Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm thượng hoàng (phellinus linteus)

i HỌ VÀ TÊN TÁC GIẢ LUẬN VĂN: NGUYỄN THỊ HẰNG BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Hằng CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN CHÌM NẤM THƢỢNG HOÀNG (Phellinus linteus) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NĂM TỐT NGHIỆP: 2021 Hà Nội - 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Hằng NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN CHÌMNẤM THƢỢNG HOÀNG (Phellinus linteus) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 842 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Thị Minh Huyền Hà Nội - Năm 2021 iii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hằng iv Lời cảm ơn Để thực hiện và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ chân thành và quý báu của các thầy cô, anh chị em, bạn bè và đồng nghiệp. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Thị Minh Huyền đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới tập thể thực hiện Đề tài: ”Nghiên cứu công nghệ sản xuất sinh khối nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) và ứng dụng để sản xuất thực phẩm chức năng”, mã số ĐT.04.18/CNSHCB do Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam chủ trì, Bộ Công thương là Cơ quan quản lý đã hỗ trợ kinh phí và các trang thiết bị cho nghiên cứu này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ Viện công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ và có những đóng góp quý báu cho tôi trong thời gian nghiên cứu. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp - những người đã luôn động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học này. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự chỉ dẫn, giúp đỡ và đóng góp ý kiến của các nhà khoa học, của quý thầy cô, các cán bộ quản lý và các bạn đồng nghiệp. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Hằng v MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ............................................................................................................. iii Lời cảm ơn ................................................................................................................ iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ................................................................ ix MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài: ...................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu:................................................................................ 3 3. Nội dung nghiên cứu: ................................................................................ 3 4. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài: .......................................... 3 5. Những đóng góp của luận văn: ................................................................. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................................5 1.1. KHÁI QUÁT VỀ NẤM THƢỢNG HOÀNG ....................................... 5 1.1.1.Thành phần hóa học có trong nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus - PL)........................................................................................................... 8 1.1.2. Hoạt tính của nấm Thƣợng Hoàng ................................................ 10 1.2. KHÁI NIỆM VỀ ĐỘNG HỌC CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN ......... 13 1.2.1. Phân loại của Gaden ...................................................................... 13 1.2.2. Phân loại của Deindorfer............................................................... 14 1.2.3. Phân loại lên men theo sản phẩm .................................................. 14 1.3. LÊN MEN NẤM THƢỢNG HOÀNG ................................................ 16 1.3.1. Lên men dịch thể ........................................................................... 16 1.3.2. Lên men theo mẻ của nấm TH ...................................................... 17 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men nấm TH ................... 17 1.4. ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN ..................................................... 