Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thành phần hóa học của cây bồ đề trung bộ (styrax annamensis guill.)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN ĐĂNG ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ (STYRAX ANNAMENSIS GUILL.) LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN ĐĂNG ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ (STYRAX ANNAMENSIS GUILL.) CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ NGÀNH: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN THANH TRÀ HÀ NỘI 2021 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bồ đề Trung bộ ( Styrax annamensis Guill. )” là do tôi thực hiện được sự đồng ý và hướng dẫn của TS.Nguyễn Thanh Trà. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này. Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2021 Người hướng dẫn Học Viên Trần Đăng Anh Nguyễn Thanh Trà 3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thanh Trà – Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tin tưởng giao phó và tâm huyết hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện. Tôi xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH & CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu các phương pháp Phổ ứng dụng và đặc biệt là được sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Quỹ Nafosted, MSĐT: 104.01-2017.28 Trong quá trình thực hiện luận văn, mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng, nỗ lực, bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn. Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2021 Người hướng dẫn Học Viên Trần Đăng Anh Nguyễn Thanh Trà 4 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt WHO CC TLC IR MS NMR 1 H-NMR 13 C-NMR DEPT HPLC HPLC-MS NOESY IC50 δH- δC HSQC HMBC HR-MS COSY Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt World Health Organization Column Chromatography Thin layer Chromatography Infrared Spectrometry Mass Spectrometry Nuclear Magnetic Resonance 1 H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy Distortionless Enhancement by Polarization Transfer High-performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography–Mass Spectrometry Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy 50% Inhibitory Concentration Tổ chức y tế thế giới Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Phổ hồng ngoại Phổ khối lượng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Tăng cường biến dạng bằng chuyển phân cực Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ Phổ tăng cường hạt nhân Nồng độ ức chế 50% Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon Heterronuclear Single Phổ tương tác hai chiều dị hạt Quantum Coherence nhân Heterronuclear Multiple Bond Phổ tương tác đa liên kết hai Correlation chiều dị nhân High Resolution Mass Phổ khối phân giải cao Spectroscopy Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 5 DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ STT Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Tên hình, bảng, sơ đồ Một số hợp chất gây độc tế bào phân lập từ các loài chi Styrax Một số hợp chất bẫy gốc tự do phân lập từ chi Styrax Một số hợp chất kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ chi Styrax Một số hợp chất khác phân lập từ chi Styrax Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. agertifolia ở Việt Nam Tiêu bản cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.) được lưu giữ tại Bảo tàng lịch sử thiên nhiên Quốc gia CH Pháp-2010 Cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.) thu hái ở Điện Biên Các bước tiến hành sắc ký cột Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng Phổ ESI-MS của chất 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 Phổ HMBC của hợp chất 1 Tương tác HMBC của hợp chất 1 Phổ ESI-MS của hợp chất 2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 Phổ ESI-MS của hợp chất 3 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 