Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của cao chiết cây lan kim tuyến (anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro

TRẦN XUÂN ĐẠT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- SINH HỌC THỰC NGHIỆM Trần Xuân Đạt NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO. LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Xuân Đạt NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO. Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo Hướng dẫn 2: TS. Đoàn Chính Chung Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo và TS. Đoàn Chính Chung, Học viện Khoa học và Công nghệ. Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2021 Tác giả Trần Xuân Đạt LỜI CẢM ƠN Tác giả xin chân thành cảm ơn Gia đình đã luôn ủng hộ tinh thần và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quãng đường học tập. Gia đình là nguồn động lực lớn nhất để tác giả cố gắng học tập và hoàn thiện bản thân mỗi ngày. Tác giả xin chân thành cảm ơn Quý Thầy/Cô trong Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho tác giả những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian vừa qua để luận văn này hoàn thành một cách tốt nhất có thể. Tác giả xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo và TS. Đoàn Chính Chung đã tận tình giúp đỡ, định hướng tư duy và cách làm việc khoa học. Đó là những góp ý hết sức quý báu không chỉ trong quá trình thực hiện luận văn này mà còn là hành trang tiếp bước cho tác giá trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này. Trong quá trình thực nghiệm cũng như viết báo cáo luận văn khó tránh khỏi sai sót, rất mong Quý Thầy/Cô và đọc giả thông cảm. Đồng thời, do trình độ kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên luận văn còn thiếu sót, tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp để hoàn thiện hơn. Chân thành cảm ơn! Tác giả Trần Xuân Đạt 1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC ........................................................................................................... 1 DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... 4 DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ 5 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ..................................................... 9 1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC ................ 9 1.1.1 Tình hình sử dụng các dược liệu trong hỗ trợ điều trị bệnh ung thư . 9 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lan Kim Tuyến ... 11 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN ................................................................................................. 14 1.3. KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU ............................................ 16 1.3.1. Nguyên liệu chiết xuất..................................................................... 18 1.3.2. Dung môi chiết xuất ........................................................................ 18 1.3.3. Quá trình chiết xuất ......................................................................... 19 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU HIỆN NAY 20 1.4.1. Phương pháp ngâm chiết ................................................................. 20 1.4.2. Phương pháp ngấm kiệt ................................................................... 20 1.4.3. Phương pháp chiết hồi lưu và cất kéo hơi nước .............................. 20 1.4.4. Phương pháp chiết Soxhlet .............................................................. 21 1.4.5. Phương pháp chiết siêu âm.............................................................. 21 1.4.6. Phương pháp chiết siêu tới hạn ....................................................... 22 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ...................................... 23 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 27 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ................ 27 2 2.1.1. Cây Lan Kim Tuyến ........................................................................ 27 2.1.2. Các dòng tế bào sử dụng ................................................................. 