Tài liệu Luận văn thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Tâm MSSV: 1051110142 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quả, số liệu trong đồ án là hoàn toàn trung thực, chưa từng có ai công bố. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em bao năm qua, trang bị cho em những kiến thức quý giá và tạo dựng cho em nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương, Cô đã luôn bên cạnh giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện và cung cấp hóa chất để em có thể thực hiện được các thí nghiệm. Và cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn ở bên em động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua. Kiến thức còn nhiều hạn chế, chắc chắn sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất mong được sự thông cảm và góp ý chân thành của thầy cô và các bạn. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. vi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 Mục đích của để tài ...................................................................................... 3 Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài ...................................................................... 3 Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3 Phƣơng pháp xử lí số liệu ............................................................................. 3 Các kết quả đạt đƣợc của đề tài .................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học ............................................... 5 2.1.1. Khái niệm và phân loại ....................................................................... 5 2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu............................................ 6 2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu ................................................ 7 2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn và tuyến trùng EPN .......................................... 9 2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn ............................................................................................................. 10 2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố diệt côn trùng ........................... 11 2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens ............................................................... 12 2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens ............................................... 12 2.3.2. Phân loại Serratia marcescens............................................................ 13 2.3.3. Đặc điểm sinh lí .................................................................................. 13 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa............................................................................... 14 2.3.5. Đặc điểm phân bố ............................................................................... 17 2.3.6. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ........................................ 19 2.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................ 20 2.4.1. Sắc tố .................................................................................................... 20 2.4.2. Enzyme ................................................................................................ 21 2.4.3. Biosurfactants ...................................................................................... 22 2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ................................................ 23 2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối ......................... 25 2.6.1. Quá trình lên men.............................................................................. 25 2.6.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và điều kiện lên men ............................ 27 i Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng .................................. 29 2.6.2.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men ........................................... 30 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 32 3.2. Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu ................................... 32 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 32 3.2.2. Môi trƣờng ........................................................................................... 32 3.2.3. Hóa chất................................................................................................ 32 3.2.4. Dụng cụ ................................................................................................ 33 3.2.5. Thiết bị ................................................................................................. 33 3.3. Phƣơng pháp luận ......................................................................................... 34 3.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 34 3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 ............................................................................................................... 38 3.5.1. Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý .............................................. 38 3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E .............................................................................................................. 39 3.5.3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme.............................................................. 42 3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 ............................................................................................................... 42 3.6.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng cơ bản Nutrient broth ..................................................................................................... 43 3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen SH1 .............................................................................................................. 44 3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia marcescens SH1 ............................................................................................................... 45 3.7. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ................... 46 3.7.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescensSH1 ....................................................................................................... 47 3.7.2. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .................................................................................. 47 3.7.3. Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .................................................................................. 47 ii Đồ án tốt nghiệp 3.7.4. 