Tài liệu Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men và hệ enzyme amylase trong mầm lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MEN RƯỢU TỪ NẤM MEN VÀ HỆ ENZYME AMYLASE TRONG MẦM LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG Viện NC&PT Công nghệ Sinh học BÙI DUY NHÂN Lớp: Công nghệ Sinh học K32 CẦN THƠ, THÁNG 05/2010 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG BÙI DUY NHÂN DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Hoàn thành một đề tài luận văn tốt nghiệp là một phần quan trọng đánh giá sự tiến bộ và hoàn thiện của một sinh viên đại học. Quá trình làm luận văn là cả một khoảng thời gian dài kiểm tra lại kiến thức, học hỏi và trau dồi kỹ năng, là hành trang quan trọng để bước vào công việc thực tế. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ, động viên từ phía gia đình, thầy cô, các anh chị hướng dẫn và bạn bè. Mọi người đã tiếp thêm niềm tin, nghị lực để tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành luận văn. Tôi xin gởi những lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: - Cô Ngô Thị Phương Dung và anh Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn tôi về kiến thức, kỹ năng cũng như động viên về tinh thần cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. - Các thầy cô, anh chị hướng dẫn trong các phòng thí nghiệm Viện NC&PT CNSH đã tận tình hỗ trợ trang thiết bị cho tôi hoàn thành luận văn. - Các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong những năm học tập dưới mái trường đại học. - Chị Nhan Thanh Thúy, bạn Nguyễn Duy Tiến đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành những chỉ tiêu quan trọng trong luận văn. - Các thầy cô, anh chị cao học, bạn sinh viên công tác và học tập tại Viện NC&PT CNSH đã thăm hỏi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. - Cô Trần Thị Xuân Mai, Thầy Trần Nguyên Tuấn và các bạn sinh viên lớp Công nghệ Sinh học khóa 32 là chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên to lớn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong hoạt động và học tập, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn và những nhiệm vụ khác. - Những người thân trong gia đình tôi đã cảm thông, chia sẽ, giúp tôi an tâm và có lòng tin hoàn thành 4 năm đại học và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn. Chúc mọi người sức khỏe và thành đạt. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Những món ăn và thức uống lên men góp một phần quan trọng để tạo nên sự phong phú và đa dạng cho nền văn hóa ẩm thực. Rượu là thức uống lên men khá phổ biến và gắn liền với đời sống người dân Việt Nam. Sản xuất thành công một loại men rượu có hiệu suất cao và rút ngắn thời gian lên men là phương pháp khả quan trong việc hạn chế tình trạng rượu kém chất lượng trên thị trường. Với mục tiêu trên, đề tài, “Nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men và hệ enzyme amylase trong mầm lúa” đã được thực hiện. Kết quả đã xác định được mật số của nấm men trong 5 loại men rượu thị trường đạt từ 7,49 đến 10,23 log cfu/g, đồng thời phân lập được 26 dòng nấm men thuần. Từ thí nghiệm so sánh khả năng lên men ethanol của các dòng men đã sơ tuyển được 5 dòng men mạnh nhất từ mỗi loại men và tiến hành so sánh với dòng men Saccharomycese cerevisiae. Kết quả đã chọn được dòng men S. cerevisiae làm nguồn men giống cho bột men thuần. Đề tài cũng đã khảo sát được sự biến đổi lượng enzyme amylase trong mầm lúa qua các ngày ủ, mầm lúa có hoạt tính enzyme cao nhất sau 4 ngày ủ (9,0 U/g). Ngoài ra bước đầu đã thử nghiệm sản xuất được bột men có khả năng lên men rượu bằng phương pháp phối trộn giữa bột men thuần và bột mầm lúa theo một tỉ lệ nhất định. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ..................................................................................................... LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. TÓM TẮT .................................................................................................................. i MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. v Chương 1: GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1. Hệ vi sinh vật trong men làm rượu ................................................................ 3 2.1.1. Hệ vi sinh vật trong men rượu cổ truyền .................................................... 3 2.1.2. Hệ vi sinh vật trong men rượu thị trường................................................... 3 2.2. Quá trình đường hóa và quá trình lên men rượu ......................................... 