27 2.1.3. Các bộ kit sử dụng ........................................................................... 27 2.1.4. Các môi trường và hóa chất............................................................. 28 2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG................................................... 28 2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................... 28 2.2.2. Thiết bị............................................................................................. 29 2.3. PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ........................ 30 2.3.1. Phương pháp thu nhận cao chiết cây Lan Kim Tuyến .................... 30 2.3.2. Phương pháp phân tích sơ bộ các hợp chất trong cao chiết ............ 30 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng .......................... 31 2.3.4. Phương pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào ...................... 32 2.3.5. Phương pháp xác định độc tính tế bào hay ức chế tăng sinh tế bào in vitro............................................................................................................ 32 2.3.6. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên sự ức chế hình thành bào lạc của tế bào ............................................................................ 33 2.3.7. Phương pháp đánh giá thay đổi hình thái tế bào ............................. 34 2.3.8. Phương pháp nhuộm 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ....... 34 2.3.9. Phương pháp xác định sự chuyển dịch phân tử PS và apoptosis tế bào ............................................................................................................. 34 2.3.10. Phân tích thống kê ......................................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ-BÀN LUẬN ............................................................. 36 3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN CÁC NHÓM CHẤT TRONG CÂY LAN KIM TUYẾN ............................................................... 36 3.1.1. Kết quả phân tích thử tinh khiết ...................................................... 36 3.1.2. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học................................... 37 3.2. KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ CÂY LAN KIM TUYẾN .. 41 3 3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN ........................... 43 3.3.1. Ảnh hưởng của cao tổng lên sự tăng sinh của tế bào ung thư vú.... 43 3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên hàm lượng enzyme LDH giải phóng từ tế bào ung thư vú .......................................... 46 3.3.3. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên hình thái của tế bào ung thư vú ........................................................................................... 48 3.3.4. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự hình thành bào lạc của tế bào ung thư vú ........................................................................... 50 3.3.5. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi ........................................................................................... 51 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT LAN KIM TUYẾN LÊN SỰ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO UNG THƯ VÚ ..................................... 54 3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết lên hình thái nhân của tế bào ung thư .... 54 3.4.2. Ảnh hưởng của cao chiết lên tỉ lệ apoptosis của tế bào ung thư ..... 55 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ......................................................... 58 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 58 4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 59 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dược liệu ............................................................................................................ 19 Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ được sử dụng .............................................. 28 Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng ....................................................... 