Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thành phần, hoạt tính sinh học của loài rong lục việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Dương Thị Thu Thanh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI RONG LỤC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HỮU CƠ Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Dương Thị Thu Thanh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI RONG LỤC VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Tất Thành Hà Nội – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Tất Thành. Các kết quả nghiên cứu thu được trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn DƯƠNG THỊ THU THANH ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Tất Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, chỉ ra hướng nghiên cứu cho tôi, cũng như động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Nhóm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh - dược phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ Gen, Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, ban lãnh đạo của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi hoàn thành tốt bản luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả luận văn DƯƠNG THỊ THU THANH iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ ................................................................ v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. vii MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................ 3 1.1. Rong biển ........................................................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 3 1.1.2. Rong lục........................................................................................................ 5 1.2. Lipid ................................................................................................ 6 1.2.1. Các lớp chất lipid ......................................................................................... 8 1.2.2. Ứng dụng phương pháp khối phổ trong phân tích cấu trúc lipid ............... 9 1.3. Phương pháp khối phổ .................................................................. 10 1.3.1. Nguyên lý của khối phổ ............................................................................. 10 1.3.2. Hoạt động và cấu tạo chung của máy khối phổ ........................................ 10 1.3.3. Ứng dụng phương pháp khối phổ trong phân tích lipid............................ 16 1.4. Một số nghiên cứu về lớp chất lipid trong rong biển ................... 16 1.5. Hoạt tính sinh học của rong biển .................................................. 20 CHƯƠNG II:NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU ................................................................................................... 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 24 2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất ............................................................ 26 2.2.1. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................... 26 2.2.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................... 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 27 2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu ........................................................... 27 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần ............................................................ 28 2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số ................................... 29 iv 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate ...................................... 31 2.3.6. Phương pháp chiết lipid tổng ..................................................................... 31 2.3.7. Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid ............................. 32 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid tổng ............................................................................................................... 