4 2.2.1. Quá trình đường hóa ................................................................................. 4 2.2.2. Quá trình lên men rượu ............................................................................. 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men trong quá trình lên men rượu ............. 7 2.3. Quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống ................................................... 9 2.4. Quy trình sản xuất men rượu ...................................................................... 11 2.4.1. Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền.................................................... 11 2.4.2. Các loại men truyền thống........................................................................ 13 2.5. Hệ enzyme amylase trong hạt malt .............................................................. 13 2.5.1. Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase .................................................... 13 2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme amylase trong quá trình đường hóa….14 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16 3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................ 16 3.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 16 3.1.2. Hóa chất................................................................................................... 16 3.1.3. Môi trường phân lập nấm men ................................................................. 16 3.1.4. Thiết bị - dụng cụ ..................................................................................... 16 3.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 3.2.1. Thí nghiệm 1: Thu thập và đánh giá các loại men rượu trên thị trường .... 17 3.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập và ghi nhận hình ảnh các dòng nấm men ............. 17 3.2.3. Thí nghiệm 3: So sánh và tuyển chọn dòng nấm men có khả năng lên men ethanol mạnh. .................................................................................................... 18 3.2.4. Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase trong mầm lúa ...... 20 3.2.5. Thí nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men và enzyme amylase .......... 20 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng lên men của bột men gồm nấm men và enzyme amylase.................................................................................................. 22 3.3. Phương pháp phân tích................................................................................. 24 3.3.1. Khả năng lên men rượu của nấm men S. cerevisiae từ dịch đường hóa .... 24 3.3.2. Thử nghiệm sản xuất bột men thuần ......................................................... 24 3.3.3. Phương pháp xác định mật số nấm men ................................................... 24 3.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ..................................... 24 3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê ............................................................. 24 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................. 25 4.1. Thí nghiệm 1: Thu thập và đánh giá các loại men thị trường..................... 25 4.2. Thí nghiệm 2: Phân lập các dòng nấm men từ các loại men thị trường. .... 25 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh khả năng lên men ethanol và tuyển chọn dòng nấm men tốt nhất ......................................................................................................... 26 4.3.1. Thí nghiệm so sánh khả năng lên men ethanol .......................................... 26 4.3.2. Thí nghiệm so sánh khả năng lên men ethanol giữa các dòng men được chọn và dòng men S. cerevisiae .......................................................................... 28 4.4. Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase trong quá trình lên mầm lúa ................................................................................................................ 31 4.5. Thí nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men và enzyme amylase.......... 32 4.5.1. Sản xuất bột men thuần ........................................................................... 32 4.5.2. Sản xuất bột mầm lúa ............................................................................... 32 4.5.3. Thử nghiệm sản xuất bột men gồm nấm men và enzyme amylase .............. 