3.7.5. Khảo sát ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .................................................................................. 48 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy mới ................................................. 49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN 4.1. Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm hóa sinh ..................... 50 4.1.1. Quan sát hình thái, sinh lý .................................................................... 50 4.1.2. Kết quả hóa sinh với bộ Kit API 20E .................................................. 51 4.1.3. Kết quả thử nghiệm enzyme ................................................................ 53 4.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S. marcescens SH1......................... 56 4.2.1. Đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng Nutrient broth .................... 56 4.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn Nito lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .............................................................................................................. 57 4.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ....................................................................................................... 58 4.3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ........................... 59 4.3.1. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .............. 59 4.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện Oxy sự phát triển của S. marcescens SH1 .............................................................................................................. 61 4.3.3. Ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ................................................................................... 62 4.3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ................................................................................... 63 4.3.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng mới và điều kiện nuôi cấy mới ................................................. 65 CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. 5.2. Kết quả ............................................................................................................... 69 Kiến nghị ............................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 70 PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................... 15 Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia ............................................................ 16 Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau............. 18 Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau....................................................................................................................... 18 Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh S. marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E................ 40 Bảng 3.2. Hàm lƣợng % nitơ tổng của các nguồn nitơ ................................................. 44 Bảng 3.3. Thành phần môi trƣờng và các nguồn nitơ khảo sát..................................... 44 Bảng 3.4. Thành phần môi trƣờng và các nguồn cacbon khảo sát................................ 45 Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát ................................................................. 48 Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng S. marcescens SH1 ........... 52 Bảng 4.2. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ ..................................... 57 Bảng 4.3. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn Cacbon................................ 59 Bảng 4.4. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH........................................................... 60 Bảng 4.5. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc ............................................... 61 Bảng 4.6. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống .............................................. 63 Bảng 4.7. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trƣờng nuôi cấy ....... 64 Bảng 4.8. Các thông số động học nuôi cấy S. marcescens SH1 trên 2 môi trƣờng ...... 66 Bảng 4.9. Tính toán giá thành của 2 môi trƣờng .......................................................... 67 Bảng 4.10. Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trƣờng .............................................. 67 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi ......................................................... .13 Hình 2.2. Khuẩn lạc của S.marcescens trên môi trƣờng XLD ..................................... 17 Hình 2.3. Khuẩn lạc của S. marcescens trên NA .......................................................... 17 Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối .................................................. 24 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S. marcescens SH1 ............................................................................................................ 35 Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần cho môi trƣờng tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1 ............................................................... 36 Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy ............................ 37 Hình 4.1. Khuẩn lạc của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng NA ............................... 50 Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram .................................................................................... 51 Hình 4.3. Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E ......................................................... 52 Hình 4.4. Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20 ................................... 54 Hình 4.5. Thử nghiệm hoạt tính protease ...................................................................... 54 Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin ............................................................................. 55 Hình 4.7. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcesces SH1 trên môi trƣờng NB .......... 56 Hình 4.8. Ảnh hƣởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ... ....................................................................................................................................... 57 Hình 4.9. Ảnh hƣởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens SH1................................................................................................................................58 Hình 4.10. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ..................... 60 Hình 4.11. Ảnh hƣởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ................... 