Tài liệu Luận văn thạc sĩ Ứng dụng phương pháp MABC (Marker-Assisted Backcrossing) nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Lưu Minh Cúc, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam” của Viện Di truyền Nông nghiệp, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua. Học viên Trần Long MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam..................................................................................................................... 3 1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới ..........3 1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam .....4 1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam ...................................................................5 1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa ..................................... 8 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa ...............................................................8 1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn ..........................................................10 1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn ...................................10 1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn .....................................11 1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn ................................................................11 1.3. Chỉ thị phân tử .................................................................................................12 1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử ...............................................................12 1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng .............................................................13 1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) ....................................13 1.3.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… ..........................................................................14 1.3.2.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại ................................15 1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử..............................................................17 1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................17 1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền ....................................................................17 1.4.3. Trong chọn giống cây trồng ..........................................................................18 1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC) ...............................................................20 1.5. Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn .......................................22 1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới.....22 1.5.2. Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn .. 25 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................27 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................27 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................27 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................28 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số..........................................................28 2.3.1.2. Phương pháp PCR với mồi SSR ...................................................................28 2.3.1.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% ...............................................29 2.3.1.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide .............................................30 2.3.2. Phương pháp lai nhân tạo .............................................................................31 2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn ...................................................................................................................32 2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo ..........................................................33 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................36 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................37 3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số ..............................................................37 3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ..........................................................38 3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC ...................................41 3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) ..........................................................................................41 3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) ................................................................................44 3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) ...................................................................45 3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc .....................................47 3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn ............................................................................................50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms APS Ammonium Persulfate BC Backcross BĐKH Biến đổi khí hậu CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence cM centiMorgan CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long ĐBSH Đồng bằng Sông Hồng dNTP Deoxynucleotide Triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization GDP Gross Domestic Product GGT Graphical Genotyper IRRI International Rice Research Institute LD-MAS Linkage Disequilibrium - MAS MABC Marker-assisted backcrossing MAS Marker-assisted selection NST Nhiễm Sắc Thể PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse Ribonuclease SSR Simple Sequence Repeat STR Short Tandem Repeats STS Sequence-Tagged Sites TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 ................4 Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) ............................6 Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 ..............................................20 Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR ..............28 Bảng 5. Chương trình chạy của phản ứng PCR ......................................................29 Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) .34 Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) .................................35 Bảng 8.. Tỷ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp thế hệ BC1F1 .........................43 Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI, 1997 ...........................................................................................................................50 Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội ..............................................................................................................................51 Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội ........................................................................................52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay ........................................................................................ 