29 Bảng 2.3. Các thuốc thử dùng để phân tích sơ bộ thành phần hóa học................. 30 Bảng 3.1. Độ ẩm của mẫu Lan Kim Tuyến ...................................................... 36 Bảng 3.2. Tro toàn phần của mẫu thử Lan Kim Tuyến ..................................... 36 Bảng 3.3. Số liệu phân tích sơ bộ thử tinh khiết của mẫu thử Lan Kim Tuyến 36 Bảng 3.4. Bảng phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của mẫu dược liệu cây Lan Kim Tuyến.................................................................................................. 39 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ ẩm của cao chiết và hiệu suất tách chiết bằng các dung môi khác nhau .................................................................................... 41 Bảng 3.6. Kết quả định tính các hợp chất có trong cao chiết Lan Kim Tuyến. 41 Bảng 3.7. Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid tổng trong các cao chiết . 42 5 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mẫu cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ........................ 12 Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn quercetin sử dụng định lượng flavonoid tổng .................................................................................................................... 42 Hình 3.2. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự tăng sinh của tế bào ung thư vú ................................................................................................... 45 Hình 3.3. Ảnh hưởng của của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên hàm lượng enzyme LDH được giải phóng ra môi trường nuôi cấy từ tế bào ..................... 47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên hình thái của tế bào ung thư vú ................................................................................................... 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự hình thành bào lạc của tế bào ung thư vú ............................................................................ 51 Hình 3.6. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi ........ 52 Hình 3.7. Ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thái nhân của tế bào ung thư vú MCF7........................................................................................ 54 Hình 3.8. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư vú. ....................................................................... 56 6 MỞ ĐẦU Theo thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer – IARC ) năm 2018, toàn thế giới có 18,08 triệu người mới mắc ung thư, trong đó có trên 9,5 triệu người tử vong vì căn bệnh này. Số ca mới mắc ung thư ở Việt Nam ước tính là 164.671 ca và số ca tử vong là 114.871 ca. Các loại ung thư phổ biến ở nam giới lần lượt là ung thư gan (21,5%), ung thư phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và ung thư vòm họng (5%); ở nữ giới lần lượt là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), ung thư phổi (9,4%), dạ dày (8,6%) và gan (7,8%). Tỷ lệ mắc ung thư chuẩn hóa theo tuổi ở cả hai giới là 151,4/ 100.000 người và tỉ lệ tử vong là 104,4/100.000 người. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 70% bệnh nhân ung thư chẩn đoán giai đoạn muộn (III hoặc IV), trong đó có cả các bệnh thể sàng lọc, phát hiện sớm bằng nhiều phương pháp khác nhau. Hiện nay, việc điều trị ung thư chủ yếu dựa trên hai phương pháp cơ bản đó là phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại. Ở phương pháp hiện đại, người ta sử dụng hai phương pháp chính đó là: phương pháp điều trị trúng đích (sử dụng các liệu pháp kháng thể đơn dòng) và phương pháp miễn dịch (sử dụng liệu pháp miễn dich hoặc liệu pháp tế bào gốc). Ngoài ra, ung thư còn được điều trị theo phương pháp truyền thống. Trong phương pháp truyền thống thì chủ yếu dựa trên ba phương pháp cơ bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị hoặc xạ trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) và hóa trị (sử dụng hóa chất gây độc để tiêu diệt tế bào ung thư). Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp trên thì việc sử dụng các dược liệu tự nhiên trong việc điều trị hay hỗ trợ điều trị ung thư cũng là một hướng nghiên cứu của phương pháp điều trị truyền thống. Phương pháp này giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư ở hai khía cạnh: tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể và ức chế sự phát triển của khối u, giúp tăng khả năng sống sót của bệnh nhân [1][2]. Sự kết hợp giữa Y học hiện đại và Y học cổ truyền trong điều trị ung thư đã phát huy được thế mạnh của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, hạn chế được tối đa tình trạng tái phát và di căn khối u và các tác dụng không mong muốn của hóa - xạ trị, nên các triệu chứng lâm sàng được cải thiện. Do vậy, một trong những hướng nghiên cứu của Y học cổ 7 truyền là tìm các chất thảo dược nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng tăng cường miễn dịch và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Cây Lan Kim Tuyến là một trong những cây dược liệu quý tại Việt Nam và trên thế giới do tác dụng dược lý đa dạng và giá trị kinh tế cao. Theo Đông y, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô đun sôi trong nước và lấy nước uống dùng điều trị đau ngực và đau bụng, bệnh tiểu đường, viêm thận, sốt, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và đau phế mạc. Cây Lan Kim Tuyến tươi được áp dụng bên ngoài như là một loại thảo mộc điều trị rắn cắn. Hiện nay, ở Việt Nam, một số công bố khoa học cho thấy thành phần một số chất trong cao chiết và tác dụng nhất định của cây Lan Kim Tuyến trong việc phòng và hỗ trợ điều trị bệnh. Tuy nhiên, hầu như chưa có nghiên cứu hay công bố khoa học đầy đủ nào ở Việt Nam chứng minh tác dụng kháng u hay hỗ trợ điều trị ung thư của cây Lan Kim Tuyến. Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư của cao chiết Lan Kim Tuyến là hướng nghiên cứu hoàn toàn mới ở Việt Nam. Hơn nữa, cho đến này có rất ít nghiên cứu nào trên thế giới về đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư gan, vú, da, cũng như cơ chế phân tử tác động ức chế tăng sinh tế bào ung thư của cây Lan Kim Tuyến. Đây là hướng nghiên cứu khá mới và cần thiết ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Do vậy, luận văn “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của cao chiết cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro” được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cũng làm cơ sở nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo khi tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật hay thử nghiệm lâm sàng trên người. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng là cơ sở tham khảo cho các nghiên cứu tương tự khi tiến hành tách chiết, phân lập và đánh giá chức năng của các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư từ nguồn dược liệu tự nhiên. Mục tiêu của nghiên cứu Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của cao chiết cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro Các nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh một số dòng tế 8 bào ung thư của cao chiết từ cây Lan Kim Tuyến trong điều kiện in vitro. - Nội dung 2: Đánh giá sự cảm ứng apoptosis tế bào ung thư của cao chiết từ cây Lan Kim Tuyến. 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC 1.1.1 Tình hình sử dụng các dược liệu trong hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Theo thống kê của Viện nghiên cứu phòng chống ung thư, ước tính Việt Nam có khoảng 94.000 người chết vì ung thư/năm, tỷ lệ tử vong do ung thư tại Việt Nam đứng thứ 78/172 quốc gia được điều tra. Bên cạnh đó vấn đề đáng lo ngại là số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam đang có xu hướng ngày một tăng nhanh, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 ca năm 2010 và dự kiến sẽ vượt 190.000 ca vào năm 2020. Ở nam giới, ung thư phổi chiếm tỉ lệ mắc và tử vong hàng đầu, kế đó là dạ dày, gan, đại trực tràng. Ở nữ giới lần lượt là ung thư vú, dạ dày, phổi. Ung thư đều bắt đầu khi một nhóm tế bào trong cơ thể tăng trưởng vượt ngoài tầm kiểm soát. Tế bào ung thư cứ tiếp tục tăng lên thêm lấn át tế bào bình thường. Điều này khiến cho cơ thể khó hoạt động hiệu quả như thường lệ. Ung thư có thể bắt đầu tại bất cứ chỗ nào trong cơ thể. Nơi bắt đầu có thể là vú, phổi, gan, kết tràng, và kể cả máu. Ung thư vú (UTV) là bệnh ung thư phổ biến nhất ở nữ giới. Theo GLOBOCAN, ước tính năm 