32 4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng lên men của bột men gồm nấm men và enzyme amylase.................................................................................................... 32 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 32 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 35 5.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36 PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH CÁC DÒNG NẤM MEN PHÂN LẬP PHỤ LỤC 4: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của bột men gồm nấm men và enzyme amylase.................................................................................................. 23 Bảng 2. Mật số nấm mốc, nấm men trong 5 loại men rượu thị trường ................ 25 Bảng 3: Chiều cao trung bình cột khí CO 2 (cm) của 26 dòng men ....................... 27 Bảng 4: Kết quả đo độ cồn các mẫu ở 20oC sau 48 giờ lên men .......................... 30 Bảng 5: Độ cồn ở 20oC sau lên men của các mẫu ................................................. 33 Bảng 6: Phân tích phương sai ảnh hưởng của các dòng nấm men đến độ cồn . PL2 Bảng 7: Kiểm định LSD 95% ảnh hưởng của các dòng nấm men đến độ cồn . PL2 Bảng 8: Phân tích phương sai ảnh hưởng của ngày ủ đến hoạt tính enzyme trong mầm lúa ................................................................................................................ PL2 Bảng 9: Kiểm định LSD ảnh hưởng của ngày ủ đến hoạt tính enzyme trong mầm lúa ......................................................................................................................... PL2 Bảng 10: Hoạt tính enzyme amylase qua các ngày ủ ......................................... PL4 Bảng 11: Kết quả dựng đường chuẩn bằng phương pháp Nelson và phương trình đường chuẩn ........................................................................................................ PL4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Lộ trình đường phân. ................................................................................... 6 Hình 2: Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền .................................................. 11 Hình 3. Quy trình tổng quát sản xuất men rượu đế thuần. ................................... 12 Hình 4: Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm xác định mật số nấm men. ........... 15 Hình 5: Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng lên men. ............................................ 20 Hình 6: Quy trình sản xuất bột men thuần. ........................................................... 21 Hình 7: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của bột men gồm nấm men và enzyme amylase................................................................................................... 23 Hình 8, 9: Dòng men Y2 Linh Chi, Y2 Dung-Đức Thành..................................... 26 Hình 10, 11: Dòng men Y2 Hải Anh Quang, Y3 Hoàng Anh ............................... 26 Hình 12: Biểu đồ chiều cao cột khí CO2 (cm) theo thời gian của 6 dòng men ....... 29 Hình 13: Biểu đồ so sánh khả năng lên men của các dòng..................................... 29 Hình 14: Hoạt tính enzyme trung bình (U/g) trong mầm thóc qua các ngày ủ. ... 31 Hình 15: Lượng bọt khí CO2 theo thời gian ........................................................... 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Chương 1: GIỚI THIỆU Thưởng thức rượu đã là một phần không thể tách rời trong sinh hoạt văn hóa, lễ hội và giao tiếp của người Việt Nam. Rượu cũng là một nét văn hóa mang đậm bản sắc riêng của từng dân tộc và từng vùng. Ở nông thôn nước ta, đặc biệt là nông thôn Nam Bộ, rượu còn là phương tiện bày tỏ lòng hiếu khách của người dân. Tại nhiều nơi ở nước ta, tên địa phương được dùng để đặt cho loại rượu ngon đặc trưng của vùng, có thể kể ra một loạt tên rượu địa phương như Kim Sơn, Làng Vân, Mẫu Sơn, Thổ Hà, Tạnh Xá, Nga Sơn, Kim Long, Làng Chuồn, Đá Bạc, Bồng Sơn, Bàu Đá, Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh, Tân Lộc, Văn Điển, Bó Nặm, Trương Xá, Phú Lộc, Đại Lâm,… Đặc biệt, Đồng bằng Sông Cửu Long là một trong những vùng có nghề sản xuất rượu lâu đời và gắn liền với từng địa danh là những thương hiệu nổi tiếng từ xưa như rượu Phú Lễ (Bến Tre), rượu đế Gò Đen (Long An), Nhị Quý (Tiền Giang). Nguyên liệu để nấu rượu thường là gạo, nếp, sắn (khoai mì). Mỗi loại nguyên liệu tạo thành một hương vị đặc trưng của rượu. Rượu gạo là loại rượu phổ biến nhất ở Việt Nam. Mỗi sản phẩm rượu đều có một công thức đặc trưng riêng mang đậm tính thủ công truyền thống. Nhưng