61 Hình 4.12. Ảnh hƣởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ....................................................................................................................................... 62 Hình 4.13. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của S. marcescens SH1 ........................................................................................................ 64 v Đồ án tốt nghiệp Hình 4.14. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 môi trƣờng NB và môi trƣờng mới ..................................................................................................................... 65 vi Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày. Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật thì việc ứng dụng nó trong sản xuất và đời sống ngày càng rộng rãi và có hiệu quả hơn. Ví dụ như việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh. Sử dụng vi sinh vật trong việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại môi trường, làm cân bằng sinh thái. Trong tự nhiên, ngoài những vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật gây hại, ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho con người, động vật và thực vật, các loài gây ô nhiễm nước, thực phẩm. Nhưng nếu ta nắm vững được các mặt lợi hay hại của nó, ta sẽ đưa ra được các biện pháp khoa học để phát huy những mặt lợi và hạn chế những mặt hại do chúng gây ra. Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học như khả năng diệt sâu, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất thứ cấp do nó sinh ra… Ngày nay để tăng năng suất và sản lượng trong trồng trọt thì người dân thường sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng này chỉ đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên cạnh đó, những sản phẩm này làm cho đất đai ngày càng bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều loài thiên địch có lợi cho cây trồng, mất cân bằng sinh thái trong đất và một số vi sinh vật trong đất có thể bị tiêu diệt. Các thuốc trừ sâu hóa học này tồn dư rất lâu, chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư và tích đọng lại, ngấm sâu vào trong lòng đất và nước sẽ gây hại không những cho động vật, cây trồng mà cả con người sống sống gần đó. Nếu con người hoăc các loài động vật ăn những loại 1 Đồ án tốt nghiệp cây trồng còn tồn đọng một lượng không nhỏ thuốc trừ sâu hóa học thì lâu dần sẽ ảnh hưởng rất tai hại đến sức khỏe của chính họ. Các ngành hoá học và công nghiệp hoá chất không ngừng phát triển và ngày càng sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại cây trồng. Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn. Sau đó, liều lượng do con người pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng. Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác. Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh học. Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) trong môi trường đất nói riêng và trong môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài. Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển vọng to lớn đối với nền nông nghiệp. Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; 2 Đồ án tốt nghiệp Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng như các sản phẩm trao đổi chất của Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia marcescens SH1”. Mục đích của đề tài 1.2. Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để thu sinh khối cực đại. Nội dung của đề tài 1.3. - Định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme của chủng SH1. - Khảo sát các nguồn cacbon và nitơ phù hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1 - Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1. Phƣơng pháp xử lí số liệu 1.4. - Sử dụng phần mềm excel để tính toán và biểu diễn đồ thị - Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu Các kết quả đạt đƣợc của đề tài 1.5. - Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1. - Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1. 1.6. Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm có 5 chương:  Chương 1: Mở đầu  Chương 2: Tổng quan  Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3 Đồ án tốt nghiệp  Chương 4: Kết quả và thảo luận  Chương 5: Kết luận và đề nghị 4 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học 2.1.1. Khái niệm và phân loại Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra, các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là: - Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus. - Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật. Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học. Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn 5 Đồ án tốt nghiệp có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật sinh học. 2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh. Sau khi vào đất, tuyến trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng. Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở và hậu môn côn trùng. Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào hệ tuần hoàn. Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho côn trùng trong 1-2 ngày. Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang, còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh. Vì thế, tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu hơn. Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng. Bao gồm 2 giống là Steinernema và Heterorhabditis. Bình thường thì EPN sống tự do trong đất và mang theo vi khuẩn cộng sinh. Khi tìm được vật chủ (sâu hại), tuyến trùng sẽ thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ và giải phóng vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24 - 48 giờ. Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Hiện đã có 17 loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema và 7 loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc bộ Rhabditida có khả năng này. Sau khi xâm nhập, chúng có khả năng gây bệnh và làm chết vật chủ trong 48 giờ. Các EPN có khả năng ký sinh trên 200 loài côn trùng thí nghiệm (có một phần đời sống trong đất) . 6 Đồ án tốt nghiệp 2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu Côn trùng chết trong tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, trong đó hầu hết là chết do vi sinh vật mà vi khuẩn là loài vi sinh vật chiếm đa số. Do đó, trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có tác dụng không nhỏ trong việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu hại. Trong đó một số quần thể vi khuẩn đã được sản xuất thành chế phẩm dùng để phòng trừ sâu hại rừng. Người ta đã phát hiện hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với côn trùng, trong đó có 90 loài gây bệnh cho côn trùng. Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn gây bệnh không phải đều có thể tạo thành chế phẩm trừ sâu và cần có một số tính chất cơ bản về độ độc, tính ổn định, khả năng lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, có thể sản xuất hàng loạt, kinh tế và an toàn.  Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại - Clostridium brevifaciens - Clostridium malacosomae - Bacillus cereus - Bacillus thuringienis - Bacillus papillae.  Một số loài vi khuẩn không sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại - Serratia marcescens Giới thiệu về chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ vi khuẩn Bacillus thuringienis (Bt) Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 và trừ côn trùng năm 1915. Đến 1971, đã có hơn 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác nhau gây hại cho 400 loài côn trùng. Sản phẩm Bt diệt côn trùng có trên thị trường từ đầu những năm 60 của thế kỷ 20. Bt là nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương, bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi. Vi khuẩn di chuyển nhờ roi dài 6 - 8µ. Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ. 7 Đồ án tốt nghiệp Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que. Hầu hết các chủng Bt trong thời gian hình thành bào tử, đều sản sinh ra tinh thể độc delta-endotoxin ( tiền độc tố) và độc tố này được hoạt hoá trong ruột giữa do các men phân giải protein. Ngoài ra, delta-endotoxin còn gây rối màng biểu mô ruột giữa, làm mất cân bằng tính thấm của tế bào, côn trùng bị liệt và chết. Delta-endotoxin còn tương tác với các liposome của màng tế bào biểu mô, làm tăng sự rối loạn màng biểu mô ruột giữa. Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non cánh phấn Lepidoptera và một số loài của Diptera và Coleoptera. Các thuốc thương phẩm của Bacillus thuringiensis đều chứa bào tử và delta-endotoxin có hiệu lực trừ nhiều loài dịch hại trong nông và lâm nghiệp. Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, các protein kết tinh và tạo bào tử ra trong quá trình bào tử nảy mầm. Khi vào bụng côn trùng, vi khuẩn thể hiện hoạt tính trừ sâu với sâu non và trưởng thành bộ cánh vảy Lepidoptera và một số loài thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Trong cơ thể côn trùng, tinh thể protein bị hoà tan và men protease trong ruột côn trùng biến tinh thể độc(tiền độc tố) thành 4 chất độc nhỏ hơn. Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào ruột giữa côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo các amino axit. Quá trình này phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali. Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào. Tính thấm nước tăng, tế bào bị phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa. Tính chọn lọc đặc trưng của các chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các chất nhận. Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt. Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông hơi và nội hấp. Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng ăn và tử vong. 8 Đồ án tốt nghiệp 2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được gọi là “roundworms”. EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con người, cây trồng và vật nuôi. EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được gọi là “nội ký sinh”. Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng, ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa. Tiêu biểu là hai họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966). Cả 2 họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết cho ký chủ. Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis tương ứng thuộc chi Xenorhabdus và Photorhabdus (Boemare và cộng sự, 1997). Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ. Vi khuẩn sẽ phân hủy ký chủ tạo ra thức ăn cho tuyến trùng và sản xuất các kháng sinh chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật khác. Các kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh sản xuất như xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens và antraquinons (Li và cộng sự, 1998; Fodor và cộng sự, 2010). Mặc dù mối quan hệ rất cụ thể và phụ thuộc lẫn nhau giữa tuyến trùng EPN và vi khuẩn cộng sinh của nó nhưng một số vi khuẩn phụ thuộc đã được báo cáo có liên quan đến tuyến trùng và ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN. Poinar (1966) đã phân lập được Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây nhiễm bởi S.(Neoplectana) carpocapsae và cũng tìm thấy trong đó Alcaligenes 9 Đồ án tốt nghiệp sp., Aerobacter sp., Proteus sp. và Pseudomonas aeruginosa. Thêm Alcaligenes dorans, Pseudomonas fluorescens, P. maltophilia, P. alcaligenes và Acinetobacter sp. cũng được phân lập từ loài tuyến trùng này (Lysenko và Weiser, 1974). Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P. fluorescens Biovar B và Xanthomonas maltophilia đã được tìm thấy liên quan đến S. scapterisci (Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993). Ngoài ra, với chi Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O. Intermedium (Babic và cộng sự, 2000). Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S. liquefaciens, cũng được phát hiện liên quan đến Steinernema spp. và Heterorhabditis spp. (Boemare và cộng sự, 1997). Ngoài S. proteomaculans thì S. marcescens cũng được tìm thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được vận chuyển hoặc mức độ liên kết giữa tuyến trùng và vi khuẩn. Trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau: - Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 - 48 giờ. Như vậy, thời gian chết của côn trùng vật chủ khác nhau còn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn 10 Đồ án tốt nghiệp thuộc và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48 giờ. - Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trông xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó mà IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2, tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hóa xác chết con trùng. Nhờ các enzyme do vi khuẩn tiết ra mà các mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ đó thế hệ thứ 2 của tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối các thế hệ tiếp theo. Thông thường trong cơ thể công trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng. - Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng. Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng. 2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm. Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. và Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với huyết cầu (haemocytes) của côn trùng. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X. enorhabdus nhân nhanh số lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh trong P. Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X. Nematiphilus bằng cách tiêm các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng. 11