Phổ HMBC của hợp chất 3 Tương tác HMBC của hợp chất 3 Phổ ESI-MS của hợp chất 4 Phổ 1H của hợp chất 4 Phổ 13C của hợp chất 4 Phổ HMBC của hợp chất 4 6 Trang 15 16 18 19 21 22 23 27 27 35 36 36 37 38 36 39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 45 Tương tác HMBC của hợp chất 4 Phổ ESI-MS của hợp chất 5 Phổ 1H-NMR của hợp chất 5 Phổ 13C của hợp chất 5 Phổ HMBC của hợp chất 5 Tương tác HMBC và COSY của hợp chất 5 Phổ COSY của hợp chất 5 Phổ ESI-MS của hợp chất 6 Phổ 1H của hợp chất 6 Phổ DEPT của hợp chất 6 Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAc Hình 3.30 lá cây Bồ đề Trung Bộ Hình 3.31 So sánh cấu trúc và hoạt tính của ba hợp chất benzofuran 1,2,3 Dữ liệu phổ 1H (125 MHz, CD3OD, δC ppm) và 13C-NMR Bảng 2.1 (125 MHz, CD3OD, δC ppm của các hợp chất 1,2,3 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.28 Hình 3.29 Dữ liệu phổ 1H (125 MHz, CD3OD, δC ppm) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, δC ppm của các hợp chất 4, 5 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 6 Hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết và chất sạch lá cây Bồ đề Bảng 3.2 Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.) Sơ đồ ngâm chiết lá cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Sơ đồ 2.1 Guill.) Bảng 2.2 7 45 46 47 48 48 48 49 49 50 51 51 53 55 31-32 33 51-52 54 25 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. 3 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ 5 DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ ......................................................... 6 MỤC LỤC............................................................................................................. 8 MỞ ĐẦU............................................................................................................. 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 12 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI BỒ ĐỀ STYRAX (STYRACACEAE) ................... 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 23 2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .......................... 23 2.2.1. Hóa chất, dụng cụ...................................................................................... 23 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 24 2.2.3. Các dòng tế bào ung thư thực nghiệm ...................................................... 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 24 2.3.1. Xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật ............................................................ 24 2.3.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên ............................................... 25 2.3.3. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên ........................................... 26 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ các mẫu thực vật nghiên cứu ..................................................................................... 27 2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro MTT assay................ 30 2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC......................................................................................................... 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 35 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ (STYRAX ANNAMENSIS GUILL.)................................................ 35 3.1.1. Egonol (Hợp chất 1) .................................................................................. 35 3.1.2. Egonoic acid (Hợp chất 2) ........................................................................ 38 3.1.3 Manchicendiol (Hợp chất 3) ...................................................................... 40 3.1.4. Styraxin (Hợp chất 4)................................................................................ 