cũng chính vì lí do đó mà năng suất rượu làm ra không được ổn định và chất lượng sản phẩm rượu một số nơi vẫn chưa đạt tiêu chuẩn Rượu do Nhà nước quy định (TCVN 7043:2002), đặc biệt là các chỉ tiêu chất lượng về hóa lý, vi sinh và an toàn thực phẩm. Chính vì thế mà sản phẩm rượu truyền thống vốn nổi tiếng từ rất lâu đời nhưng vẫn không thể mở rộng được để phục vụ rộng rãi hơn nữa cho người tiêu dùng trong nước, cũng như không thể xuất khẩu ra thị trường nước ngoài. Do đó, cần hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất rượu một cách khoa học và cải tiến chất lượng sản phẩm rượu thành phẩm; từ đó mới có thể sản xuất ra sản phẩm đạt chất lượng và an toàn cho người tiêu dùng, mở rộng được quy mô sản xuất, góp phần tích cực cải thiện thu nhập và nâng cao đời sống cho phần đông người lao động địa phương. Một số nghiên cứu khoa học gần đây đã xác định hệ vi sinh vật trong men rượu giữ vai trò khá quan trọng trong quá trình sản xuất rượu, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc sử dụng nguồn giống vi sinh vật thuần chủng và có hoạt tính cao trong quá trình lên men rượu là rất cần thiết. Song song đó, việc bổ sung chế phẩm enzyme có nguồn gốc từ thiên nhiên để thay thế một phần vai trò của nấm mốc trong viên men đã bước đầu cho kết quả khả quan trong việc ổn định năng suất Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 1 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ rượu thành phẩm và rút ngắn thời gian sản xuất. Điển hình là các viên men rượu đang sử dụng trên thị trường hiện nay: nấm men Saccharomyces và bổ sung chế phẩm chứa hệ enzyme amylase. Như vậy, vấn đề chính hiện nay là “nguồn giống vi sinh vật thuần chủng, có hoạt tính cao” và “hiệu quả của hệ enzyme thay thế” do đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men và hệ enzyme amylase trong mầm lúa” Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chính của đề tài là khảo sát thành phần nguồn men thị trường và bước đầu nghiên cứu sản xuất bột men gồm nấm men và enzyme. Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài tiến hành thông qua các bước sau:  Thu thập và đánh giá các loại men dùng trên thị trường.  Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men trong các loại men trên.  So sánh các dòng men đã phân lập được với dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Viện NC&PT CNSH, chọn ra dòng nấm men tốt nhất.  Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase trong quá trình lên mầm lúa.  Nghiên cứu quy trình sản xuất bột men bằng cách kết hợp sử dụng dòng nấm men có hoạt tính cao và hệ enzyme amylase trong mầm lúa.  Bước đầu khảo sát khả năng lên men rượu của bột men thành phẩm. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Hệ vi sinh vật trong men làm rượu 2.1.1. Hệ vi sinh vật trong men rượu cổ truyền Hệ vi sinh vật trong bánh men bao gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Chúng được giữ trong bột gạo ở trạng thái khô của bánh men. Lúc này vi sinh vật tồn tại ở trạng thái nghỉ, các hoạt động sinh lý giảm thiểu. Chúng chỉ hoạt động mạnh khi được cấy vào nguyên liệu để thực hiện lên men. Nấm mốc thường có mặt trong bánh men chủ yếu là các chủng Rhizopus, Mucor, Aspergillus và Amylomyces. Chúng giữ vai trò đường hóa. Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có khả năng chịu nhiệt cao (32-35oC), chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Nấm men gồm hai chi khác nhau là Endomycopsis và Saccharomyces. Các loài chủ yếu gồm có như Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase, do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa; và S. cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, raffinose, galactose,… Chúng có khả năng lên men được ở nhiệt độ cao (khoảng 36-40 oC) và có khả năng chịu được độ acid. Đặc biệt có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02-0,025% và có khả năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12-14% có khi 16-18%. Nồng độ rượu trong dung dịch lên men là 10-12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28-32oC. Ngoài hai chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấm men dại khác nhau. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này còn rất thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao có khi lên tới 60-65oC và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05-1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998). 2.1.2. Hệ vi sinh vật trong men rượu thị trường Các loài nấm men là những vi sinh vật chiếm đa phần trong viên men rượu thị trường. Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Chúng gồm hai chi khác nhau: - Saccharomyces (chủ yếu là S. cerevisiae). Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 3 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ - Endomycopsis (chủ yếu là Endo. fibulligenes). Endomycopsis fibulligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase và glucoamylase. Trong quá trình lên men rượu ngoài ethanol, CO2, các sản phẩm khác cũng được tạo ra như glycerol, este, acid hữu cơ, andehyde,… Sự hiện diện của các sản phẩm này phụ thuộc vào dòng nấm men và điều kiện lên men. Chúng góp phần quan trọng trong việc tạo nên hương vị đặc trưng cho rượu. Để sản phẩm lên men có mùi vị đặc trưng, cần thiết phải chọn lọc các dòng nấm men thích hợp cho từng sản phẩm. Việc chọn lọc các dòng nấm men thường dựa vào hai yếu tố: - Tốc độ lên men: để so sánh khả năng lên men của các dòng nấm men, phương pháp thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm là phương pháp chai Durham. Phương pháp này so sánh cường độ lên men dựa vào khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu. Trong cùng thời điểm lượng CO2 sinh ra nhiều hơn chứng tỏ cường độ lên men mạnh hơn. - Khả năng chịu được nồng độ cồn cao trong môi trường lên men: để so sánh tính chịu đựng độ cồn cao của các dòng men, có thể sử dụng phương pháp cho lên men trong dung dịch đường có nồng độ cồn cao, khoảng 15-30% (w/v), hoặc có thể sử dụng phương pháp lên men liên tục bằng cách bổ sung glucose vào trong quá trình lên men từ từ, liên tục đến một thời điểm nào đó khi không thấy dấu hiệu lên men xảy ra nữa. Khi kết thúc quá trình lên men, dòng nấm men nào cho nồng độ cồn cao hơn chứng tỏ dòng nấm men đó có tính chịu đựng độ cồn cao hơn. Khả năng chịu đựng độ cồn của đa số các dòng men trong sản xuất rượu bia vào khoảng 5-10 độ cồn (Casey et al., 1986). 2.2. Quá trình đường hóa và quá trình lên men rượu 2.2.1. Quá trình đường hóa Quá trình đường hóa là một quá trình biến đổi hóa học, chuyển tinh bột thành đường lên men. Sản phẩm thu được gọi là dịch đường hóa. Đường hóa có nhiều phương pháp, tuy nhiên dù là phương pháp nào thì việc dùng nguồn enzyme sẵn có trong nguyên liệu hay sản sinh từ vi sinh vật là một việc hết sức quan trọng. Hệ enzyme thủy phân tinh bột thành đường gọi là hệ enzyme amylase. Hệ enzyme này tồn tại trong nước bọt, dịch tiêu hóa, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men,… Có nhiều loại enzyme amylase: α-amylase, β-amylase,… và một số mới tìm ra có nguồn gốc từ vi sinh vật như: pullutanase, isoamylase,… Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 4 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Nấm men hấp thu tốt các loại đường như: D-glucose, fructose, surcrose, maltose,… Sự biến dưỡng các chất đường này được thực hiện bởi quá trình đường phân, tiếp theo bởi chu trình Krebs trong điều kiện hiếu khí. Trong điều kiện khác, sự biến dưỡng được thực hiện qua lộ trình Pentose-photphat và lộ trình Entner-Doudorff, tiếp theo bởi sự hô hấp hiếu khí hoặc sự lên men yếm khí (Nout et al., 1999). Trong điều kiện có oxy thì pyruvate bị oxy hoá cho ra CO2 và ATP để nấm men phát triển sinh khối. Trong điều kiện không có oxy thì pyruvate sẽ bị mất CO2 và tạo thành acetaldehyde CH3COCOOH CH3CH=O + CO2 Sau đó acetaldehyde được khử thành ethanol do enzyme alcoldehydrogenase xúc tác CH3CH=O + NADH + H+ CH3-CH2-OH +NAD+ Tuỳ theo điều kiện của môi trường mà sự lên men có thể theo các kiểu: - Kiểu lên men bình thường: xảy ra khi pH = 4-5, sản phẩm của kiểu lên men này là: C6H12O6 + 2(P) + 2ADP C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O - Kiểu lên men rượu trong môi trường kiềm, sản phẩm của kiểu lên men này là: C6H12O6 + H2O 2CH2-CH2-CH(OH)3 + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Lộ trình đường phân được trình bày ở Hình 1. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 5 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Glucose Hexokinase ATP ADP Glucose 6-phosphate Phosphoglucose isomerase Fructose 6-phosphate Phosphofrutose Kinase ATP ADP Fructose 1,6-bisphosphate Aldolase Dihydroxyacetone Phosphate Glyceraldehyde 3-phosphate Glyceraldehyde 3-photphat dehyrogenase NAD+ + Pi NADH + H+ 1,3 Bisphosphoglycerate Phosphoglycerate Kinase ADP ATP 3-Phosphoglycerate Photphoglycer multase 2-Phosphoglycerate Enolase Phosphoenolpyruvate Pyruvate Kinase ADP ATP Pyruvate Hình 1: Lộ trình đường phân (Stryer, 1988) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 6 