2018 trên thế giới có khoảng hơn 2 triệu ca ung thư vú mới mắc ở nữ và 627.000 ca tử vong. Tại Việt Nam, ung thư vú đứng hàng đầu trong những loại ung thư ở phụ nữ. Tỷ lệ mắc ung thư vú trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng có xu hướng tăng trong những năm gần đây. Ung thư vú chiếm tỷ lệ 11,5% là bệnh ung thư hàng đầu ở phụ nữ. Ung thư vú là tình trạng bệnh lý do tế bào tuyến vú phát triển không kiểm soát được, tạo ra các khối u ác tính, có khả năng phân chia mạnh, xâm lấn xung quanh và di căn xa. Khối u ác tính là tập hợp các tế bào ung thư có thể sinh sôi rất nhanh ở các mô xung quanh, hoặc có thể di căn các bộ phận khác trong cơ thể. Ung thư vú hầu hết xuất hiện ở nữ giới. Tuy nhiên, trong một số ít trường hợp, nam giới cũng có thể mắc bệnh này. Tuyến vú của phụ nữ được hình thành từ các tiểu thùy (tuyến tiết sữa), ống dẫn (các ống nhỏ dẫn sữa từ tiểu thùy tới núm vú) và mô đệm (mô mỡ và mô liên kết xung quanh các ống dẫn và tiểu thùy, các mạch máu và mạch bạch huyết). Ung thư vú phần lớn bắt 10 nguồn từ các tế bào ống dẫn (ung thư ống dẫn). Một số bắt nguồn từ tế bào tiểu thùy (ung thư tiểu thùy), chỉ một lượng nhỏ bắt nguồn từ các mô khác.Các triệu chứng phát hiện ung thư vú như: - Đau vùng vú: cảm giác đau của người bệnh có thể là đau dấm dứt không thường xuyên, thi thoảng đau nhói theo kiểu kim châm. - Chảy dịch đầu vú: một số bệnh nhân có biểu hiện chảy dịch đầu núm vú, có thể chảy dịch lẫn máu. - Người bệnh cũng có thể tự sờ thấy khối u vùng vú hoặc hạch vùng hố nách. - Đối với các khối u vú giai đoạn muộn có thế thấy các triệu chứng do khối u vú xâm lấn gây lở loét, hoại tử ra ngoài da, gây chảy dịch, mùi hôi thối. - Triệu chứng của các cơ quan đã di căn: nhiều người bệnh đến khám với các triệu chứng của bệnh giai đoạn muộn, đã di căn đến các cơ quan khác trong cơ thể như: di căn xương gây đau xương, di căn não gây đau đầu, buồn nôn, chóng mặt,... Ngoài ra, người bệnh có thể có các triệu chứng toàn thân như mệt mỏi, chán ăn, ăn kém, gầy sút cân, đôi khi biểu hiện sốt. Để xác định các giai đoạn ung thư phải tiến hành các xét nghiệm như chụp cắt lớp vi tính (computed tomography – CT), chụp cộng hưởng từ (magnetic resonance imaging – MRI), chụp cắt lớp (positron emission tomograpgy – PET),… để bác sĩ xác định giai đoạn ung thư. Những phương pháp điều trị ung thư vú hiện nay như phẫu thuật loại bỏ khối u, xạ trị, hóa trị, điều trị trúng đích và điều trị miễn dịch. Bên cạnh các phương pháp điều trị ung thư vú bằng Tây y như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị… Trong dân gian Việt Nam vẫn có những bài thuốc Nam chữa ung thư vú. Các bài thuốc Nam này đều được ghi lại trong các tài liệu cả chính thống, cả truyền miệng. Đã được một số bệnh nhân áp dụng và phản hồi rằng có kết quả khá tốt trong việc điều trị bệnh ung thư. Sau đây là 3 bài thuốc Nam chữa ung thư vú phổ biến được nhiều người sử dụng: (1) Bài thuốc Nam chữa ung thư vú từ cây đu đủ. Theo Tiến sĩ Võ 11 Văn Chi – Tác giả cuốn sách Từ điển cây thuốc Việt Nam chia sẻ bài thuốc chữa ung thư vú bằng cây đu đủ. Cách làm như sau: Hái lá và cuống đu đủ tươi rửa sạch. Sau đó sắt khúc nhỏ, cho vào nồi thêm nước rồi đun sôi lên. Để nguội rồi uống, cũng có thể nấu thành nước cô đặc để uống. Uống 3 lần mỗi ngày. Mỗi lần một cốc to (khoảng 300 ml). Uống thêm 3 thìa cà phê mật mía mỗi ngày, mỗi lần một thìa. Nếu uống nước lá đu đủ kết hợp với xạ trị và uống bột củ tam thất. Nó sẽ đem lại hiệu quả điều trị ung thư vú càng nhanh.Nước lá đu đủ phải uống liên tục trong 15-20 ngày mới có kết quả. (2) Bài thuốc Nam chữa ung thư vú bằng cây cúc sữa. Trong Đông Y, cây cúc sữa là loại cây thân thảo mọc hàng năm, có vị đắng, tính hàn. Chúng có khả năng giải độc rất hiệu quả. Để điều trị ung thư vú bằng cây cúc sữa, cách làm như sau: Cách 1:Dùng thân và lá cây cúc sữa tươi đem rửa sạch. Tiếp tục giã nát và vắt lấy nước cốt. Sau đó cho thêm nước sôi và chút rượu trắng vào đun. Mỗi ngày uống nước này hai đến ba lần. Cách 2: Dùng cành lá và cây cúc sữa tươi rửa sạch, đem sắc với nước cô đặc. Sau đó thêm chút nước sôi và chút rượu trắng. Ngày uống 2 lần vào buổi sáng và buổi tối. (3) Bài thuốc Nam chữa ung thư vú bằng củ cải trắng + cà rốt + ngưu bang. Nguyên liệu bao gồm: 1kg ngưu bàng tươi, 1kg cà rốt, 250g ngưu bàng khô, 350g củ cải trắng. Đem tất cả nguyên liệu trên đun sôi với 3 lít nước. Chú ý đun nhỏ lửa trong trong vòng 3 giờ đồng hồ. Sau đó, đem ra cả nước và cái xay hoặc nghiền ra lấy nước. Ngày uống 2 lần, mỗi lần uống 150ml nước thuốc pha thêm 100ml nước nguội. Ngoài các bài thuốc kể trên thì hiện nay còn nhiều cây dược liệu quý đã được các nhà khoa học đang nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư vú. Tuy nhiên, các bài thuốc Nam chữa ung thư vú chỉ nên được sử dụng như một phương pháp hỗ trợ điều trị. Bệnh nhân ung thư vú có thể sử dụng nếu được sự đồng ý của bác sĩ điều trị. Nếu bài thuốc đó lành tính thì vẫn có thể để bệnh nhân kết hợp sử dụng trong quá trình điều trị bằng Tây y. Tuy nhiên các biện pháp điều trị chính vẫn là phẫu thuật, hóa trị và xạ trị tại bệnh viện. 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lan Kim Tuyến Cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus sp.) hay còn gọi là Lan Gấm, cây Kim Cương thuộc họ Orchidaceae, gồm bốn chi: Ludisia, Anoectochilus, Goodyera, Macodes và trên 50 loài khác nhau. Trong đó chi Anoectochilus có 12 số loài phong phú nhất (30 - 40 loài), một số loài có giá trị dược liệu cao và được thương mại cao nhiều thế giới hiện nay như Anoectochilus formosanus Hayata, Anoectochilus setaceus Blume, Anoectochilus roxburghii Lindl [3]. Hình 1.1. Mẫu cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) Cây Lan Kim Tuyến là một trong những cây dược liệu quý tại Việt Nam và trên thế giới do tác dụng dược lý đa dạng và giá trị kinh tế cao. Theo Đông y, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô đun sôi trong nước và lấy nước uống dùng điều trị đau ngực và đau bụng [4], bệnh tiểu đường, viêm thận [5], sốt, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và đau phế mạc [6]. Cây Lan Kim Tuyến tươi được áp dụng bên ngoài như là một loại thảo mộc điều trị rắn cắn [6]. Ở Malasia, những cây khác thuộc chi Anoectochilus được dùng để trị lao phổi. Ở Đài Loan và Trung Quốc chi Anoectochilus thường được gọi là “Jewel Orchids” và “King of Medicine” vì những tán lá đẹp và tác dụng dược lý của loài cây trong chi này [7]. Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh trong cây Lan Kim Tuyến có chứa các hợp chất thứ cấp như axit stearic, axit palmitic, axit succinic, axit p-hydroxy cinnamic, o-hydroxy phenol, betasitosterol, daucosterol, gastrodin (4-(β-D-glucopyranosyl oxy) benzyl alcohol), gastrodigenisn gastrodigenin (p-hydroxybenzyl alcohol), và Kinsenoside (3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxybutanolide)… Các hợp chất này có thể thu nhận thông qua cao chiết của cây Lan Kim Tuyến. Nghiên cứu của He cho thấy cao chiết phân đoạn CHCl3 của loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii có chứa một số hợp chất như p-hydroxybenzaldehyd, axit ferulic, quercetin, daucosterol, cirsilineol [8]. Trong khi đó, cao chiết phân đoạn Hexan có chứa các hợp chất sorghumol, friedelin, axit palmitic, hỗn hợp 2 sterol (24- 13 isopropenylcholesterol và 26-methylstigmasta-5,22,25,(27) trien-3-beta-ol), sitosterol, stigmasterol, campesterol. Trong đó, sorghumol, friedelin là những hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong một loài thuộc chi Anoectochilus. sp. [8]. Tương tự, trong một nghiên cứu khác của cùng nhóm tác giả cũng phát hiện thấy một số hợp chất flavonoid glucosid mới trong loài này như quercetin7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]-glucopyranosid, 8-C-p hydroxybenzylquercetin, isorhamnetin-7-O-β-D-glucopyranosid, isorhamnetin3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol-7O-β-D-glucopyranosid, 5-hydroxy-3',4',7trimethoxyflavonol-3-O-β-Drutinosid, và isorhamnetin-3-O-β-D-rutinosid. Trong các hợp chất nêu trên, quercetin-7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]- glucopyranosid có hoạt tính oxy hóa mạnh nhất [9]. Trong khi đó, nghiên cứu của Liu phát hiện thấy hai dẫn xuất 3-hydroxybutanolid mới (kinsenbenol và kinsendiosid) và một flavonoid glucosid mới (roxburosid) trong cao chiết loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii [10]. Nghiên cứu Huang cho thấy