18 1.3.1. Khái quát độc tính bán trƣờng diễn............................................... 18 1.3.2. Tính bền vững trong môi trƣờng của độc chất .............................. 19 1.3.3. Đặc tính của quá trình tích lũy sinh học ....................................... 19 1.3.4. Thử nghiệm về độc tính bán trƣờng diễn ...................................... 21 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................23 vi 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 23 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 23 2.1.2. Máy móc thiết bị ........................................................................... 25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 26 2.2.1. Phƣơng pháp nhân giống nấm, cấy chuyển giống nấm và lên men ................................................................................................................. 26 2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sinh khối tƣơi ......................... 28 2.2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sinh khối khô ......................... 28 2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng khử ................................................ 28 2.2.5. Phƣơng pháp xác định độc tính bán trƣờng diễn .......................... 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................32 3.1. NHÂN GIỐNG NẤM THƢỢNG HOÀNG VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÊN MEN CHÌM TẠO SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG 32 3.2. QUY TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG QUY MÔ 100 LÍT/MẺ ............................................................................... 34 3.2.1. Các bƣớc trong quy trình .............................................................. 34 3.2.2. Kết quả thực hiện quy trình........................................................... 40 3.3. ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG THEO MẺ CỦA CHỦNG SẢN XUẤT ...................................... 43 3.3.1. Hàm lƣợng sinh khối tƣơi ............................................................. 43 3.3.2. Kết quả đo pH ............................................................................... 44 3.3.3. Hàm lƣợng sinh khối khô .............................................................. 45 3.3.4. Hàm lƣợng đƣờng khử .................................................................. 46 3.3.5. Động thái sinh trƣởng của nấm Thƣợng hoàng ............................ 47 3.3.6. Tiểu kết.......................................................................................... 48 3.4. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA CHẾ PHẨM BỘT SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG TRÊN THỎ THÍ NGHIỆM ..................................................................................................................... 49 3.4.1. Tình trạng thỏ ................................................................................ 50 3.4.2. Các chỉ số huyết học liên quan tới chức năng tạo máu, sinh hóa liên quan tới chức năng gan, thận và chỉ số glucose trong huyết tƣơng . 51 3.4.3. Quan sát đại thể ............................................................................. 55 3.4.4. Quan sát vi thể ............................................................................... 55 3.4.5. Tiểu Kết ......................................................................................... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................59 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Nghĩa tiếng việt g/L Gram / Lít L Lít Dextrose Môi trƣờng thạch khoai tây để nuôi cấy vi sinh vật PDA Potato Agar PGA Potato Glucose Agar Môi trƣờng thạch khoai tây để giữ giống Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ PL PLP Phellinus linteus Tên khoa học của nấm Thƣợng hoàng Polysaccaride đƣợc Phellinus linteus. phân lập từ viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1: Thành phần môi trƣờng lên men lỏng ........................................... 23 Bảng 2. 2: Thành phần môi trƣờng tối ƣu (MTTƢ) ....................................... 24 Bảng 2. 3: Thành phần môi trƣờng bổ sung.................................................... 24 Bảng 2. 4: Kết quả thu đƣợc khi lập đƣờng chuẩn với glucose ...................... 