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.2. Quá trình lên men rượu Quá trình lên men rượu là quá trình lên men yếm khí của nấm men, chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2. Phương trình tổng quát: C6H12O6 C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O Người ta thường chia quá trình lên men rượu thành 2 thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2, tế bào nấm men gia tăng kích thước và khối lượng. -Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: đường và các chất dinh dưỡng được hấp thu qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào trong. Ở đó các enzyme sẽ tác động qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và CO2 (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men trong quá trình lên men rượu a. Ảnh hưởng của nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với dòng ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 35 oC và nhiệt độ thích hợp cho sự lên men là 40 oC. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28-32 oC. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Nếu làm lạnh dịch đường từ 20-22oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8-10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng lên 2830oC. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30 oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. b. Ảnh hưởng của pH Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcol etylic là 4,5-5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8-5,2 nhằm kết hợp giữ Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 7 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ cho amylase tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men. c. Ảnh hưởng của nồng độ rượu Quá trình nuôi cấy nấm men chủ yếu là tạo điều kiện cho nấm men phát triển sinh khối, đạt số lượng theo yêu cầu. Song nấm men cũng thực hiện một số quá trình lên men rượu đáng kể. Thường trong dịch nấm men có khoảng 4-6% rượu. Nồng độ rượu sinh ra ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu còn ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển riêng của nấm men phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng tế bào nấm men cho vào môi trường bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% đã có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4-6% đã có ảnh hưởng xấu (Nguyễn Công Hà, 2000). Mặc dù ethanol là sản phẩm chính của sự lên men rượu từ đường, nhưng ở một nồng độ nào đó thì ethanol sẽ ức chế quá trình lên men (Casey et al., 1986) vì: - Ethanol làm thay đổi cấu trúc của màng nguyên sinh chất. Ethanol làm yếu cấu trúc mạng lưới của phân tử nước, từ đó làm giảm độ bền của tương tác kỵ nước và khoảng cách của tương tác Van der Walls ở bên trong màng. Ngoài ra, ethanol làm thay đổi thành phần cấu tạo màng. Sự thay đổi này bao gồm: sự gia tăng tỷ lệ của acid béo C18:1 với sự giảm tương ứng của C16:0, giảm một lượng lớn phosphatidylethanolamine dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ của acidic phospholipids (phosphatidylglycerol và cardiolipin). Nếu trong môi trường nuôi cấy có bổ sung acid béo không bão hoà và sterol thì sẽ làm tăng khả năng chịu đựng độ cồn cho nấm men (Tony D,amore et al., 1990). - Màng nguyên sinh chất là màng rất thấm có thể cho ethanol đi vào và ra khỏi tế bào, nên khi nấm men thải ethanol ra môi trường bên ngoài thì làm cho nồng độ cơ chất cao dẫn đến ức chế sự phát triển và khả năng lên men của nấm men. - Ethanol sẽ ức chế và làm biến tính enzyme glycolitic, ức chế glucose, maltose, amonium và sự vận chuyển amino acid (Navarro et al., 1982). - Trong quá trình lên men còn có các sản phẩm phụ như: acid hữu cơ, aldehyde, acid octanoic và acid decanoic. Các sản phẩm phụ này sẽ kết hợp với ethanol do nấm Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 8 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ men sản xuất, kết quả là ức chế sự phát triển của tế bào nấm men (Tony D,amore et al., 1990). d. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác, đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại, nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men, mặt khác sẽ tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải. Trong sản xuất rượu nếp than thì nấm men S. cerevisiae sẽ tiêu thụ và biến đổi hoàn toàn lượng đường khử ban đầu có nồng độ 20% (w/v) và sản xuất ra ethanol có nồng độ 8% (w/v). Khi bổ sung glucose vào dung dịch đường trong quá trình lên men thì nồng độ ethanol đạt rất cao là 14% nhưng ở nồng độ này thì nấm men S. cerevisiae không phát triển (Dung et al., 2005). Ngoài các nhân tố trên còn có các nhân tố khác ảnh hưởng đến quá trình lên men như: thời gian lên men, nhiệt độ ủ và nồng độ giống chủng. 