42 8 3.1.5. Vladinol D (hợp chất 5) ............................................................................ 46 3.1.6. Ursolic acid (hợp chất 6)........................................................................... 49 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO LÁ CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ.......................................................................................... . 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN..................................................................................56 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................................................................................................. 57 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 63 9 MỞ ĐẦU Xã hội loài người có mối quan hệ mật thiết với môi trường sống ngay từ thuở sơ khai của loài người, đặc biệt là việc sử dụng các vật trong thiên nhiên làm đồ ăn và thuốc chữa bệnh. Nhiều loài cây hiện hữu trong đời sống hàng ngày ngoài việc sử dụng làm rau ăn, nước uống giải khát... còn góp phần quan trọng trong việc chữa trị nhiều loại bệnh như: tiêu hóa, viêm da dị ứng, tiểu đường, ngoài ra còn chống viêm nhiễm, hỗ trợ điều trị ung thư...Phần lớn các loại thuốc tây y có mặt trên thị trường hiện nay đều dựa vào nguồn gốc những chất dẫn đường là chất có hoạt tính phân lập từ thực vật. Hợp chất thiên nhiên đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc chữa bệnh bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp, thân thiện với môi trường [1]. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện có khoảng 80% dân số thế giới vẫn tin dùng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên, trong đó chủ yếu từ thực vật. Trên thế giới, từ các thảo dược các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới có hoạt tính cao và được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh. Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai hoạt chất Vinblastine và Vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) và Taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae). Cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III, hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư [2,3]. Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa. Có tới ¾ diện tích của cả nước là rừng núi trùng điệp, địa hình chia cắt nên điều kiện khí hậu cũng rất đa dạng với nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng. Những yếu tố đó đã tạo nên điều kiện sinh thái và hệ động thưc vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo ước tính, Việt Nam có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao có mạch trong đó có khoảng hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt nam đã được thực hiện không chỉ mang tính ý nghĩa khoa học và thời sự mà còn có những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng [4]. Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Bồ đề Styrax được thực hiện từ khá sớm vào khoảng năm 1915, cho tới nay, đã có tới hơn 130 hợp chất được phát 10 hiện từ các loài thuộc chi Bồ đề chứa đựng nhiều hoạt tính sinh học thú vị, chủ yếu là các lignan, benzofuran, triterpenoid và các saponin. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Bồ đề Trung Bộ ở Việt Nam và trên thế giới vẫn còn rất hạn chế. Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Nghiên cứu thành phần hóa học của Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.)” nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: -Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ lá cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.). -Đánh giá hoạt tính chống ung thư mô hình invitro của các chất sạch phân lập được NỘI DUNG NGHIÊN CỨU -Thu hái mẫu cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.). -Chiết tách, phân lập các hợp chất từ lá cây Bồ đề Trung Bộ. -Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được. -Thử