hợp chất ergosterol và stigmasterol được phân tách từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ. Ergosterol và stigmasterol là hai phytosterol phổ biến nhất trong cây thuốc cổ truyền ở Trung Quốc. Đây là hai hợp chất sterol chính của loài Lan Kim Tuyến và được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng [11]. Tương tự, bằng phương pháp HPLC-ELSD, nghiên cứu của Wan [12] xác định hàm lượng Kinsenosid trong dược liệu Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii . Đây là phương pháp đơn giản, tin cậy, chính xác, độ lặp lại cao phù hợp để đánh giá chất lượng dược liệu Lan Kim Tuyến [12]. Tương tự loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii, nghiên cứu của Du [13] đã phân lập được các hợp chất glycosid từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus được nhân giống bằng nuôi cấy mô in vitro. Kết quả đã phân lập được một số hợp chất như 2-(β-D-glucopyranosyloxymethyl)-5-hydroxymethylfuran, 3-(R)-3-βD-glucopyranosyloxybutanolid (Kinenosid), acid 3-(R)-3-β-Dglucopyranosyloxy-4-hydroxy-butanoic, 1-O-isopropyl-β-D-glucopyranosid, acid (R)-(+)-3,4-dihydroxy-butanoic γ-lacton, 4-(β-D-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol, (6R,9S)-9-hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-on-9-O-β-Dglucopyranosid, corchoinosid C [13]. Tương tự, trong một nghiên cứu khác Du 14 và công sự cho thấy cả hai 2 loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus và Anoectochilus koshunensis đều có chứa hàm lượng cao hợp chất Kinsenosid, 3-(R)-3-β-D-glucopyranosyloxybutanolid [14]. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN Một số tác dụng dược lý của cây Lan Kim Tuyến bao gồm các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm đường huyết [15][16][17][18][19]. Nghiên cứu Lin và Wang cho thấy họat tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan của Lan Kim Tuyến [15][17]. Nghiên cứu của Wu [20] chứng minh ảnh hưởng của dịch chiết xuất của loài Lan Anoectochilus formosanus (SAEAF) trên mô hình xơ hóa gan gây ra bởi thioacetamide (TAA). Nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả ngăn cản quá trình xơ hóa của tế bào gan bởi Ginsenoside, một thành phần chính của SAEAF trên khối u yếu tố hoại tử α (TNF-α) được tiết ra từ các tế bào Kupffer có thể được bắt nguồn ít nhất một phần từ ức chế thụ thể LPS của tuyến yên như tín hiệu Toll 4 (TLR4 ). Những con chuột được điều trị SEAF đã giảm đáng kể hoạt động của tín hiệu alanine aminotransferase trong huyết tương, trọng lượng của gan liên quan với hàm lượng hydroxyproline trong gan. Kết quả phân tích mô hình học cũng cho thấy SEAF làm giảm mức độ xơ gan do điều trị TAA. Kết quả phân tích RTPCR cho thấy SAEAF điều trị giảm biểu hiện mRNA của collagen (α1) (I), protein lipopolysaccharide, CD14, TLR4, và TNF receptor 1. SAEAF giảm số lượng các tế bào dương CD68 (đại thực bào). Như vậy, nhóm chuột uống SAEAF chủ yếu làm giảm đáng kể TAA gây ra bệnh xơ gan ở chuột, thông qua sự ức chế hoạt động của tế bào Kupffe trong gan [20]. Tương tự, nghiên cứu của Shih đánh giá tác dụng ức chế sự xơ hóa gan của cao chiết nước từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus (AFE) trên mô hình gây độc cho gan chuột bởi carbon tetrachlorid (CCl4). Kết quả nghiên cứu cho thấy, AFE có khả năng giảm hoạt lượng GOT và GPT gây ra bởi CCl4. AFE làm tăng nồng độ albumin trong huyết thanh, tăng trọng lượng gan và giảm trọng lượng lá lách. CCl4 làm giảm hàm lượng protein, và gia tăng hàm lượng collagen trong gan chuột, trong khi đó AFE làm tăng đáng kể hàm lượng protein và giảm hàm lượng collagen trong gan. Ở nhóm chứng độc dùng CCl4, nồng độ glutathion 15 trong gan không thay đổi so với nhóm chứng trắng. Nhóm thử dùng AFE có nồng độ glutathion trong gan tăng đáng kể. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy AFE có khả năng ức chế sự xơ hóa gan ở chuột gây ra bởi CCl4 [21]. Trong khi đó, một nghiên cứu khác tiến hành phân lập, xác định các polysaccharid từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (ARP) và đánh giá tác dụng bảo vệ gan của ARP trên mô hình gây tổn thương gan bởi CCl4. Kết quả cho thấy, ARP có cấu tạo là glucose và galactose với tỉ lệ mol: 1,9/1, trọng lượng phân tử là 19,5kDa. ARP có khả năng loại bỏ các gốc tự do như gốc hydroxyl, gốc superoxid anion, DPPH. Thử nghiệm in vivo đã chứng minh cho chuột uống ARP (150mg/kg) 7 ngày trước khi sử dụng carbon tetrachlorid, có khả năng làm giảm mức độ biểu hiện của aspartat aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT), triglycerid (TG) trong huyết thanh và ức chế sự hình thành của malondialdehyd (MDA) trong gan. Việc sử dụng ARP cũng làm tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa như glutathion (GSH), superoxid dismutase (SOD), và tổng hoạt tính chống oxy hóa (T-AOC) trong gan chuột khi bị gây tổn thương bởi CCl4. Ngoài ra, những thay đổi mô bệnh học của gan gây ra bởi CCl4 được phục hồi đáng kể bởi việc sử dụng ARP. Nghiên cứu này đã chứng minh ARP có tác dụng tốt trong việc bảo vệ gan, chống lại tổn thương gan cấp tính gây ra bởi CCl4 thông qua sự giảm quá trình oxy hóa lipid [22]. Bên cạnh tác dụng bảo vệ gan, một số nghiên cứu khác cho thấy cao chiết Lan Kim Tuyến có tác dụng giảm đường huyết hiệu quả trên mô hình nghiên cứu in vivo. Nghiên cứu của Cui cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của cao chiết nước loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chứng minh được tác dụng làm giảm đường huyết của cao chiết trên mô hình chuột tiểu đường thông qua các chỉ tiêu: giảm đường huyết, giảm cholesterol và triglyceride tổng và tăng hàm lượng high-density lipoprotein cholesterol trên mô hình chuột đái tháo đường cảm ứng bằng Alloxan [18]. Trong khi đó, một nghiên cứu khác cho thấy phân đoạn giàu polysaccharose có hoạt tính giảm đường huyết trên mô hình chuột đái tháo đường cảm ứng bằng STZ và duy trì chế độ ăn giàu chất béo [23]. Tương tự, nghiên cứu của Tang cho thấy 6 phân đoạn giàu polysaccharides ARPs, ARPs1, ARPs-2, AFPs, AFPs-1 và AFPs-2 từ 2 loài Lan Kim Tuyến 16 Anoectochilus roxburghii và Anoectochilus formosanus đều có tác dụng làm giảm đường huyết trên mô hình chuột đái tháo đường cảm ứng bằng STZ [24]. Ngoài ra, một nghiên cứu khác của Masuda [25] đã cho thấy rằng chất chiết xuất từ loài Lan Anoectochilus formosanus có khả ngăn chặn loãng xương do thiếu estrogen thông qua ức chế sự hình thành các tế bào phân hủy xương [25]. Bên cạnh các tác dụng dược lý như bảo vệ gan và làm giảm đường huyết, chống loãng xương, một số nghiên cứu trước đây cho thấy hoạt tính kháng ung thư và tăng cường hệ miễn dịch của cao chiết cây Lan Kim Tuyến. Nghiên cứu của Shyur cho thấy cao chiết từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus ức chế sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người MCF-7 thông qua sự thay đổi hình thái tế bào, sự dịch chuyển phân tử PS ra ngoài màng tế bào và sự cô đặc của DNA nhân tế bào [26]. Nghiên cứu khác của Tseng cho thấy cao chiết nước loài Lan Anoectochilus formosanus có hoạt tính kháng u trên mô hình chuột ghép khối u đồng loài ung thư đại tràng CT-26. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính điều biến miễn dịch của cao chiết thông qua việc họat hóa đáp ứng miễn dịch trên mô hình in vivo như kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho và hoạt thóa chức năng của đại thực bào [27]. Tương tự, một nghiên cứu khác cũng cho thấy cao chiết từ loài Lan Anoectochilus formosanus có tác dụng kích thích hệ miễn dịch [28]. Gần đây, một bằng sáng chế của Mỹ US 7033617 B2 về “Sử dụng các chất chiết xuất thực vật Chi Lan Kim Tuyến như là các loại thuốc thảo dược bổ sung dinh dưỡng cho phòng ngừa tác hại hóa chất hoặc điều trị các khối u ác tính của con người” cho thấy được tác dụng của cây Lan Kim Tuyến trong vấn đề phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư. 1.3. KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU Chiết xuất dược liệu có vai trò cực kỳ quan trọng trong việc quyết định đến chất lượng, độ an toàn và hiệu quả của các chế phẩm đông dược. Đặc biệt, hiện nay xu hướng phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng phổ biến vì hiệu quả tốt mà lại an toàn nên vấn đề chiết xuất càng được quan tâm. Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm năng về cây thuốc. Bên cạnh đó nước ta cũng có nền y học cổ truyền lâu đời, cũng có rất nhiều kinh nghiệm về sử dung dược