33 2.3.9. Phương pháp xác định dạng phân tử và cấu trúc của các hợp chất .......... 34 2.3.10. Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm .......................................... 39 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................... 40 3.1. Thành phần hóa học của các mẫu rong lục .................................. 40 3.2. Kết quả xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng của các mẫu rong nghiên cứu .................................... 43 3.3. Thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid tổng các mẫu rong lục nghiên cứu .............................................................................. 44 3.4. Kết quả xác định dạng phân tử của lớp chất glycolipid .............. 48 3.4.1. Xác định dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) ............ 48 3.4.2. Xác định dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG) ................... 50 3.4.3. Xác định dạng phân tử sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ............. 53 3.5. Hoạt tính kháng viêm của lipid loài rong lục Halimeda incrassata Lamx. ..................................................................................................... 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 58 Kết luận ............................................................................................. 58 Kiến nghị ............................................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 60 v DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Một số loài rong biển ....................................................................... 5 Hình 1.2. Cấu tạo phân tử lipid ........................................................................ 7 Hình 1.3. Cấu tạo lipid trên cơ sở glycerol ...................................................... 8 Hình 1.4. Cấu tạo lipid trên cơ sở sphingozine ................................................ 8 Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống khối phổ.................................. 11 Hình 1.6. Sơ đồ hoạt động của hệ ESI-MS/MS ............................................. 12 Hình 1.7. Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật TOF ....................................................... 13 Hình 1.8. Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật Iontrap ............................................ 14 Hình 1.9. Sơ đồ của máy quang phổ khối tứ cực ........................................... 15 Sơ đồ 2.1. Thực nghiệm chiết lipid tổng ........................................................ 32 Sơ đồ 2.2. Thực nghiệm phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid 33 Hình 3.1. Dạng công thức cấu tạo monogalactosyldiacylglycerol (MGDG). 48 Hình 3.2. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của MGDG 30:0 [C39H74O10] ..... 50 Hình 3.3. Dạng công thức cấu tạo digalactosyldiacylglycerol (DGDG) ....... 50 Hình 3.4. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGDG 32:0 [C47H88O15] ..... 52 Hình 3.5. Dạng công thức cấu tạo sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) . 53 Hình 3.6. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của SQDG 32:0 [C41H78O12S] .... 55 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách mẫu rong lục nghiên cứu .............................................. 24 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của các mẫu rong lục nghiên cứu ................. 40 Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng .......................... 43 Bảng 3.3. Thành phần và hàm lượng các acid béo trong các mẫu nghiên cứu... 44 Bảng 3.4. Thành phần các dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) ......................................................................................................... 49 Bảng 3.5. Thành phần các dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG). 