nghiệm hoạt tính gây độc 4 dòng tế bào ung thư thực nghiệm ở người của các chất sạch phân lập được. 11 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI BỒ ĐỀ STYRAX (STYRACACEAE) Họ Bồ đề Styracaceae bao gồm 11 chi với khoảng 160 loài bao gồm các cây thân bụi hoặc thân gỗ nhỏ phân bố rộng rãi ở khắp các vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới. Theo thống kê, chi Bồ đề Styrax là chi lớn nhất trong họ Bồ đề, bao gồm khoảng 130 loài, chiếm tới 80% tổng số loài của họ Styracaceae. Chi Bồ đề phân bố phổ biến ở các vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới ở Đông Nam Á, Châu Âu và Châu Mỹ [5,6]. Chi Bồ đề hay còn gọi chi an tức (danh pháp khoa học: Styrax) là một chi thực vật có khoảng 100 loài mọc thành bụi rậm hoặc cây nhỏ trong họ Bồ đề (Styracaceae), chủ yếu có nguồn gốc ở các vùng khí hậu ấm tới các vùng nhiệt đới của Bắc bán cầu, chủ yếu ở khu vực đông và đông nam châu Á, nhưng cũng vượt qua đường xích đạo ở Nam Mỹ. Các loài cây này cao từ 2-14 m và có các lá hình trứng mọc luân phiên, sớm rụng hoặc xanh lưu niên dài từ 1-18 cm và rộng từ 2-10 cm. Hoa của chúng rủ xuống, có 5-10 tràng hoa hình thùy màu trắng, tạo thành từ 3-30 hoa trong các chùy hoa dài 5-25 cm thưa hay rậm. Quả là loại quả hạch khô và thuôn dài, trơn không có gân hay các cánh hẹp (hiện diện ở các chi có quan hệ họ hàng là Halesia và Pterostyrax). Các tên gọi phổ biến là bồ đề, an tức hương, chuông tuyết và cánh kiến trắng. Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Bồ đề Styrax ở Việt Nam có 12 loài [7]. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Bồ đề Styrax Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài chi Bồ đề Styrax được thực hiện từ khá sớm vào khoảng năm 1915 khi Osaka lần đầu tiên phân lập được egonol (3) từ chi này. Cho tới nay, đã có tới hơn 130 hợp chất được phát hiện từ các loài thuộc chi Bồ đề chứa đựng nhiều hoạt tính sinh học thú vị, chủ yếu là các lignan, benzofuran, triterpenoid và các saponin...[8] Chi Styrax được biết đến với thành phần nhựa Benzoin, một hỗn hợp chất vòng thơm độc đáo, có nhiều trong thân cây các loài Styrax như Bồ đề trắng (Cánh 12 kiến trắng) S. tonkinense, Bồ đề nhựa (hay Bồ đề vỏ đỏ) S. benzoin và S. paralleloneurum. Chất nhựa này được sử dụng rộng rãi làm thuốc dân gian điều trị các chứng bệnh khác nhau như viêm thanh quản, viêm phế quản, rối loạn đường hô hấp trên, loét, mụn cơm và dị ứng da. Nó cũng được sử dụng làm chất cố định hương trong nước hoa và được dùng làm hương liệu trong mỹ phẩm…[9,10]. Các hợp chất lignan, dẫn xuất norlignan (benzofuran) là các lớp chất chiếm ưu thế ở chi Bồ đề Styrax. Ví dụ như từ loài Styrax officinalis phân lập được bốn benzofuran glycoside [11], sáu benzofuran từ hạt loài Styrax obassia và Styrax officinalis [12,13], 2-Aryl benzofuran từ hạt loài Styrax macranthus [14]. Mười benzofuran từ thân loài Styrax perkinsiae [15]. Từ loài Styrax ferrugineus , đã phân lập được sáu norlignans benzofuran [16] và mười lignans đã được tinh chế từ vỏ thân loài Styrax perkinsiae [17].…Vì vậy, các benzofuran và lignan được coi là những hợp chất tiêu biểu của chi Bồ đề Styrax. Hoạt tính gây độc tế bào Các báo cáo cho thấy, chi Styrax nổi bật với hoạt tính chống ung thư, chủ yếu có được là do lớp chất benzofuran, tritrerpenoid và lignan. Từ hạt của loài Styrax perkinsiae, nhóm tác giả Li (2005) đã phân lập được 4 hợp chất benzofuran mới: benzofuran 5-(3''-hydroxypropyl)-7-hydroxy2-(3',4'-methylenedioxyphenyl) benzofuran (1) và trans -5-(3'''-hydroxypropyl)7-methoxy-2[2',3'-dihydro-3'-hydroxymethyl-7'-methoxy-2'-(3''-methoxy-4''hydroxyphenyl)-benzofuran-5'-yl] benzofuran (2), (E)-5-(2-formylvinyl)-7methoxy-2-(3,4-methylenedioxyphenyl) benzofuran, 5-(3-butanoyloxypropyl)7-methoxy-2-(3,4-methylenedioxyphenyl) benzofuran cùng với 9 hợp chất benzofuran và triterpen đã biết: egonol (3), demethoxyegonol, egonol acetate, demethoxyegonol acetate, egonol glucoside, egonol gentiobioside, egonol gentiotrioside , β-sitosterol và β-daucosterol. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư cho thấy, hai hợp chất benzofuran mới (1) và (2) có hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 với IC50 từ 3.81-15.08 µg/ml [18]. 13 Hai hợp chất benzofuran lignan egonol (3) và homoegonol (4) được tìm thấy ở nhiều loài Styrax. Egonol (3) và homoegonol (4) được phân lập từ thân loài Styrax camporum Pohl. bởi nhóm tác giả Teles (2005). Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp MTT khẳng định egonol (3) có hoạt tính gây độc mạnh dòng ung thư thần kinh (C6), ung thư biểu mô thanh quản Hep-2, với giá trị IC50 lần lượt là 3.2 và 3.6 µg/ml. Trong khi homoegonol (4) là 4.9 và 5.3 µg/ml trên dòng C6 và ung thư cổ tử cung (HeLa) [19]. Nghiên cứu tiếp theo của nhóm tác giả Olivera (2015) cho thấy egonol (3) và homoegonol (4) từ dịch chiết EtOH của loài Styrax camporum, được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp XTT trên các dòng ung thư da (B16F10), ung thư biểu mô tuyến vú (MCF-7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (HepG2) và u nguyên bào sợi thần kinh (MO59J). Kết quả cho thấy dịch chiết EtOH và cả hai hợp chất này đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 từ 9.1 đến 62.2 μg/mL trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Trong đó, hoạt tính mạnh nhất là trên dòng ung thư cổ tử cung (HeLa) và hợp chất egonol thể hiện hoạt tính mạnh hơn homoegonol [20]. Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của vỏ thân loài Styrax japonica cho thấy, cặn chiết metanol (MeOH) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 5 dòng tế bào ung thư: ung thư phổi (A549), buồng trứng (SK-OV-3), ung thư sắc tố da (SK-MEL-2), tử cung (MES-AS) và ung thư đại tràng (HCT-15) [21]. Phân lập và tinh chế các chất sạch từ cặn MeOH thu được một số triterpene như oleanolic aldehyde acetate (5), erythrodiol-3-acetate (6), euphorginol (7) và anhydrosophoradiol-3-acetate (8). Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào cho thấy, hợp chất (5) và (8) có hoạt tính ức chế mạnh các dòng ung thư ung thư phổi (A549), buồng trứng (SK-OV-3), ung thư sắc tố da (SK-MEL-2), ung thư tử cung (MES-AS) và ung thư đại tràng (HCT-15) với IC50 lần lượt từ 5.07 – 9.86 µg/ml và 3.42- 7.81 µg/ml [21]. 14 Hình 1.1: Một số hợp chất gây độc tế bào phân lập từ các loài chi Styrax Nghiên cứu khả năng ức chế phân chia dòng tế bào ung thư máu HL-60 của các triterpenoid phân lập từ nhựa cây Styrax tonkinensis bằng phương pháp khử Nitroblue Tetrazolium (NBT reduction assay) cho thấy, các triterpen: 3β hydroxy-12-oxo-13Hα-olean-28,19β-olide (9), 6β-hydroxy-3-oxo-11α,12α epoxyolean-28,13β -olide (10), axit 3β,6β-dihydroxy-11-oxo-olean-12-en-28-oic (11), 3β,6β-dihydroxy-11α,12α-epoxyolean-28,13β-olide (12), axit 19α- hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic (13), axit 6β-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28oic (14), axit sumaresinolic (15), axit siaresinolic (16) và axit oleanolic (17) có hoạt tính ức chế phân chia dòng tế bào ung thư máu HL-60 với IC50 từ 8,9-99,4 µM trong đó, axit oleanolic (17) là chất có hoạt tính mạnh nhất với IC50 là 8,9 µM, hợp chất (12) ức chế yếu nhất trong số các triterpen trên [22]. 15 Hoạt tính chống oxy hóa Cặn chiết aceton/H2O 70% từ lá loài S. formosanum được đánh giá khả năng chống oxy hóa trên hệ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và gốc hydroxyl. Kết quả cho thấy cặn chiết này có hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH và hydroxyl với IC50 lần lượt là 31.5 µg/ml và 0.3 µg/ml. Xác định hàm lượng phenol tổng theo phương pháp Folin-Ciocalteu cho thấy cặn này có chứa 2.7 mg axit gallic/g cặn chiết khô [23]. Từ dịch chiết quả loài Styrax ramirezii, một loại trái cây được ưa chuộng làm đồ uống ở Mexico, nhóm tác giả Timmers (2015) đã phân lập được 6 hợp chất norneolignan trong đó có 2 hợp chất chính là egonol (3) và homoegonol (4). Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa trên hệ ROS (reative oxygen species) và NO (nitric oxide) cho thấy, trong số 6 norneolignan này thì egonol có hoạt tính mạnh nhất thông qua khả năng làm giảm sự tạo thành các gốc NO ở 0.668±0.108 µM và ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2), enzyme xúc tác phản ứng sinh gốc tự do ROS là 0.553± 0.007 µM [24]. Hình 1.2: Một số hợp chất bẫy gốc tự do phân lập từ chi Styrax Hợp chất lignan: pinoresinol (18) được nhóm tác giả Kakie (1994) phân lập từ loài Styrax japonica. Hợp chất này đã được nhiều công trình công bố có hoạt tính chống oxy hóa, chống cao huyết áp, được sử dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm [25]. Trong một nghiên cứu khác, nhóm tác giả Min (2004a) đã phân lập được một số hợp chất benzofuran và lignan từ vỏ thân của loài Styrax 16 japonica như styraxlignolide B-F (19-23), taraxerol (24), syringin (25) và pinoresinol glucoside (26). Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro cho thấy hợp chất 20 , 21, 22 và 26 có khả năng bẫy gốc tự do DPPH yếu với IC50 lần lượt là 380, 278, 194 và 260 µM. Các hợp chất 19, 23, 24, 25 không có hoạt tính với IC50 > 500 µM do cấu trúc không có nhóm phenolic [26]. Hoạt tính kháng vi sinh vật Dịch chiết thô từ lá loài S. ferrugineus có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm trên các chủng Staphylococcus aureus, Candida albicans , và Cladosporium sphaerospermum với giá trị MIC (minimum inhibition concentration) lần lượt là 200 µg/ml, 800 µg/ml và 750 µg/ml. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá loài này cho thấy, các lignan như egonol (3), homoegonol (4), egonol-β-glucoside (27), homoegonol-β-glucoside (28) và dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (29) có hoạt tính ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn và nấm S. aureus and C. albicans với giá trị MIC trong khoảng 10-20 µg/ml. Tuy nhiên, chỉ có hợp chất 3 và 4 có hoạt tính mạnh với MIC từ 5-10 µg/ml trên chủng C. sphaerospermum [27]. Ngoài ra, hai hợp chất egonol (3), homoegonol (4) cũng được các nhà khoa học Brazin phân lập từ cặn chiết EtOH (EE) của loài Styrax pohlii. Hai hợp chất này cùng với cặn chiết EtOH (EE) và các phân đoạn n-Hexan (HF), EtOAc (EF), n-BuOH (BF), hydromethanolic (HMF) được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên các chủng: Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng. Kết quả cho thấy, cặn chiết EE có giá trị MIC là 400µg/ml trên chủng S. pneumoniae và P. aeruginosa; và 300 µg/ml trên chủng H. influenzae. Hai phân đoạn HF và EF ức chế chủng S. pneumoniae với MIC là 200 µg/ml nhưng chỉ có phân đoạn EF ức chế chủng H. influenzae với MIC là 200 µg/ml. Cả 2 hợp chất egonol (3), homoegonol (4) đều có hoạt tính kháng hai chủng S. pneumonia và P. aeruginosa với giá trị MIC = 400 µg/ml [28]. Hai hợp chất saponin A (30) và saponin B (31) được phân lập từ thân loài Styrax officinalis L. bởi nhóm tác giả Zehavi (1986). Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các hợp chất này trên một số chủng nấm gây bệnh cây cho thấy saponin 17 A có hoạt tính kháng nấm mạnh trên các chủng Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger và Rhizopus mucco với IC50 lần lượt là 3.4; 25; 11.7 và 12 µg/ml, nhưng không kháng chủng Rhizoctonia solani ở nồng độ 80 µg/ml. Hợp chất saponin B có hoạt tính kháng nấm yếu đối với các chủng Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger và Rhizopus mucco ở nồng độ 80 µg/ml [29]. Hình 1.3: Một số hợp chất kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ chi Styrax Một số hoạt tính khác Sự thiếu hụt estrogen có liên quan đến một số bệnh như loãng xương, xơ vữa động mạch, ung thư vú hay Alzheimer. Aromatase cytochrome P450 là enzyme duy nhất được biết đến làm xúc tác cho sự tổng hợp estrogen từ androgens. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme aromatase của một số lignan phân lập từ loài Styrax perkinsiae cho thấy 2 hợp chất là egonol gentiobioside (32) và egonol gentiotrioside (33) có hoạt tính tốt kích thích enzyme aromatase sinh tổng hợp estrogen ở nồng độ 0.1-1µM [30]. Từ thân vỏ loài Styrax obassia một số hợp chất benzofuran đã được phân lập và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên hệ lipopolysaccharide (LPS)- cảm ứng sinh nitric oxide (NO) ở đại thực bào RAW264.7. Hợp chất 2-(3,4- 18 dimethoxyphenyl)-5-(1,3-dihydroxypropyl)-7-methoxybenzofuran (34) cho thấy làm giảm đáng kể nitric oxide (NO) ở nồng độ 1-10µM [31]. Egonol (3) và homoegonol (4) được phân lập từ quả loài Styrax ramirezii Greenm, là loại trái cây được ưa chuộng làm đồ uống bổ dưỡng ở Mexico. cũng có hoạt tính kháng viêm đáng kể khi thử nghiệm trên hệ lipopolysaccharide (LPS)- cảm ứng sinh gốc tự do nitric oxide (NO) ở nồng độ 0.668 ± 0.108µM , trên một số protein đóng vai trò quan trọng trong các quá trình viêm, đau như: interleukin-1β (IL-1β) ở 0.093± 0.005 µM và interleukin-6 (IL-6) ở 0.298 ± 0.076 µM [25]. Hình 1.4: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Styrax Từ cặn chiết EtOAc của vỏ thân loài Styrax japonica S. et Z. sử dụng phương pháp sinh học dẫn đường, nhóm tác giả Kim (2004) đã phân lập được 2 hợp chất lignan mới là styraxjaponoside A (35) và styraxjaponoside B (36), cùng với 3 hợp chất đã biết là matairesinoside (37), egonol-β-glucoside (27) và 19 dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9’-O-glucoside (38). Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống lão hóa da trên hệ enzyme matrix-metalloproteinase (MMP)-1( nhóm enzyme đóng vai trò chính xúc tác quá trình lão hóa da do ánh sáng mặt trời) cho thấy, trong số 5 hợp chất trên thì hợp chất styraxjaponoside B (36) có hoạt tính mạnh ức chế 62.1± 8.3% enzyme (MMP)-1 ở nồng độ 10µM so với mẫu đối chứng không có chất thử. Hoạt tính của styraxjaponoside B (36) tương đương với hoạt tính của chất tham khảo epigallocatechin -3-gallate [32]. Tình hình nghiên cứu trong nước Theo các tác giả Nguyễn Tiến Bân và Phạm Hoàng Hộ, chi Bồ đề có tên khoa học là Styrax ở Việt Nam bao gồm 13 loài: Bồ đề, cánh kiến trắng (S. agrestis L.), Bồ đề Trung Bộ (S. annamensis G.), Bồ đề lá trắng (S. argentifolia H.L.Li.), Tông chi thái lan (S. benzoides C.), Bồ đề nhựa (S. benzoin D.), Bồ đề trung quốc (S. chinensis H.H.), Bồ đề dạng cù đèn (S. crotonoides C. B.), Bồ đề finlayson (S. finlaysonianus W.), Bồ đề ngọc pan (S. hainanensis. F.C.), Bồ đề lá bời lời (S. litseoides J.E.), Bồ đề lông nâu (S. rufopilosus B.S.), Bồ đề răn (S. serrulatus Roxb.), Bồ đề trắng (S. tonkinensis P.). Các loài Bồ đề phân bố rộng rãi khắp các vùng khí hậu của đất nước, từ Hà Giang, Tuyên Quang, Thanh Hóa vào tới Ninh Thuận, Khánh Hòa [7,33]. Các loài Bồ đề được biết đến tác dụng làm thuốc dân gian chữa nhiều chứng bệnh khác nhau như viêm thanh quản, viêm phế quản, rối loạn đường hô hấp trên, loét, mụn cơm và dị ứng da. Thành phần hoạt chất chính là nhựa Benzoin phổ biến và đặc trưng có trong thân cây của các loài: Bồ đề trắng (S. tonkinensis) và Bồ đề nhựa (S. benzoin). Benzoin còn được sử dụng làm chất cố định hương trong nước hoa và được dùng làm hương liệu trong mỹ phẩm dưới tên gọi nhựa cánh kiến [7,35]. Cho tới nay, đã có một vài loài Styrax được quan tâm nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học ở Việt Nam. Từ dịch chiết từ quả loài Cánh kiến trắng (Styrax agrestis) thu hái ở Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc của 13 hợp chất benzofuran (39-53), trong đó có 3 chất mới là egonol9(Z),12(Z) linoleate (39), 7-demethoxyegonol-9(Z),12(Z) linoleate (40) và 7demethoxyegonol oleate (42). Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) cho thấy 4 hợp chất (39-42) có hoạt tính ức chế mạnh 20