28 Bảng 2. 5: Các mức liều thử nghiệm bán trƣờng diễn trên thỏ ....................... 30 Bảng 3. 1: Thông số kỹ thuật trong quá trình lên men quy mô 100l/mẻ ........ 36 Bảng 3. 2: Kết quả thực hiện quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm Thƣợng hoàng (quy mô bình lên men 100 lít/mẻ) .......................................... 40 Bảng 3. 3: Chỉ tiêu sau khi sấy........................................................................ 43 Bảng 3. 4: Kết quả theo dõi cân nặng của thỏ ở các giai đoạn nghiên cứu .... 50 Bảng 3. 5: Kết quả xét nghiệm các chỉ số huyết học trƣớc và sau nghiên cứu ......................................................................................................................... 51 Bảng 3. 6: Kết quả xét nghiệm các chỉ số liên quan đến chức năng gan trƣớc và sau nghiên cứu ............................................................................................ 52 Bảng 3. 7: Kết quả xét nghiệm các chỉ số liên quan đến chức năng thận trƣớc và sau nghiên cứu ............................................................................................ 54 Bảng 3. 8: Kết quả xét nghiệm chỉ số glucose trƣớc và sau nghiên cứu ........ 54 ix DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1. 1: Nấm Phellinus linteus trong tự nhiên. Hình bên trái là quả thể nấm đã đƣợc thu hoạch, hình bên phải là quả thể nấm mọc trên cây gỗ lâu năm .... 5 Hình 2. 1. Bình sục 5L .................................................................................... 27 Hình 2. 2: Đồ thị đƣờng chuẩn của glucose trong phản ứng DNS. ................ 29 Hình 3. 1: Hình ảnh nấm đƣợc nuôi cấy trên đĩa petri trong môi trƣờng thạch khoai tây…………………………………………………………………......32 Hình 3. 2: Hình ảnh sợi nấm phát triển trong môi trƣờng lỏng ...................... 32 Hình 3. 3: Hình ảnh sợi nấm dƣới kính hiển vi............................................... 33 Hình 3. 4: Hình ảnh nấm TH phát triển trên môi trƣờng thạch và môi trƣờng lỏng .................................................................................................................. 33 Hình 3. 5: Sinh khối nấm Thƣợng hoàng ........................................................ 34 Hình 3. 6: Sơ đồ quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối nấm TH trên quy mô bình lên men 100l/mẻ ......................................................................... 39 Hình 3. 7: Đồ thị tƣơng quan giữa hàm lƣợng sinh khối tƣơi của sợi nấm theo thời gian sinh trƣởng ....................................................................................... 44 Hình 3. 8: Đồ thị tƣơng quan giữa độ pH môi trƣờng theo thời gian sinh trƣởng của sợi nấm .......................................................................................... 45 Hình 3. 9: Đồ thị tƣơng quan giữa lƣợng sinh khối nấm theo thời gian sinh trƣởng của sợi nấm .......................................................................................... 46 Hình 3. 10: Đồ thị tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng khử của môi trƣờng và thời gian của quá trình lên men. ...................................................................... 47 Hình 3. 11: Đồ thị tổng hợp của quá trình sinh trƣởng của sợi nấm với các yếu tố liên quan đến sinh trƣởng sợi nấm. ............................................................. 48 Hình 3. 12: Hình ảnh đại thể các cơ quan nội tạng. ........................................ 55 Hình 3. 13: Hình ảnh giải phẫu mô bệnh học của gan .................................... 56 Hình 3. 14: Hình ảnh giải phẫu mô bệnh học của thận. .................................. 