51 Bảng 3.6. Thành phần các dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) ........................................................................................................... 53 Bảng 3.7. Hoạt tính kháng viêm của một số phân đoạn lipid của loài rong lục .... 56 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Pol Polar lipid Lipid phân cực ST Sterol Sterol FFA Free fatty acid Acid béo tự do TG Triacylglycerol Triacylglycerol DG Diacylglycerol Diacylglycerol MADG Monoalkyldiacylglycerol Monoalkyldiacylglycerol HW Hydrocarbon wax Hydrocarbon và sáp MUFA Monounsaturated fatty acids Acid béo không no 1 nối đôi PUFA Polyunsaturated fatty acids Acid béo không no đa nối đôi EPA Eicosapentaenoic acid Acid Eicosapentaenoic DHA Docosahexanenoic acid Acid Docosahexanenoic GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography spectroscopy MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol DGDG Digalactosyldiacylglycerol Digalactosyldiacylglycerol SQDG Sulfoquinovosyldiacylglycerol Sulfoquinovosyldiacylglycerol PG Phosphatidylglycerol Phosphatidylglycerol PC Phosphatidylcholine Phosphatidylcholine PI Phosphatidylinositol Phosphatidylinositol EAA Essential amino acids Axit amin thiết yếu TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng mass Sắc ký khí khối phổ 1 MỞ ĐẦU Rong biển là những sinh vật bậc thấp sống dưới đáy biển với độ sâu từ vài mét đến hàng chục mét. Cùng với cỏ biển, chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển, đây là nơi cư trú và cung cấp thức ăn cho các loài động vật biển, nhất là ở giai đoạn con non. Chúng là sinh vật trung gian trong quá trình đồng hóa chất dinh dưỡng từ nước biển. Những đặc điểm này đã khiến chúng được quan tâm và nghiên cứu trong suốt thời gian qua. Nước ta có khí hậu nhiệt đới và có bờ biển kéo dài hơn 3260 kilomet vì vậy chúng ta có nguồn tài nguyên biển vô cùng phong phú. Trong đó, rong biển là nguồn tài nguyên sinh học đa dạng và có trữ lượng lớn. Các nghiên cứu trong nước trên đối tượng này đã được bắt đầu từ đầu thế kỷ 19 với nhiều công trình công bố của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Trước đây, rong biển thường được tập trung nghiên cứu nhiều về hình thái, phân bố và các đặc tính sinh học. Tuy nhiên nhiều năm trở lại đây, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các thành phần sinh hóa trong rong biển cũng được nghiên cứu rất nhiều. Các thành phần trong rong biển bao gồm carbohydrate 10-50%, protein 2-20%, khoáng 1-3%, lipid 0,2-2% và một số vitamin. Trong rong biển, lipid chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng có hàm lượng các acid béo đa nối đôi cao, thêm vào đó là các chỉ số PUFA/SFA và omega 3/omega 6 cân đối. Do vậy, các nghiên cứu về lipid của rong biển ngày càng được quan tâm nghiên cứu. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của rong biển cho thấy rong biển có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng viêm và có vai trò quan trọng trong việc điều trị một số bệnh về tim mạch, xương khớp, não bộ. Điều này góp phần giải thích lý do rong biển đã được sử dụng làm thực phẩm ở các nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam… và ngày càng tăng các tác dụng phòng và chữa bệnh của chúng. Một trong những thành phần quan trọng thể hiện những hoạt tính này trong rong biển là lipid. Trong đó, các acid béo đa nối đôi là yếu tố quan trọng quyết định tính chất của lipid trong rong biển. Chúng chủ yếu được tìm thấy trong lớp lipid phân cực gồm các phân lớp như glycolipid, phospholipid và 2 betaine lipid. Đây là các thành phần quan trọng của màng tế bào và lục lạp của các sinh vật sống. Trước đây, các phương pháp tiếp cận và phân tích các thành phần acid béo của lipid chủ yếu dựa trên sắc ký khí (GC) và sắc ký khí khối phổ (GCMS), do vậy các dạng lipid ở cấp độ phân tử vẫn chưa được xác định. Hiện nay, vấn đề này đã được giải quyết bằng cách sử dụng phương pháp phổ khối phân giải cao (HRMS) kết hợp với sắc ký lỏng (LC). Việc sử dụng phương pháp này không chỉ có thể xác định cấu trúc của khung mang các acid béo mà còn có khả năng xác định một số dạng phân tử có hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu về thành phần lipid và các dạng phân tử lipid trên thế giới và Việt Nam cho tới nay vẫn còn khá hạn chế. Báo cáo kết quả về thành phần lipid, dạng phân tử và hoạt tính của lipid trên đối tượng rong lục còn rất khiêm tốn và mới chỉ được công bố trên một vài công trình trong hai năm trở lại đây. