổ loét. 8 + Phản ứng tiền phòng: biểu hiện của một phản ứng viêm nặng ở mắt, thường xuất hiện dấu hiệu Tyndall kèm theo nếp gấp ở màng Descemet. * Mủ tiền phòng: là dấu hiệu thường gặp trong viêm loét giác mạc. Kí sinh trùng có thể xuyên qua màng Descemet vào tiền phòng ngay cả khi ổ loét giác mạc nhỏ. Có thể đó là mủ vô trùng do lắng đọng các tế bào viêm. Mủ có thể tái phát, tái xuất hiện nhanh sau khi rửa mủ tiền phòng [16, 19]. 2. Microsporidia 2.1. Giới thiệu chung Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào bắt buộc, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Microsporidia” không phải là một từ thuộc phân loại học, có liên hệ đến một vi sinh vật thuộc bộ Microsporida, ngành Microspora. Thuật ngữ về phân loại học của Microsporidia phức tạp và thay đổi. Có 14 loài thuộc 07 họ được báo cáo gây bệnh trực tiếp cho người (Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, Pleistophora, Vittaforma, Trachipleistophora và Brachiola).Trong đó chỉ có hai loài được công nhận gây bệnh trên mắt là Nosema, Vittaforma. Microsporidia ngày càng được công nhận là tác nhân truyền nhiễm gây bệnh đường ruột, mắt, viêm xoang, phổi và tiết niệu. Microsporidia là kí sinh trùng đơn bào nhỏ (dài 3,5-5µm và rộng 2-3µm), hình oval, kí sinh bắt buộc nội tế bào sinh dưỡng. Theo cây phả hệ, Microsporidia là sinh vật sinh dưỡng, bởi vì chúng có nhân thực, ribosome giống sinh vật nhân sơ và thiếu ti thể. Có 7 chi và cả các loài Microsporidia chưa được phân loại gây bệnh trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch và bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh [5, 20]. Phần lớn chu kỳ phát triển của Microsporidia ở dạng bào tử, là trạng thái dễ phát hiện hơn so với ở giai đoạn tăng sinh nội bào. Bào tử kháng lại các yếu tố bên ngoài, chúng có thể sống sót trong môi trường khắc nghiệt trong thời gian dài. Sự hình thành ống phân cực ở hầu hết cấu trúc bào tử Microsporidia đánh dấu sự xâm nhiễm đầu tiên vào tế bào vật chủ, với sự xâm nhiễm trực tiếp thông 9 qua ống phân cực của bào tử được lộn ra phía bên ngoài, tiếp đó chất nguyên sinh bào tử (sporoplasm) được chuyển vào bên trong tế bào lây nhiễm. Có hai giai đoạn trong chu kỳ phát triển của Microsporidia: pha bắt đầu tăng sinh (merogony) tiếp đến là pha tạo bào tử (sporogony) [7, 11, 12]. Chỉ có 2 loài được công nhận gây viêm nhiễm ở mắt. Hai biểu hiện lâm sàng của bệnh vi bào tử mắt là Viêm giác mạc nhu mô gây bởi Nosema corneum trên bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh và Viêm kết giác mạc chấm nông do dòng Encephalitozoon ở bệnh nhân AIDS hoặc người đeo kính áp tròng. Tuy nhiên, các báo cáo hiện nay chỉ ra rằng viêm dính giác mạc cũng có thể xảy ra ở bệnh nhân không bị suy giảm miễn dịch. Năm 2015, Phạm Ngọc Đông và cs. đã nghiên cứu hồi cứu 12 mắt (11 bệnh nhân) viêm giác mạc nhu mô do Microsporidia. Tất cả bệnh nhân đều có HIV (-). Thời gian mắc bệnh trung bình 5,25 ± 6,56 tháng, đã dùng nhiều loại kháng sinh, corticosteroid. Tổn thương nhu mô kèm theo loét giác mạc gặp ở 10/12 mắt; 2 mắt chỉ có áp xe sâu trong nhu mô, không có loét giác mạc; 7/12 mắt có mủ tiền phòng; 3/12 mắt tăng nhãn áp. Điều trị nội khoa gồm kháng sinh fluoquinolon, chống nấm, albendazol. Chỉ 1 mắt điều trị khỏi bằng thuốc, 2 mắt (của 1 bệnh nhân) bỏ điều trị. Số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị [2]. Kết luận: viêm giác mạc nhu mô do Microsporidia lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam, với các tổn thương nhu mô không đặc hiệu, chủ yếu gặp ở nữ, người lao động chân tay, có HIV (-). Việc điều trị nội khoa khó khăn, hầu hết phải ghép giác mạc điều trị. Bệnh vi bào tử ở mắt của bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh có thể bị lẫn với viêm giác mạc do vi rút herpes gây ra. Bệnh nhân thường có biểu hiện đau kéo dài, đỏ mắt, chảy nước mắt, mờ mắt và giảm tầm nhìn [5, 6, 19]. Một số bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm sang trường hợp viêm giác mạc nhu mô do Herpes vi-rút và được điều trị bằng thuốc kháng vi-rút và steroids. Trong thăm khám, bệnh nhân có thể có biểu hiện sưng phù mí mắt, xung huyết kết mạc. Tổn thương ở giác mạc thường thâm nhiễm nhu mô từ nông đến sâu cùng