57 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài: Việt Nam chúng ta nằm trên một địa hình khí hậu trải dài từ Bắc vào Nam với nhiều điều kiện khí hậu và chủ yếu là nhiệt đới gió mùa. Do đó các nguồn tài nguyên sinh vật của chúng ta rất phong phú và đa dạng. Việc sử dụng các loại thảo dƣợc trong phòng và điều trị bệnh đã đƣợc sử dụng từ lâu. Trong các loại dƣợc liệu, nấm Thƣợng hoàng đƣợc biết tới nhƣ là loại thảo dƣợc quý đƣợc vua chúa sử dụng nhƣ thực phẩm bổ sung dinh dƣỡng nhằm nâng cao sức khoẻ, đồng thời sử dụng nhƣ một loại dƣợc liệu quý trong điều trị bệnh. Nấm Thƣợng hoàng hay còn gọi là Nấm hoàng sơn (sang hwang) có tên khoa học là Phellinus linteus, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus. Nấm Thƣợng hoàng có màu vàng, mọc tự nhiên trên cây dâu tằm, cây sồi, cây hạt dẻ, cây keo, hoặc thân cây sồi của cây lá rộng. Đây là các loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trƣớc. Nấm Thƣợng hoàng mọc ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm. Hiện nay, nguồn nấm Thƣợng hoàng có nguồn gốc từ bốn nƣớc là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và Thái lan, tuy nhiên, sản lƣợng nấm không cao do việc nuôi trồng tƣơng đối khó. Tại Việt Nam, nguồn nấm Thƣợng hoàng cũng đã đƣợc nhập về từ nhiều nƣớc đặc biệt là Hàn Quốc và với giá bán khoảng 4 triệu đến 10 triệu đồng/kg, cao hơn nấm Linh chi. Nấm Thƣợng hoàng là một loại nấm quý trong tự nhiên đã đƣợc ngƣời Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị, tăng cƣờng khả năng của hệ thống miễn dịch, giúp giảm lƣợng cholesterol và đƣờng trong máu ... Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu xác định các đặc tính quý của loại nấm này đƣợc áp dụng trong phòng và điều trị bệnh nhƣ tác dụng điều hòa miễn dịch, kháng viêm, kháng ung thƣ và kháng oxy hóa. Ngoài ra, nấm Thƣợng hoàng còn đƣợc biết có nhiều tác dụng khác nhƣ nâng cao trí nhớ ở ngƣời già, giảm viêm, giảm đau, giảm căng thẳng, mệt mỏi... Trƣớc đây, nhân nuôi sinh khối nấm Thƣợng hoàng cũng nhƣ các loại nấm sợi khác đƣợc tiến hành nuôi trồng trên thân gỗ và các giá thể, thực chất 2 là thực hiện lên men trên môi trƣờng xốp (hay còn gọi là môi trƣờng bán rắn). Việc nuôi trồng nấm sợi trên thân gỗ và các giá thể mất rất nhiều công sức và đặc biệt là thời gian. Trong ngành công nghiệp dƣợc phẩm ngày nay, do nguồn nguyên liệu tự nhiên đã cạn kiệt bởi sự khai thác quá mức của con ngƣời, ngƣời ta đã đầu tƣ và thực hiện trồng trọt hoặc sản xuất các loại nguyên liệu để chủ động phục vụ, nâng cao sức khỏe, giúp kéo dài cuộc sống của con ngƣời. Trong đó có một số loại nấm dƣợc liệu quý đã đƣợc sản xuất ở dạng lên men sinh khối nhƣ: Nấm linh chi Ganoderma lucidum đƣợc lên men chìm để sản xuất polysaccharide và ganoderic acid [1], đông trùng hạ thảo Cordyceps với các hoạt chất cordycepin có chức năng phòng chống u xơ, tiền ung thƣ và adenosin là thuốc điều trị trong tim mạch. Ngoài ra, Năm 2003, Hye - Jin Hwang cũng đã nghiên cứu thành công trong việc tạo sinh khối nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus) bằng công nghệ lên men chìm [2]. Hiện tại, nấm Thƣợng hoàng đƣợc bán tại Việt Nam chủ yếu là dƣới dạng quả thể và nhập khẩu từ Hàn Quốc. Giá của nấm Thƣợng hoàng đắt gấp 3 đến 4 lần so với nấm Linh chi đƣợc trồng và thu hoạch theo cùng một thời gian. Việc nghiên cứu để trồng nấm Thƣợng hoàng tại Việt Nam đã bắt đầu từ những năm 2010, với nghiên cứu của một nhóm cán bộ tại Trung tâm nghiên cứu linh chi và nấm dƣợc liệu, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nhóm đã công bố về việc tạo ra quả thể của nấm Thƣợng hoàng trên giá thể mùn cƣa. Thời gian cho thu hoạch quả thể là 9 tháng, rút ngắn hơn nhiều so với thời gian trồng nấm trên khúc gỗ là 2 đến 3 năm. Nhƣ tại Hàn Quốc, đất nƣớc đi đầu về công nghệ trồng nấm Thƣợng hoàng phải mất từ 2 đến 3 năm trồng trên giá thể là các khúc gỗ để thu hoạch đƣợc quả thể nấm có giá trị thƣơng phẩm khi đƣa ra thị trƣờng. Nhƣ vậy việc nuôi trồng nấm trên giá thể sẽ kéo dài hơn rất nhiều so với khi nuôi chúng trong môi trƣờng lỏng. Ngoài ra, nấm Thƣợng hoàng thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ thấp, ở vùng rừng núi cao, do đó khí hậu nóng vào mùa hè của Việt Nam sẽ làm cho nấm chậm hoặc không phát triển đƣợc. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus)”, nhằm rút ngắn thời gian nhân nuôi và chủ động đƣợc các điều kiện nuôi nấm tại Việt Nam nhằm tạo ra lƣợng sinh khối của nấm cho các ứng 3 dụng khác. 2. Mục đích nghiên cứu: Xây dựng quy trình lên men sinh khối nấm Thƣợng hoàng ở quy mô bình lên men 100 lít và đánh giá độc tính bán trƣờng diễn của bột sinh khối nấm Thƣợng hoàng thu đƣợc từ lên men chìm. 3. Nội dung nghiên cứu: + Nhân giống nấm Thƣợng hoàng và nghiên cứu khả năng lên men chìm của giống nấm Thƣợng hoàng. + Xây dựng quy trình lên men chi tiết cho từng bƣớc lên men sinh khối nấm Thƣợng hoàng từ bình tam giác đến bình lên men 100 lít. + Xác định động học của quá trình lên men sinh khối nấm Thƣợng hoàng. + Đánh giá độc tính bán trƣờng diễn của bột sinh khối nấm Thƣợng hoàng trên thỏ thí nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài: * Ý nghĩa khoa học : Góp phần tạo giống nấm Thƣợng hoàng trong phòng thí nghiệm và nghiên cứu khả năng phát triển của nấm trong môi trƣờng lỏng, tạo ra nguồn nguyên liệu một cách chủ động thay vì trông chờ vào nguồn nấm thiên nhiên. * Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho ngành công nghiệp dƣợc phẩm, góp phần tạo ra nguồn nguyên liệu, dƣợc liệu quý dùng để sản xuất các sản phẩm, thực phẩm chức năng giúp nâng cao sức khỏe của ngƣời dân với giá thành rẻ hơn mua từ nƣớc ngoài. Sản phẩm sinh khối thu đƣợc cũng sẽ đƣợc nghiên cứu để tạo ra các sản phẩm ứng dụng nhƣ bột sinh khối hòa tan uống liền hoặc trà túi lọc. 5. Những đóng góp của luận văn: Đề tài nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thƣợng hoàng là một hƣớng nghiên cứu mới tiếp cận cho nấm Thƣợng hoàng tại Việt Nam so với 4 các phƣơng thức nhân nuôi ở dạng quả thể. Ƣu điểm của nghiên cứu là có thể chủ động đƣợc điều kiện nuôi cấy trong các bình lên men và nhân nuôi tập trung, không tốn nhiều diện tích cũng nhƣ không phá hoại môi trƣờng sinh thái do việc tìm kiếm nấm trong tự nhiên có thể gây ra. Việc thu sinh khối trong môi trƣờng lỏng ở các bình lên men lớn có ƣu thế hơn do chủ động tạo điều kiện tốt nhất cho nấm phát triển. 5 Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ NẤM THƢỢNG HOÀNG Nấm Thƣợng Hoàng ở Việt Nam còn đƣợc gọi là Hoàng Sơn là tên chỉ các loài gần nhau trong chi Phellinus, họ Hymenochaetaceae gồm các loài Phellinus linteus, P. igniarius, P. baumi, P.robustus, P. pinii. Nấm Thƣợng hoàng (tên khoa học là Phellinus linteus - PL) là một loại “nấm Thƣợng hoàng thuốc” (medicinal mushroom) đƣợc sử dụng ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa bệnh rối loạn chức năng dạ dày ruột, tiêu chảy, xuất huyết và ung thƣ [3]. Chiết xuất của nấm này đã đƣợc sử dụng trong nhiều thế kỷ trong y học Phƣơng Đông và nấm Thƣợng Hoàng đƣợc coi là loài nấm Thƣợng hoàng thần dƣợc, có sức mạnh trẻ hóa và kéo dài tuổi thọ. Nấm Thƣợng hoàng có nguồn gốc chủ yếu từ châu Mỹ, châu Phi và Đông Á và nó đặc biệt phong phú và đƣợc sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nƣớc châu Á khác. Ở Trung Quốc, nấm đƣợc gọi là Song-gen; ở Hàn Quốc, nấm đƣợc gọi là Sang-hwang và ở Nhật Bản nấm đƣợc gọi là Meshimakobu. Loại nấm này có màu vàng cam, sinh trƣởng trên các cây họ dâu tằm, là một loại nấm rất nổi tiếng trong chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae. Chi Phellinus gồm một số loài đã đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ, tiểu đƣờng, nhiễm khuẩn, virus và loét nhƣ P. linteus, P. ribis, và P. igniarius [3, 4]. Hình 1. 1: Nấm Phellinus linteus trong tự nhiên. Hình bên trái là quả thể nấm đã đƣợc thu hoạch, hình bên phải là quả thể nấm mọc trên cây gỗ lâu năm [5] Phellinus linteus là các loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trƣớc (Hình 1.1). Nấm Thƣợng hoàng mọc ở 6 những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm. Đây là một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc có lịch sử 2000 năm. Trƣớc đây việc khai thác loại nấm này chủ yếu chỉ dựa vào việc khai thác ngoài tự nhiên nên có khả năng dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng. Trên thế giới đã có 4 nƣớc trồng thành công loài nấm dƣợc liệu này là Trung quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Thái Lan. Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học của nấm Thƣợng hoàng và đã ứng dụng để nuôi trồng đƣợc thành công thể quả. Ở Hàn Quốc phƣơng pháp nuôi trồng truyền thống phổ biến là cấy giống nấm vào các khúc gỗ, cung cấp các điều kiện môi trƣờng thích hợp. Sau khi hệ sợi nấm lan ra thì treo các khúc gỗ lên cao hoặc đặt dƣới mặt đất để nấm mọc ra và thời gian có thể thu đƣợc nấm từ 2 - 3 năm. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là môi trƣờng nuôi trồng là khá tự nhiên, gần với môi trƣờng phát triển của nấm ngoài tự nhiên. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là thời gian để có thể thu hoạch đƣợc nấm là khá dài, tốn diện tích nuôi trồng. Bên cạnh đó việc đặt khúc gỗ ở dƣới đất thì dễ bị mối mọt, côn trùng, nấm bệnh xâm nhập phá hủy. Nếu đặt lên cao thì gỗ dễ bị mất nƣớc, vì vậy cần phải chú ý cung cấp nƣớc thƣờng xuyên. Năm 2003, Hye-Jin Hwang [6] đã nghiên cứu phƣơng pháp nuôi chìm Phellinus linteus KCTC 6190 trong môi trƣờng lỏng và lƣợng sinh khối lớn nhất nhận đƣợc là 11 g/l và lƣợng exopolysaccharide tƣơng ứng lớn nhất là 3,3 g/l. Năm 2006, Woo-Sik Jo [7] đã tìm điều kiện nuôi cấy để phát triển hệ sợi của các loài Phellinus linteus, Phellinus baumii, Phellinus gilvus thuộc chi Phellinus đƣợc bảo quản trong môi trƣờng thạch PDA và kiểm tra khả năng phát triển trên 12 môi trƣờng khác nhau đã đƣợc sử dụng để kiểm tra khả năng phát triển của các loài nấm trên. Kết quả đƣợc đánh giá dựa trên việc đo vòng sinh trƣởng của sợi nấm trên đĩa thạch cho thấy, đối với Phellinus linteus, các thành phần môi trƣờng tối ƣu gồm có nguồn carbon là tinh bột, nguồn nitơ là cao chiết malt, tỉ lệ C/N là 10/1, vitamin là thiamin-HCl, acid hữu cơ là succinic acid, muối khoáng là MgSO4.7H2O. Năm 2008, June Woo Lee [8] cũng đã tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi chìm của chủng Phellinus linteus IY003 đƣợc nuôi ban đầu trong môi trƣờng PDA và sau đó chuyển sang môi trƣờng nhân giống ở thể lỏng trong bình nón ở 28oC; nguồn carbon, nitơ, pH 7 ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, tốc độ lắc, sự thông khí đƣợc kiểm tra trong nghiên cứu này. Với thành phần môi trƣờng và điều kiện lên men tối ƣu, sinh khối sợi nấm đạt cao nhất trong bình lên men 5 lít là 29,9 g/l và hàm lƣợng polysaccharid khô đƣợc chiết bằng nƣớc nóng từ môi trƣờng nuôi cấy nấm P. linteus IY003 là 5,4 g/l [8]. Nhƣ vậy, với việc lên men chìm, ngƣời ta có thể thay đổi dễ dàng các thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng nhằm mục đích kích thích PL tạo ra hoạt chất có ích mong muốn. Ở Việt Nam ngày 7/4/2009 Ths.Cổ Đức Trọng của trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dƣợc liệu TP.HCM đã công bố trồng thành công nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus) trên mùn cƣa cây cao su đầu tiên tại Việt Nam với nguồn giống hoang dại đƣợc thu thập tại TP.HCM. Với phƣơng pháp này có thể hạn chế đƣợc các nhƣợc điểm trƣớc đó của phƣơng pháp cấy giống trên gỗ khúc. Chẳng hạn nhƣ thời gian thu hoạch rút ngắn hơn chỉ còn tầm 9 tháng, tận dụng đƣợc tối đa diện tích nuôi trồng, không bị các tác nhân bất lợi xâm hại, dễ phối trộn dinh dƣỡng nuôi trồng. Việc nghiên cứu nhân nuôi nấm TH ở thể lỏng tại nƣớc ta đƣợc đƣa ý tƣởng từ năm 2013 và đến năm 2014, 2015 bắt đầu đƣợc thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học và Trƣờng Đại học Công nghiệp Hà Nội với đề tài cấp cơ sở của Viện và cấp Bộ của Bộ Công Thƣơng tại Trƣờng. Trong nghiên cứu này, nhóm thực hiện đề tài đã đánh giá sơ bộ khả năng thích nghi của sợi nấm từ môi trƣờng thạch rắn sang môi trƣờng lỏng. Chọn đƣợc một giống nấm có khả năng thích nghi và phát triển tốt trong môi trƣờng lỏng. Nghiên cứu cũng đã chọn ra đƣợc thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu nhất cho sợi nấm phát triển. Với thời gian 15 ngày cho một mẻ lên men có lƣợng giống tiếp vào là 5%, thu đƣợc một lƣợng sinh khối ~15gam sinh khối khô/lít môi trƣờng. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã gửi đi phân tích tại Trung tâm Kiểm nghiệm của Viện Thực phẩm chức năng (Trung tâm Kiểm nghiệm này đã đạt chuẩn Quốc tế ISO/IEC 17025:2005 và chứng nhận VILAS 448 về chất lƣợng) và chứng minh đƣợc sợi nấm đƣợc nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng có các hoạt chất hữu ích nhƣ hispidin (6,79 ng/g sinh khối tƣơi), acid ellagic (2,68mg/100 g sinh khối tƣơi), polysaccharide (0,34%). Hispidin, acid ellagic và polysaccharide đều đã đƣợc tìm thấy trong sinh khối của sợi nấm. Ngoài 8 ra, trong dịch môi trƣờng sau khi lọc riêng sợi nấm cũng tìm thấy acid ellagic và polysaccharide (nhỏ hơn so với trong sợi nấm khoảng từ 6-10 lần). Nhƣ vậy, để thu đƣợc tối đa các hợp chất này thì không có thành phần nào của nấm và môi trƣờng dinh dƣỡng phải bỏ đi. Ngay cả dịch môi trƣờng sau khi đã lọc riêng sợi nấm cũng có thể cô đặc để sử dụng tách chiết