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần, hoạt tính sinh học của lipid trong loài rong lục Việt Nam” nhằm bổ sung các kết quả nghiên cứu hóa sinh về đối tượng rong biển Việt Nam nói chung và rong lục nói riêng. Bên cạnh đó, đây cũng là lần đầu tiên thành phần các lớp chất lipid và dạng phân tử của chúng được tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng rong lục Việt Nam. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Phân tích, đánh giá một số thành phần hóa học trong một số đối tượng rong lục phổ biến tại Việt Nam. Phân tích thành phần, hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng của các mẫu nghiên cứu. - Phân tích, đánh giá thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid tổng. - Phân tích và nhận dạng một số dạng phân tử trong lipid phân cực của 01 mẫu rong điển hình. - Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid trong mẫu rong điển hình. - 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Rong biển 1.1.1. Giới thiệu chung Rong biển là những sinh vật toàn dưỡng, có khả năng hấp thụ trực tiếp chất dinh dưỡng từ nước để tổng hợp nên chất hữu cơ thông qua quá trình quang hợp. Các loài rong biển đã tạo nên khoảng 25% vật chất hữu cơ của trái đất. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ rong biển có thể đi theo các hướng như các hợp chất polysaccharide, protein, lipid hay các nguyên tố vi lượng. Trên thế giới, các kết quả công bố cho thấy rong biển chứa nhiều khoáng chất và sinh tố, nhiều carbonhydrate, protein và lipid trong đó có các acid béo không no nhiều nối đôi thiết yếu đối với cơ thể sống, chúng có giá trị lớn trong thực phẩm, y dược và mỹ phẩm [1]. Quần thể rong biển cung cấp nơi trú ẩn và môi trường sống cho các sinh vật biển khác nhau trong toàn bộ hoặc một phần vòng đời của chúng [2]. Rong biển đóng một vai trò sinh thái quan trọng trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng cho các sinh vật biển, cả trực tiếp hoặc gián tiếp [3]. Chúng là một nguồn dinh dưỡng tiềm năng bao gồm các chất đa và vi lượng, các protein chất lượng cao, chất xơ hòa tan, các thành phần vitamin, khoáng chất và acid béo giúp bảo vệ cơ thể con người chống lại nhiều bệnh [4]. Rong biển từ lâu đã được sử dụng làm thực phẩm ở các nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc bởi rong biển không chỉ ngon mà còn tốt cho sức khỏe [5]. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, chúng còn có các tác dụng sinh lý khác nhau đối với sức khỏe và bệnh tật nhờ sự đa dạng trong thành phần các chất chuyển hóa chính của chúng [6,7]. Các chất chuyển hóa này đã được ứng dụng cho nhiều nhu cầu sinh học và chức năng bao gồm các hoạt động kích thích miễn dịch [8,9], chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư [10]. Trong những năm gần đây, những tiến bộ về khoa học và công nghệ đã thúc đẩy việc khai thác rong biển làm thực phẩm chức năng, dược phẩm và y học [11,12]. 