2.3. Quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống Nấu chín Gạo nguyên liệu được ngâm nhằm rửa sạch chất bẩn bám bên ngoài hạt, đồng thời làm cho hạt gạo mềm, trương nở giúp dễ dàng cho quá trình nấu. Sau khi để ráo, gạo được cho vào nồi, thêm nước và nấu chín. Lượng nước cho vào được tính toán sao cho cơm sau khi nấu không quá nhão cũng không bị sống. Tỷ lệ gạo nước khoảng 1:1 theo thể tích. Mục đích của việc làm chín hạt gạo nhằm hồ hóa tinh bột gạo giúp cho vi sinh vật dễ sử dụng tinh bột này để lên men rượu. Làm nguội Cơm sau khi nấu chín được trãi đều trên một bề mặt phẳng để làm nguội xuống nhiệt độ thích hợp cho việc trộn bánh men rượu. Nhiệt độ cơm cao sẽ làm bánh men rất khó hoạt động. Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp cơm với tỷ lệ thích hợp tùy theo hướng dẫn trên từng loại men. Sau đó cho tất cả vào khạp lớn, đậy nắp để bắt đầu quá trình lên men rượu. Lên men Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 9 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Lên men rượu là một quá trình lên men yếm khí (không có mặt của oxy) diễn ra rất phức tạp, bao gồm các quá trình sinh hóa học và các quá trình vi sinh vật. Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ thường, trong thời gian này có 3 quá trình diễn ra song song với những mức độ khác nhau. Trước tiên là quá trình tăng sinh khối nấm men. Quá trình đường hóa có sự phân cắt tinh bột thành đường nhờ men amylase và glucoamylase trong nấm mốc. Đường vừa tạo ra trở thành thức ăn để nấm men thực hiện quá trình lên men rượu. Quá trình lên men rượu diễn ra do nấm men sử dụng đường để tạo thành rượu etylic và CO2. CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ tạo thành bọt khí bám vào bề mặt nấm men và làm các tế bào nấm men nổi lên trên, khi lên đến bề mặt, bọt khí vỡ ra và tế bào nấm men lại chìm xuống tạo ra sự đảo trộn giúp quá trình lên men được tốt hơn. Sau 2 ngày đầu lên men, có thể bổ sung nước vào khối lên men với tỷ lệ nước : cơm khoảng 3:1, sau đó đậy nắp và tiếp tục lên men thêm khoảng 3 ngày nữa. Chưng cất Khi quá trình lên men kết thúc, ta tiến hành chưng cất để thu được rượu thành phẩm. Quá trình chưng cất rượu nhằm tách hỗn hợp rượu và nước có nhiệt độ sôi khác nhau. Ở áp suất thường, rượu sôi và bốc hơi ở 78 oC, còn nước là 100 oC. Khi chưng cất rượu được tách ra khỏi nước nhờ bay hơi dễ hơn nước. Quá trình chưng cất được tiến hành bằng cách đun sôi hỗn hợp lên men, hơi bay lên được dẫn qua ống dẫn và được làm lạnh bằng cách cho qua bồn nước để ngưng tụ rượu. Dung dịch rượu thu được trong suốt có mùi thơm đặc trưng và nồng độ rượu sẽ giảm dần theo thời gian chưng cất. Tùy theo yêu cầu của khách hàng mà ta có thể tiến hành pha trộn các loại rượu thu được ở các khoảng thời gian chưng cất khác nhau để tạo ra rượu có nồng độ cao thấp khác nhau. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 10 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 2.4. Quy trình sản xuất men rượu 2.4.1. Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền Quy trình sản xuất men rượu thuốc bắc cổ truyền Gạo tốt Ngâm nước Men giống Thuốc bắc Nghiền mịn Nghiền mịn Để ráo nước Nghiền thành bột Trộn đều Nước (Độ ẩm 55-60%) Làm thành viên Xếp ra nong có lớp trấu mỏng ở trên và dưới các bánh men Ủ ở nhiệt độ phòng (28-30oC) trong 2 ngày Men rượu Hình 2: Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền (Dung, 2004) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 11 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ - Quy trình sản xuất men rượu đế thuần Tiểu hồi, Đinh Hương Trích ly trong nước cất vô trùng Lọc trên giấy lọc và màng Trộn dịch trích thảo mộc mỗi loại với lượng như nhau Hỗn hợp dịch trích thảo mộc vô trùng Bột gạo và bột khoai mì (bột sắn) Nung nóng qua đêm ở 100oC trong lò điện (17giờ) Làm nguội đến 35 - 40oC Nấm mốc A. rouxii nấm men S. cerevisiae Ủ A. rouxii và S. cerevisiae trong môi trường thạch nghiêng ở 30oC Thêm nước muối 0,85%NaCl lọc vô trùng vào môi trường thạch nghiêng lấy sinh khối nấm mốc và nấm men Thêm nước vô trùng Trộn đều Hàm ẩm bột nhào 40% (w/w) Huyền phù nấm mốc Huyền phù nấm men Ủ ở 30oC trong 24 giờ Sấy khô hạt trên khay đục lỗ Men giống thuần Đóng gói, tồn trữ Hình 3. Quy trình tổng quát sản xuất men rượu đế thuần (Dung et al., 2005) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 12