các hợp chất hữu ích cho sức khỏe của con ngƣời. Tuy ở kết quả nghiên cứu này hàm lƣợng các chất trên còn khiêm tốn nhƣng đã cho thấy sợi nấm có giá trị dƣợc liệu và có tiềm năng ứng dụng tạo các sản phẩm thực phẩm chức năng hữu ích [9]. Ngoài ra, đề tài cấp cơ sở của Viện Công nghệ sinh học kết thúc năm 2015 cũng đã cho kết quả: Tìm đƣợc một giống nấm có 99% tƣơng đồng với chủng nấm Phellintus linteus; có hispidin, hypholomine trong mẫu dịch chiết; và thử nghiệm khả năng ức chế enzyme neuraminidase của dịch chiết từ dịch lên men và sợi nấm, cho thấy tiềm năng tạo thuốc thử nghiệm chống virus cúm từ sản phẩm của đề tài [10]. Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu chú trọng đến các chất có hoạt tính sinh học [4, 11] và xác định cũng nhƣ phân lập các thành phần có hoạt tính sinh học, chức năng kháng u và các cơ chế dƣợc lý của nấm Thƣợng hoàng [3, 11-12]. Ngoài ra, nấm Thƣợng hoàng còn đƣợc chứng minh có các hoạt tính nhƣ chống thoái hóa thần kinh, chống tiểu đƣờng, kháng viêm, kháng u, chống dị ứng, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan và các hoạt tính dƣợc lý khác. 1.1.1.Thành phần hóa học có trong nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus - PL) Trong nhiều thập kỷ qua một số lƣợng lớn các thành phần hóa học đã đƣợc phân lập từ PL. Trong đó polysaccharide là thành phần hóa học chính và cũng là thành phần mang hoạt tính sinh học chính trong việc phòng chống ung thƣ của PL. Ngoài ra còn có một số nhóm chất khác bao gồm flavone, coumarin, ergosterol, axit agaricic, axit béo, triterpen, axit thơm, axit amin, xyloza oxyase, urease, catalase, este, sucse, enzyme cellulase [13]. PL ký sinh ở các cây khác nhau thì sẽ cho thành phần và nồng độ của các hợp chất khác nhau. Mặt khác thành phần hóa học trong thể quả và sợi nấm cũng có sự khác biệt [13]. 9 1.1.1.1. Polysaccharide Trong thể quả, polysaccharide là thành phần chính và hầu hết trong số chúng là heteropolysaccharide. Mannose, galactose, glucose, fructose, xyloza là các monosaccharide chính có trong thể quả [6]. Hwang và cộng sự [6] đã phân lập ba exopolysacarit mà chủ yếu bao gồm mannose, galactose và glucose từ nuôi cấy chìm KCTC 6190 của PL. Lee và cộng sự [14] đã báo cáo một số heteropolysacarit-protein phức chất thu đƣợc từ sợi nấm PL. Monosacarit bao gồm glucose, mannose, arabinose và xyloza là thành phần chính của sợi nấm và axit aspartic, axit glutamic, glycine và alanine là các hợp chất nhỏ [14]. Polysacarit trong thể quả của PL đã đƣợc chứng minh là có cấu tạo đa dạng đƣợc phân biệt với các nguồn khác nhau. 1.1.1.2. Flavones, pyranones và furans Có 35 flavones, pyranones và furan đã đƣợc tách ra từ PL. Trong số đó, bốn flavones (phellectrins A và B cũng nhƣ meshimakobnol A và B [14-17]), 15 pyranones (phellectridimer A, phellectridin A - J, baumin, phellinin C cũng nhƣ phellinin B1 và B2 ) và 5 furan (phellinusfrans A và B, phellifuropyranone A, phellinstatin cũng nhƣ phelliusin A [18, 19-22] ) đƣợc phân lập làm đặc tính các thành phần của PL. Mo và cộng sự [23] lần đầu tiên cô lập 7 flavones bao gồm naringenin, sakuranetin, aromadendrin, folerogenin, eriodictyol coumarin và scopoletin từ PL. Các sắc tố polyphenol của PL chủ yếu là pyranone bao gồm hispidin và benzopyrone. Ngoài ra, một styrylpyrone mới, phellinin B và phellinin C cũng đã thu đƣợc và phellinin B đƣợc báo cáo là một hợp chất của phellinin B1 và phellinin B2 [24]. Một số furan cũng đƣợc báo cáo là tồn tại trong PL theo một số nghiên cứu gần đây. Hai dẫn xuất furan stereomeric phellinusfurans A và B, phelliusin A cũng nhƣ inotilone cũng đƣợc báo cáo [25]. 1.1.1.3. Terpenes và steroids Theo một số báo cáo gần đây, một số terpen bao gồm Sesquiterpenes, ditepenes và triterpenes là tách khỏi thể quả của PL. Mƣời một terpen (gilvsins A-D, igniarens A-D và phellilins A-C ) cũng nhƣ ba steroid (phellinignincisterol A-C [26-28] đƣợc đặc trƣng nhƣ là thành phần đặc biệt của PL. Trong năm 2009, bốn loại lanostane-triterpenoids gilvsins A-D cùng 10 với hai hợp chất đã biết 24-methylenelanost-8-ene-3β, 22-diol và 5α-ergosta7, 22-diene-3-one đã đƣợc tìm thấy trong thể quả của Phellinus gilvus[29]. Ngoài ra, ba Sesquiterpenes mới bao gồm phellilins A - C đƣợc phân lập từ chiết xuất ethanol của sợi nấm nuôi cấy PL [30]. 