4 Hiện nay, có nhiều quan điểm về phân loại rong tảo biển trong đó 2 hệ thống được công nhận nhiều là hệ thống phân loại của Gollerbakh [13] và Philip Size [14]. Theo Gollerbakh, rong biển được phân chia thành 10 ngành, bao gồm: Ngành rong lam/ khuẩn lam – (Cyanophyta); Ngành tảo giáp (Pyrrophyta); Ngành tảo vàng ánh (Chrysophyta); Ngành tảo khuê (Bacillariophyta); Ngành rong nâu (Phaeophyta/Ochrophyta); Ngành rong đỏ (Rhodophyta); Ngành tảo vàng (Xanthophyta); Ngành tảo mắt (Euglenophyta); Ngành rong lục (Chlorophyta) và Ngành tảo vòng (Charophyta). Theo Philip Size, là 9 ngành, bao gồm: Cyanophyta, Rhodophyta, Chlorophyta, Chromophyta, Haptophyta, Pyrrophyta - Dinophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Chrarachniophyta. Tuy hai hệ thống có phân chia thành 10 và 9 ngành nhưng về cơ bản không có sự sai khác lớn. Cơ sở phân chia thành các ngành khác nhau ngoài việc dựa vào mối quan hệ họ hàng và mức độ tiến hóa còn dựa chính vào sắc tố có trong các loài của ngành đó. Đây cũng là cơ sở đặt tên cho các ngành rong biển hiện nay. Trong các ngành kể trên, số lượng loài và trữ lượng chỉ tập trung vào 4 ngành chủ yếu là: Ngành rong lam/ khuẩn lam – (Cyanophyta); Ngành rong đỏ (Rhodophyta); Ngành rong nâu (Phaeophyta/Ochrophyta) và Ngành rong lục (Chlorophyta). Phân loại rong hiện đại có nét đặc trưng là sử dụng nhiều hệ thống khác nhau, các hệ thống phân biệt với nhau qua số phân loại, khối lượng phân loại, vị trí các nhóm rong khác nhau trong hệ thống. Ngay cả các mức phân loại cao nhất là giới, ngành và lớp của phân loại, người ta cũng không thể đi đến một ý kiến thống nhất, vì vậy, các khác biệt còn lớn hơn nữa khi xét đến phân loại ở các bậc thấp hơn. 5 Enteromorpha compressa Ulva fasciata (ngành rong lục) ( ngành rong lục) Hypnea pannosa Dictyopteris bartayresiana (ngành rong đỏ) ( ngành rong nâu) Hình 1.1. Một số loài rong biển 1.1.2. Rong lục Rong lục (Chlorophyta) thuộc giới Plantae, chúng là những sinh vật quang tự dưỡng với nhiều hình thái và kích thước khác nhau. Ban đầu, Chlorophyta dùng để chỉ một bộ phận trong giới thực vật bao gồm tất cả các loài rong và tảo lục. Sau đó, các loài sống chủ yếu trong nước biển được phân 6 loại là rong lục (tức là thuộc ngành Chlorophyta), trong khi các loài phát triển mạnh chủ yếu ở nước ngọt được phân loại là tảo lục (tức là thuộc ngành Charophyta). Cơ sở dữ liệu AlgaeBase về rong đã liệt kê khoảng 4.500 loài Chlorophyta, bao gồm 550 loài thuộc họ Trebouxiophyceae, 2.500 loài thuộc họ Chlorophyceae, 800 loài thuộc họ Bryopsidophyceae, 50 loài thuộc họ Dasycladophyceae, 400 loài thuộc họ Siphoncladophyceae, và 250 loài thuộc họ Ulvophyceae [15]. Các loài rong lục (Chlorophyta) có số lượng loài và khu vực phân bố hẹp hơn so với các loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và rong đỏ (Rhodophyta). Sắc tố của những loài này thay đổi từ màu xanh lục nhạt đến đậm nhờ các thành phần diệp lục chlorophyl a và b. Loài rong lục có quan hệ họ hàng rất gần với các loài thực vật trên cạn, thể hiện ở một số đặc tính cấu trúc hóa học tác động đến sự phát triển của các loại kháng sinh mới có triển vọng trong tương lai [16]. Rong lục dễ bị tổn thương bởi các loại tác nhân sinh học và vật lý khác nhau. Vì vậy, để phản ứng với những tác nhân này, rong lục tạo ra các loại chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học khác nhau để bảo vệ rong khỏi các tác nhân sinh học và vật lý gây hại [17]. Những loài rong lục ăn được chứa nhiều chất dinh dưỡng, chẳng hạn như vitamin, carbonhydrate, acid amin thiết yếu [18], acid béo không bão hòa đa nối đôi [19] và khoáng chất. Các loài rong này đã thu hút rất nhiều sự chú ý do giá trị dinh dưỡng cũng như hoạt tính sinh học của chúng. Các hoạt tính này bao gồm tác dụng chống oxy hóa [20], kháng khuẩn [21] và chống ung thư [22]. Vì vậy, nó được nghiên cứu và sử dụng trong đời sống hàng ngày ở nhiều nơi trên thế giới và nhiều nhất tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines và một số nước khác ở Đông Nam Á [23]. 