7 Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m ..................................................................................... 7 Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) ....................................................................................... 36 Hình 4: Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose .................. 37 Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1................................ 38 Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6%................ 39 Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5%............. 39 Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478 ............................................................................................. 40 Hình 9. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206 ............... 41 Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793 .......... 41 Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310 .............. 42 Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639 ............ 42 Hình 13. Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10 ......43 Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 .................................................................................................................... 44 Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM10793, và RM10711 .......................................................................................... 44 Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 và RM10694 ....................................... 45 Hình 17: Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0 ..................................................................................................................... 46 Hình 18. Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn ....................................... 47 Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) .......................................................................................................... 48 Hình 20. Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00) ............................................................................................................. 49 MỞ ĐẦU Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á. Mỗi năm toàn thế giới cung cấp khoảng 729 triệu tấn gạo, trong đó chỉ tính riêng khu vực Châu Á là 661 triệu tấn [15]. Biến đổi khí hậu toàn cầu là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực thế giới. Với hơn 3000km bờ biển, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển. Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha [1] và năm 2013, chỉ tính riêng trên đồng bằng song Cửu Long là khoảng 740.000 ha. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng tạo ra 40% GDP nông nghiệp của cả nước. So với cả nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70%. Tuy nhiên, Đồng bằng sông Cửu Long lại được xem là vùng sẽ phải chịu tác động của biến đổi khí hậu nhiều nhất và những tác động này sẽ ảnh hưởng rất lớn đến an ninh lương thực. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012, nếu mực nước biển dâng 1m, sẽ có khoảng 39% diện tích đồng bằng sông Cửu Long, trên 10% diện tích vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, trên 2,5% diện tích thuộc các tỉnh ven biển miền Trung và trên 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy cơ bị ngập; gần 35% dân số thuộc các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, trên 9% dân số vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, gần 9% dân số các tỉnh ven biển miền Trung và khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; trên 4% hệ thống đường sắt, trên 9% hệ thống quốc lộ và khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ của Việt Nam sẽ bị ảnh hưởng [2]. Để giải quyết những khó khăn này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn”. 1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định trước trong giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 đang được trồng phổ biến tại Việt Nam để tạo ra dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu về giống chịu mặn trong sản xuất lúa gạo. 2 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí hậu toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm. Nguyên nhân của những biến đổi này là do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời, và gần đây có thêm hoạt động tác động của con người. Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của một khu vực mà là vấn đề toàn cầu. Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới. Nhiệt độ tăng, mực nước biển dâng cao, sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế xã hội trong tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009). Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng quan trọng. Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ... Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước biển dâng cao, cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao. Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau [15]. Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực thế giới. Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước sẽ bị ngập, 10.000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn, 21,5 triệu ha đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, và ước tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng giữa thế kỷ 21 [28]. Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km2 đất nông nghiệp bị ngập và nhiễm mặn. Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập, ảnh 3 hưởng đến 11% dân số. Theo ước tính của Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi năm nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4 triệu tấn thóc do lũ lụt, do nhiều giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy một tuần. Còn ở Maldives hơn 80% diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có thể bị ngập, mặn khi nước biển dâng cao [39]. 1.1.2. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước biển dâng. Nước biển dâng thì phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị ngập mặn. Theo đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng cao và sự thay đổi lượng mưa làm thay đổi thủy văn ở các vùng đồng bằng. Do chúng ta có bờ biển dài hơn 3.620 km, 28 tỉnh, thành phố giáp biển nên mực nước biển dâng cao sẽ làm giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển. Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 (Đơn vị tính: cm) Kịch bản nƣớc biển dâng 2020 Thấp (B1) 8-9 11-13 16-18 28-21 27-33 33-40 39-48 44-56 49-64 Trung bình (B2) 8-9 12-13 17-19 23-26 29-34 36-43 43-52 50-62 57-73 Cao (A1F1) 8-9 13-14 18-20 25-29 34-40 44-52 55-65 66-80 78-95 Các mốc thời gian của thế kỷ 21 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 (Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam)- nguồn Bộ Tài nguyên Môi trường - 2012. Các nhà khoa học chỉ ra rằng, khi nước biển dâng, tùy mức độ sẽ có những phần diện tích canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Đồng bằng Sông Hồng, các đồng bằng duyên hải khác bị ngập mặn. Theo kịch bản A1FI, lũ sẽ gây ngập 90% diện tích trong 4,5 – 5 tháng/năm, vào mùa kiệt nước mặn (nồng độ muối 4%) xâm nhập trên 70% diện tích…Đây lại là những vựa lúa của cả nước nên khi đó chắc chắn an ninh lương thực bị đe dọa. Việt Nam là một trong những nước bị ảnh hưởng 4 nghiêm trọng nhất bởi mực nước biển dâng, dẫn đến sự xâm nhiễm mặn ngày càng gia tăng, chủ yếu là Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng Sông Cửu Long. Mặn là hiện tượng liên kết với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền, biến nhiều vùng đất trồng lúa bị mặn hóa [3]. 1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na+ hấp phụ trên bề mặt keo đất và trong dung dịch đất [1;2]. Đất chứa nhiều Na+ dưới dạng muối tan NaCl, Na2SO4 nên áp suất thẩm thấu dung dịch đất lớn làm ảnh hưởng tới quá trình hút nước và dinh dưỡng cây trồng. Hoạt động của vi sinh vật đất yếu Sự hình thành đất nhiễm mặn do 2 nguyên nhân chủ yếu là ảnh hưởng của nước ngầm hay do ảnh hưởng của nước biển mặn theo trủy triều tràn vào. Ở Việt Nam, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở 2 vùng châu thổ lớn là ĐBSH và ĐBSCL. Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông vào đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng 15km, nhưng ở vùng ĐBSCL lại có thể xâm nhập tới 40 – 50 km (FAO, 2012) [16]. Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng sông Cửu Long: Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012 [2] dự báo khoảng 7.600km2 (tương đương 20% diện tích) ĐBSCL sẽ chìm khi nước biển dâng 75cm và ở mức 100cm thì phạm vi ngập trải rộng trên diện tích 15.116km 2, tương đương 37,8% diện tích tự nhiên toàn vùng. Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% đất của ĐBSCL có nguy cơ nhiễm mặn cục bộ. Nhiễm mặn gây hại rất lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa, trung bình năng suất lúa có thể giảm 20-25%, thậm chí tới 50%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến canh tác 3 vụ mùa, sản lượng lương thực bị mất đi đáng kể, đe dọa an ninh lương thực quốc gia. Nước ta có khoảng 1 triệu ha đất nhiễm mặn, trong đó có 2 vùng nhiễm mặn lớn là vùng châu thổ sông Hồng và vùng lúa ĐBSCL. ĐBSCL có diện tích tự nhiên là 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha, đất sản xuất lâm nghiệp là 430.770 ha, đất khác chiếm 277.000 ha và đất chuyên dùng khoảng 262.682 ha [3]. ĐBSCL bị chia cắt bởi hệ thống sông tự nhiên kết hợp với hệ thống sông ngòi chằng chịt đã tạo thành hệ thống thủy lợi cung cấp nước cho sản xuất nông 5 nghiệp, thau chua rửa mặn và cũng là hệ thống vận chuyển đường thủy tốt, rất thuận lợi cho vận chuyển hàng hóa, nông sản. Mùa lũ thường kéo dài 5 tháng với lượng nước chiếm khoảng 3/4 tổng lượng nước cả năm, và 7 tháng mùa khô cạn, lượng nước còn lại rất ít. Do đó, thủy triều có ảnh hưởng rất lớn đến phần lớn vùng hạ lưu sông Mekong, toàn bộ ĐBSCL vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít phụ thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng vùng. Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện cùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển càng mặn, càng vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và ít có nước thượng nguồn đổ về [3]. Mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển, và tùy vào mùa trong năm, cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3 – 4 dương lịch. Qua chuỗi số lượng thực đo 10 năm (1991 – 2000) ở ĐBSCL [4] đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn ứng với các trị số: 0,4 g/l; 2 g/l; 4 g/l; 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô, tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm) của thời đoạn 10 năm trên ĐBSCL diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l chiếm 2.126.635 ha (Bảng 1.2). Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) STT Khu vực 1 Không ảnh hưởng mặn 2 Xâm nhập mặn 3 Độ mặn (g/l) Diện tích (ha) Tỷ lệ (%) 1.773.365 45,5 0,0 – 0,4 107.025 2,8 Xâm nhập mặn 0,4 – 2,0 232.816 6,0 4 Xâm nhập mặn 2,0 – 4,0 148.244 3,8 5 Xâm nhập mặn 4,0 – 16,0 1.378.550 35,3 6 Xâm nhập mặn >16,0 260.000 6,6 3.900.000 100 Tổng cộng (làm tròn) (Lê Sâm, 2003) 6 ĐBSCL có khoảng 1,8 – 2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hưởng mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Trà Vinh và Sóc Trăng, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập nước [3]. Hình 1. Diện tích và nồng độ mă ̣n vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m 7 Nước biển dâng là một quá trình liên tục, nếu chúng ta không có biện pháp ngăn chặn quyết liệt thì quá trình càng ngày càng nhanh. Ảnh hưởng của nó là khôn lường, cần có sự chuẩn bị ứng phó đúng mức và ngay từ bây giờ. Các vùng lúa nhiễm mặn ở vùng ĐBSH thuộc các tỉnh như: Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000ha ở hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3 – 0,5%, chủ yếu tập trung tại các huyện như: Kiến Thụy, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vinh Bảo,… Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện như Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy, … Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện như Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung, … riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005. Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường được gieo trồng là: Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương...năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha. Gần đây một số giống lúa chịu mặn trung bình như: Mộc Tuyền, X21, Xỉ, X19, VD97, VD920... cho năng suất khá cao nhưng có dạng hình yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt [6]. 1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá là cây nhiễm trung bình với mặn. Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước, những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [9]. Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích luỹ quá nhiều ion Cl [11]. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, nguyên nhân gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích luỹ quá nhiều ion Na+ và ion này trực tiếp gây độc trên cây trồng, làm cho Cl- trở thành ion trơ nên phổ kháng của cây tương đối rộng (Yeo và Flower, 1996). Như vậy, sự tổn hại ở cây lúa trên đất mặn là do cây hấp thu quá dư cả ion Na+ và Cl- [42]. 8 Ảnh hưởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na - K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na - K tốt trong chồi. Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn [36]. Tuy thế việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được. Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại [20]. Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dưỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [36]. Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm với mặn [9]. Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [11], [28]. Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977) Yeo và Flower (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung như sau: + Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc + Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân 9 + Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi + Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại + Chống chịu ở mô: Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây + Ảnh hưởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi. 1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn 1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính trạng di truyền số lượng. Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (Continuous distribution), tính trạng này được điều khiển bởi nhiều QTL, mỗi QTL có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu. Cho đến nay trên thế giới đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di truyền của tính chống chịu mặn. Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu mặn là một tính trạng di truyền đa gen, không di truyền theo dòng mẹ (không do các gen trong tế bào chất quy định) [29]. Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Gregorio và Senadrina, 2002)[19]. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi những gen cộng tính (Mishra và ctv, 1990)[30]. 10 1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhưng công trình nghiên cứu kinh điển về sự di truyền phân tử tính chống chịu mặn. Dựa vào bản đồ QTL trên cơ sở tính chống chịu mặn là tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển, sử dụng chỉ thị AFLP và STS các nhà khoa học đã cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn được định vị trên Nhiễm sắc thể số 1 và được gọi là gen Saltol. Bản đồ QTL được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (thí dụ như tính chống chịu mặn). Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những Locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng chỉ thị phủ trên toàn bộ nhiễm thể trong hệ gen cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm thể và xác định các gen mục tiêu [7]. Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen và hoạt động của những Locut bao gồm tương tác gen (Epistasis) và tương tác QTL x E (môi trường). Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những chỉ thị mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc ứng dụng trở nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, v.v.. Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là “tách dòng” các gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning”. [6] 1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng ức chế do mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo mô hình phản ứng oxy hóa, tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu trình quang hợp [13]. Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân tử là một khám phá vô cùng thú vị. Tín hiệu được truyền vào tế bào, các gen có chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các qúa trình phiên mã, dịch mã xảy ra [1]. 11 Các biểu hiện của cây khi gặp điều kiện mặn bao gồm những triệu chứng chính là: Trắng đầu lá sau đó cháy. Lá vàng và chết hoặc sinh trưởng còi cọc, đẻ nhánh kém, lép hạt, rễ phát triển kém… 1.3. Chỉ thị phân tử 1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu, đánh giá sự có mặt của gen kháng làm cơ sở chính xác cho chọn lọc các cá thể mang tính trạng mong muốn đã trở nên đơn giản hơn. Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN. Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP...). Đặc điểm chung của chỉ thị phân tử là, cho nhiều đa hình, là chỉ thị trội hoặc đồng trội. Nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn Locut–nhiều alen”, biểu hiện đa hình 1 cách trung tính, không phụ thuộc vào mô, cơ quan (hay bộ phận cần tách chiết ADN ra để khảo sát), không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường. Bên cạnh đó, chỉ thị phân tử có số lượng vô cùng lớn. Việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh, dễ dàng tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một chỉ thị ADN liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó. Chỉ thị phân tử còn có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật. Ngoài việc loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của một Locut hoặc giữa các Locut khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng, tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình, số lượng các chỉ thị phân tử còn cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các 12 alen, các chủng sinh lý gây bệnh. Đây là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm... Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính: Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Thực chất nhóm chỉ thị này cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do có bản chất là chuỗi lặp lại nên được xếp vào 1 nhóm riêng. Các chỉ thị phân tử ADN thường có tên gọi theo tên kỹ thuật tương ứng như: RFLP, STS, AFLP, CAPS, RAPD, SSR… Tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà chỉ thị nào sẽ được sử dụng. Về cơ bản, chúng ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị phân tử nào trong nghiên cứu đa hình và lập bản đồ phân tử. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng những thông tin về trình tự ADN trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các sinh vật. Tuy nhiên một chỉ thị tối ưu cần đảm bảo sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và tính trạng hay vùng quyết định tính trạng, phải có đa hình, có khả năng lặp lại được, phải dễ sử dụng và phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn. 1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng 1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc bởi sự mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN hệ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò. Như vậy nguyên lý cơ bản của chỉ thị RFLP dựa trên kỹ thuật lai Southern 13