1.1.1.4. Các hợp chất khác Ngoài các thành phần trên, một loạt các hợp chất khác cũng đƣợc tìm thấy ở PL. Mƣời hai hợp chất điển hình đƣợc phân tách và xác định trong PL bao gồm phellinin A1, A2phellibaumin A-E, methyl-phellectrins A và B cũng nhƣ isomethyl-phellectrins A và B. Samchai và cộng sự [31] đã nghiên cứu phần dichloromethane của PL và làm sáng tỏ hai dẫn xuất indole bao gồm 7metoxyindole-3-carboxylic axit este metyl, 1-methylindole-3-carboxaldehyd và một hợp chất phenolic (E)-4-(3, 4-dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one dựa trên phân tích phổ NMR và dữ liệu phổ khối. Hai phellinin styrylpyrones mới A1 và A2 đƣợc phân lập từ môi trƣờng nuôi cấy của Phellinus sp. KACC93057P. Wu và cộng sự [31] trƣớc tiên cô lập và xác định 11 hợp chất mới, và đặt tên chúng là phellibaumin A-E, methyl-phellectrins A và B, isomethyl-phellectrins A và B, (22E, 24R) -6β-oxethyl-ergosta-7, 22-diene3β, 5α-diol và (22E, 24S) -6β-oxethyl-ergosta-7-ene-3β, 5α-diol từ Phellinus baumin. 1.1.2. Hoạt tính của nấm Thƣợng Hoàng Giống nhƣ các loại dƣợc liệu y học cổ truyền khác ở châu Á, tác dụng của PL đƣợc chứng minh chủ yếu dựa vào y học thực nghiệm và chƣa cung cấp đƣợc bất cứ số liệu nào về thành phần chức năng nào hỗ trợ cho y học lâm sàng. Đối với y học phƣơng Tây là một hệ thống y tế chỉ dựa trên các bằng chứng khoa học vì vậy cần chứng minh đƣợc các tác dụng kỳ diệu của PL bằng các số liệu khoa học. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh đƣợc rằng PL đóng vai trò quan trọng việc cải thiện và nâng cao sức khỏe con ngƣời. PL thực hiện vai trò này là nhờ các thành phần mang hoạt tính sinh học bao gồm: polysacarit, triterpenoids, polyphenol và pyrans. Dựa vào các nghiên cứu về dƣợc tính của PL thì PL đƣợc cho rằng có dƣợc tính về nhiều mặt bao gồm chống viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng virus, thuốc trị đái tháo đƣờng, bảo vệ gan, bảo vệ thần kinh, đặc 11 biệt một công dụng to lớn là chống ung thƣ đã đƣợc chứng minh từ nhiều nghiên cứu thực nghiệm về dƣợc tính của nó. Trong số đó polysaccarides và β-glucan polymers đƣợc coi là một trong những chất quan trọng nhất và là một đối tƣợng tiềm năng để phát triển các loại thuốc chống ƣng thƣ mới có nguồn gốc từ tự nhiên. Trong khi đó polyphenol của PL có đóng góp đáng kể về mặt chống ung thƣ. 1.1.2.1. Tác dụng hạ đường huyết Theo một số nghiên cứu, các hợp chất có nguồn gốc tƣ tự nhiên có hiệu quả chống tiểu đƣờng rất tốt. Nấm dƣợc liệu chính là đối tƣợng đƣợc hƣớng đến với ƣu điểm là rất giàu các hoạt chất có lợi. Các nghiên cứu khoa học đã tập trung vào Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus, và Phellinus linteus, có hoạt chất đƣợc chứng minh là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa béo phì do chế độ ăn uống giàu chất béo ở các loài gặm nhấm và đã giảm hiện tƣợng tăng đƣờng huyết trong máu. P.linteus, có lịch sử sử dụng hơn 2000 năm trong y học cổ truyền Trung Quốc và đƣợc sử dụng rộng rãi ở nhiều nƣớc Đông Á nhƣ một loại thực phẩm chức năng. PL rất giàu polysaccarit và các phân tử nhỏ khác, có tác dụng chống ung thƣ, chống oxy hóa, chống viêm và kháng khuẩn. Các hợp chất có trong PL có khả năng làm giảm đƣờng huyết. các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc rằng hợp chất exopolysaccarides đƣợc chiết xuất từ PL đƣợc nuôi trồng bằng cách lên men trong môi trƣờng lỏng có tác dụng hạ đƣờng huyết cải thiện các tổn thƣơng của gan. Mặt khác họ cũng phát hiện ra rằng các polysaccarit của PL ức chế biểu hiện của các cytokine viêm. Polysaccaride từ sợi nẫm và dịch chiết nƣớc nóng của thể quả PL rất hữu ích trong việc điều trị bệnh tiểu đƣờng bằng cách giảm tổn thƣơng do sự oxy hóa của các tế bào đảo tụy, thúc đẩy bài tiết insulin. 1.1.2.2. Phòng chống ung thư Tác dụng phòng ngừa hoặc ức chế ung thƣ của PL là một trong những đặc tính đƣợc đánh giá cao của PL. Nó cũng là lý do chính tại sao PL thu hút đƣợc nhiều sự chú ý của các bệnh nhân ung thƣ cũng nhƣ các nhà khoa học [12]. Ở Nhật Bản, đã có một bệnh nhân bị ung thƣ biểu mô tế bào gan với nhiều di căn đến phổi, sau khi uống chiết xuất sợi nấm PL thì một khối u hoàn chỉnh đã biến mất sau 6 tháng, và kết quả này là độc lập, không bị ảnh hƣởng