1.2. Lipid Lipid là hợp chất hữu cơ đa chức (chứa nhiều nhóm chức giống nhau) gồm những chất như dầu ăn, mỡ... Chúng có độ nhớt cao, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ như ether, chlorophorm, benzene, rượu. Giống như các carbohydrate, các lipid được tạo nên từ C, H và O nhưng chúng có thể chứa các nguyên tố khác như P và N. Chúng khác với 7 carbohydrate ở chỗ chứa O với tỉ lệ ít hơn. Cùng với các protein, các acid nucleic và carbohydrate, lipid thuộc vào số các phân tử của mọi tế bào. Thuật ngữ lipid được dùng ở đây là để chỉ các dẫn xuất của các acid béo mạch dài, được gọi là các acid mỡ [12]. Trong tự nhiên, những hợp chất thuộc về lớp chất lipid tồn tại rất đa dạng như: các hydrocarbon bậc cao, các ancol, các aldehyde, các acid béo và các sản phẩm thứ cấp của chúng như glyceride, sáp, phospholipid, glycolipid, sulfolipid... [24]. Lipid có nhiều kiểu cấu trúc khác nhau, tuy nhiên cấu tạo lipid thường có chung một nguyên tắc là trong thành phần phân tử lipid bao gồm hai phần: một phần là các đuôi mạch hydrocarbon kị nước; phần kia là tổ hợp nhóm các chất ưa nước (gọi là đầu phân cực). Hai phần của phân tử lipid được liên kết với nhau bởi mắt xích liên kết ở giữa và phân tử lipid tồn tại như một liên kết tổ hợp của hai phần, trong đó những phần tử kị nước tham gia cấu tạo nên pha không phân cực và những phân tử ưa nước tham gia cấu tạo nên pha phân cực (hình 1.2). Hình 1.2. Cấu tạo phân tử lipid Cấu trúc tổ hợp liên kết của phân tử lipid phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc tự nhiên của các cấu tử tham gia vào thành phần của nó. Thường người ta dùng nguồn gốc tự nhiên của mắt xích liên kết, giữa phần phân cực và phần không phân cực để làm cơ sở phân loại lớp chất lipid [24]. Theo đó, lipid có hai dạng glycerin và sphingozin. Trong thực tế đa phần dầu mỡ tồn tại dưới dạng este của glycerin (1) với các acid béo (gọi là glyceride), khi mà cả ba nhóm hydroxyl (OH) của glyxcerol đều được este hóa thì gọi là triglyceride 8 hoặc là triacylglycerol (2). Do đó, dầu mỡ cũng có tên là lipid trung tính và có công thức cấu tạo như sau: 1 1 CH OH 2 CH2 2 2 HO OCOR1 C R2OCO H C 3 CH2 3 CH OH 2 Glycerol (1) H OCOR3 Triglyceride (2) Hình 1.3. Cấu tạo lipid trên cơ sở glycerol Nhóm chất lipid khác cũng phân bố rộng rãi trong lớp màng tế bào, đặc biệt là ở não, đó là các sphingolipid, chúng được cấu tạo trên cơ sở liên kết nhóm amin của sphingozin (3) với các axít béo. Các sphingolipid đóng vai trò quan trọng trong việc truyền dẫn tín hiệu và nhận biết tế bào, chúng có tác động đặc biệt vào mô thần kinh. Các hợp chất nhận được qua biến đổi được gọi chung là ceramide (4) và có công thức cấu tạo mô tả ở hình 1.4. CH2OH H C NH2 H C OH HO CH CH CH CH (CH2)12 HO CH 2 NH O CH3 Sphingozine (3) Ceramide (4) Hình 1.4. Cấu tạo lipid trên cơ sở sphingozine 1.2.1. Các lớp chất lipid Các lớp chất lipid chính bao gồm hydrocarbon, sáp, mono-, di-, triglyceride, acid béo tự do, sterol và lipid phân cực. Trong lớp lipid phân cực có glycolipid và phospholipid. Đây là các thành phần màng tế bào của tất cả các loài sinh vật. Chúng có vai trò ổn định màng tế bào và tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhận biết các tế bào lạ, điều này vô cùng quan trọng trong đáp ứng 9 miễn dịch của cơ thể. Ngoài ra, chúng còn là cầu nối cho các tế bào liên kết với nhau để hình thành các mô, cơ quan trong cơ thể sinh vật. Tìm hiểu các lớp chất lipid là việc làm cần thiết trong quá trình phân tích thành phần lipid giúp cho ta có được bức tranh tổng thể để trước khi đi vào tìm hiểu cụ thể từng phần riêng biệt của lipid sinh vật biển nói chung và rong biển nói riêng. Mỗi lớp chất lipid có một phương pháp nhận dạng và phân tích đặc hiệu riêng như: các acid béo thông thường có thể phân tích bằng sắc ký khí (GC) còn các acid béo đặc hiệu như acid cyclic, epoxy, hydroxy thì phải dùng sắc ký khí khối phổ (GC-MS) cùng với một số phản ứng hóa học riêng biệt mới có thể nhận dạng được. Đối với triglyceride phải kết hợp cả sắc ký bản mỏng (TLC) và GC để lí giải. Các lipid phân cực như phospholipid, glycolipid lại cần có những phương pháp riêng để nhận dạng như TLC 2 chiều với các thuốc thử đặc hiệu là molypdate và ninhydrin cùng một số phản ứng hóa học để nhận dạng. Trong điều kiện phân tích tại phòng thí nghiệm, một trong những phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và hiệu quả là sử dụng TLC điều chế nhanh với hệ dung môi triển khai đặc hiệu. Qua đó, ta có thể biết được những thông tin chung về hàm lượng, thành phần của các lớp chất cơ bản của lipid. Với tiến bộ kỹ thuật phân tích của các phương pháp phổ vật lý, cùng với máy móc hiện đại ngày càng được cải tiến nhanh chóng đã giúp cho các nhà nghiên cứu lipid có thể thu được những thông tin ban đầu về thành phần các lớp chất trong đó. Ví dụ như: bằng việc sử dụng máy Iatrocan TLC/FID Japan có kết hợp với hệ chất chuẩn đã cho ta biết thêm về hàm lượng phospholipid và glycolipid sơ bộ ngoài các thành phần cơ bản trong lipid đã kể trên. 1.2.2. Ứng dụng phương pháp khối phổ trong phân tích cấu trúc lipid Một lớp chất lipid riêng biệt được đặc trưng bởi phần phân cực của các phân tử. Lipid thuộc vào một lớp hoặc một phân lớp nhưng khác nhau về thành phần gốc acyl và vị trí của chúng trong phân tử lipid, được gọi là các “dạng phân tử” (molecular species) của lớp lipid đó. 10 Mỗi dạng phân tử là một hợp chất hóa học riêng biệt và mỗi lớp chất lipid là hàng chục, hàng trăm dạng phân tử khác nhau. Số lượng dạng phân tử của một lớp chất lipid sẽ tỉ lệ thuận với số lượng các acid béo của lớp chất đó. Sự đa dạng của acid béo trong các đối tượng sinh vật biển khiến cho việc phân lập các “dạng phân tử” riêng rẽ từ một lớp chất lipid trên cả mặt lý thuyết và thực tế là vô cùng khó khăn. Chính đặc thù cấu trúc này đã gây trở ngại cho các nhà khoa học trong việc nghiên cứu hóa học, hoạt tính sinh học các cấu trúc lipid, đặc biệt là các phân tử lipid phức tạp, cũng như sử dụng chúng trong các sản phẩm dược phẩm. Do vậy, hầu hết các nghiên cứu từ trước tới nay về lipid sinh vật biển mới đi vào phân tích thành phần hàm lượng các lớp chất lipid, thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid tổng và trong một số lớp chất lipid riêng biệt. Một trong những định hướng nghiên cứu hiện đại là đi sâu vào từng lớp chất lipid, tiến hành phân tích và nhận dạng được các dạng phân tử có mặt trong lớp chất đó mà không cần phân lập từng hợp chất lipid riêng rẽ. 1.3. Phương pháp khối phổ 1.3.1. Nguyên lý của khối phổ Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. 1.3.2. Hoạt động và cấu tạo chung của máy khối phổ Ban đầu, mẫu (i) được ion hóa thành các ion ở các trạng thái tích điện khác nhau, (ii) sau đó các ion mẫu sẽ được phân tách dựa trên sự khác biệt về giá trị m/z, (iii) ghi dữ liệu phổ khối của các ion đã phân tách với sự trợ giúp của các phần mềm tin sinh học cho phép tìm kiếm trên các cơ sở dữ liệu và phân tích kết quả thu được. Máy khối phổ không đo khối lượng (m) mà chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio). Trong nghiên cứu khối phổ, hợp chất cần phân tích được chuyển sang dạng dẫn xuất dễ bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các 11 ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Sự phát triển của kỹ thuật hiện nay có thể cho phép tích hợp đồng thời hai kiểu quét ion dương (+) và ion âm (-) nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu. Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống khối phổ Hiện nay có nhiều kỹ thuật được sử dụng để ion hóa phân tử trong phương pháp phổ khối. Bên cạnh các phương pháp ion hóa truyền thống, các kỹ thuật ion hóa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment, FAB), ion hoá phun mù điện tử (electrospray ionization, ESI), ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure photoionization – APPI), ion hóa phản hấp thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI) đã được phát triển để phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi. Trong đó MALDI thường được sử dụng để phân tích các đại phân tử, APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi, còn ESI được ứng dụng trong phân tích các hợp chất phân tử thấp như oligosaccharide, polymer có khối lượng phân tử thấp, glycolipid, sphingolipid…(hình 1.6).