Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da của dịch chiết nhau thai heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. TS. TRẦN CẨM TÚ 2. TS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN Hà Nội - 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dựa trên những định hướng, góp ý của các cán bộ hướng dẫn (Cô - TS. Trần Cẩm Tú và Cô - TS. Nguyễn Thị Thương Huyền). Các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu và kết quả trong luận văn này./. Học viên Nguyễn Ngọc Hân ii LỜI CẢM ƠN Nhìn lại chặng đường học tập và nghiên cứu, với những kết quả đạt được hôm nay, trước tiên, em xin cảm ơn Cô - TS. Trần Cẩm Tú và Cô - TS. Nguyễn Thị Thương Huyền đã luôn dành nhiều thời gian tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, định hướng phương pháp nghiên cứu và cả kỹ năng, kinh nghiệm làm việc. Trong thời gian qua, có đôi lúc em chưa thật sự quyết tâm nhưng được sự cảm thông sâu sắc, động viên, chia sẻ của Cô, giúp em có thêm động lực để vượt qua những khó khăn, áp lực để hoàn thành nghiên cứu này. Một lần nữa, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn Cô thật nhiều! Trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo khoa, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện cho tôi và tất cả các học viên được tiếp cận với môi trường học tập tích cực, hiệu quả. Xin cảm ơn quý Thầy Cô công tác tại Viện Sinh học nhiệt đới và quý Thầy Cô công tác tại khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM đã giúp đỡ tôi trong trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chân thành cảm ơn em Trương Thị Thuý đã luôn nhiệt tình cùng đồng hành, hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM. Lời tri ân sâu sắc nhất xin gửi đến gia đình vì đã luôn khích lệ, nâng đỡ, sẻ chia công việc để tôi có thể chuyên tâm hoàn thành chương trình học! Học viên Nguyễn Ngọc Hân iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 NỘI DUNG ................................................................................................................5 Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ..........................................................5 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ DA ..................................................................................5 1.1.1. Cấu tạo da ..............................................................................................5 1.1.2. Cấu trúc mô da ......................................................................................6 1.1.3. Dấu hiệu lão hoá da ...............................................................................8 1.1.4. Nguyên nhân lão hoá da ........................................................................9 1.2. TỔNG QUAN VỀ GIẢI PHẪU DA CHUỘT NHẮT TRẮNG MUS MUSCULUS VAR. ALBINO ............................................................................11 1.2.1. Khái quát về chuột trắng Mus musculus var. albino ...........................11 1.2.2. Cấu trúc da của chuột trắng Mus musculus var. albino ......................11 1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ TIA UV ........................................................................13 1.3.1. Các loại tia UV ....................................................................................13 1.3.2. Cơ chế tác động của tia UV đối với da ...............................................14 1.4. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN ...............................................................14 1.4.1. Cấu trúc ...............................................................................................15 1.4.2. Phân loại ..............................................................................................15 1.4.3. Cơ chế tổng hợp collagen ....................................................................16 1.5. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ ................................................16 1.6. DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO .............................................................17 1.6.1. Tổng quan cấu trúc và chức năng nhau thai heo .................................17 1.6.2. Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết nhau thai heo .................................18 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................19 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................19 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................19 2.3. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................20 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................21 2.4.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và bảo quản tế bào .....................................23 iv 2.4.2. Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời ..............................................................24 2.4.3. Khảo sát sự biểu hiện gene Collagen type IV (Col-IV) của tế bào gốc trung mô ........................................................................................................26 2.4.4. Phƣơng pháp xây dựng mô hình chuột bị ảnh hƣởng bởi tia UV .......26 2.4.5. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản mô học .............................................28 2.4.6. Phƣơng pháp so sánh đối chiếu tiêu bản mô học ................................29 2.4.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm về khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo ...........................................................31 2.4.8. Phƣơng pháp xử lí số liệu ...................................................................32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................33 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO LÊN SỰ TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ MÔ MỠ NGƢỜI ..............................................................................................................33 3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độ dịch chiết tối ƣu .........................................33 3.1.2. Sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ngƣời .37 3.1.3. Biện luận .............................................................................................38 3.2. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT LÃO HOÁ DA BỞI TIA UV........38 3.2.1. Ảnh hƣởng ở mức đại thể....................................................................38 3.2.2. Ảnh hƣởng cấu trúc vi thể của da .......................................................41 3.2.3. Biện luận .............................................................................................45 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO NỒNG ĐỘ 100 μg/mL..............................48 3.3.1. Kết quả ở mức đại thể .........................................................................48 3.3.2. Kết quả ở mức vi thể ...........................................................................50 3.3.3. Biện luận: ............................................................................................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tia UV: Tia cực tím MSC: Tế bào gốc trung mô ATMSC: Tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ ngƣời ASC: Tế bào gốc trƣởng thành DMEM: Môi trƣờng nuôi cấy tế bào FBS: Huyết thanh nuôi cấy tế bào PBS: Dung dịch đệm nuôi cấy tế bào bFGF: Yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi Col-IV/Col4: Collagen loại IV HE: Phƣơng pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin ECM: Cấu trúc ngoại bào TGF: Yếu tố tăng trƣởng chuyển đổi HPLC: Sắc kí lỏng cao áp ROS: Gốc oxy hoá tự do MMP: Enzyme thuỷ phân protein cấu trúc vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự tƣơng quan cấu tạo giữa da chuột và da ngƣời ...........................12 Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ................................................19 Bảng 2.2. Đặc điểm cấu trúc da ở các mức độ lão hoá ....................................31 Bảng 3.1. Kết quả phân tích amino acid của dịch chiết nhau thai heo .............34 Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng có trong dịch chiết nhau thai heo ......................................................................................................................35 Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của mốc thời gian chiếu UV ...................................................................................................................43 Bảng 3.4. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da chuột ở các nghiệm thức khảo sát ......53 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Mô hình ba chiều của da ở động vật có vú .........................................5 Hình 1.2. Các lớp của biểu bì .............................................................................6 Hình 1.3. Bức xạ UV trong ánh sáng mặt trời..................................................13 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của nghiên cứu .............................21 Hình 2.2. Bố trí chuồng nuôi chuột thí nghiệm ................................................27 Hình 2.3. Hình chuột sau khi đƣợc cạo lông ....................................................28 Hình 2.4. Phƣơng pháp thu nhận mẫu da .........................................................29 Hình 2.5. Đo độ dày biểu bì dƣới kính hiển vi với phần mềm S-Eyes ............30 Hình 3.1. ATMSCs có hình dạng thoi dài đặc trƣng........................................33 Hình 3.2. ATMSCs biệt hoá thành tế bào mỡ và tế bào xƣơng .......................33 Hình 3.3. Hình thái ASC trƣớc và sau khi bổ sung dịch chiết 12h ..................36 Hình 3.4. Biểu đồ đƣờng cong tăng trƣởng của tế bào ATMSCs dƣới tác động của dịch chiết nhau thai heo ở các nồng độ ..............................................................36 Hình 3.5. Kết quả biểu hiện gene Col-IV .........................................................37 Hình 3.6. Chuột đƣợc cạo lông trƣớc khi chiếu UV ........................................39 Hình 3.7. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV sau 8 tuần chiếu UV ..................40 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì sau 8 tuần thí nghiệm .........41 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì dƣới tác động của UV ...................42 Hình 3.10. Cấu trúc collagen ở các mức độ lão hoá dƣới tác động của UV ....42 Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới tác động của UV .................................................................................43 Hình 3.12. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV và hiệu quả ngăn ngừa lão hoá của các sản phẩm sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức .............................................48 Hình 3.13. Kết quả độ dày biểu bì da chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở các nghiệm thức ...............................................................................................................50 Hình 3.14. Biểu đồ độ dày biểu bì da chuột ở các nghiệm thức khảo sát ........51 Hình 3.15 Cấu trúc Collagen ở các mức độ lão hoá trong thí nghiệm .............52 Hình 3.16. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen ở các nghiệm thức khảo sát ........................................................................53 1 MỞ ĐẦU Những năm gần đây, sự biến đổi khí hậu và tác động từ môi trƣờng sống ô nhiễm đã gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe cũng nhƣ làm tăng nguy cơ lão hóa da sớm. Do đó, nhu cầu làm đẹp cho da và điều trị những vấn đề về da ngày càng đƣợc mọi ngƣời quan tâm. Đặc biệt, công nghệ làm đẹp hiện nay đang hƣớng tới những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật, động vật. Nhằm đáp ứng nhu cầu thẩm mỹ ngày càng cao, nhiều nghiên cứu tập trung vào nguồn nguyên liệu từ nhau thai động vật nhƣ nhau thai cừu, nhau thai ngựa, nhau thai bò, nhau thai heo,... So với các nguồn nhau thai từ động vật, nhau thai heo có nguồn cung cấp ổn định hơn đáp ứng đƣợc việc cung cấp nguyên liệu ổn định, phục vụ nhu cầu sản xuất lâu dài và bền vững do số lƣợng heo đƣợc chăn nuôi nhiều và thời gian mang thai, sinh sản của heo ngắn hơn. Chiết xuất nhau thai ngày nay đƣợc sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực lâm sàng, mỹ phẩm do chứa các hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm kích thích tố, protein, peptide, các yếu tố tăng trƣởng, axit nucleic, glycosaminoglycans và polydeoxyribonucleotides rất quan trọng cho sự tăng trƣởng và phát triển của bào thai [1]. Nhau thai chứa các enzyme nhƣ phosphatase kiềm axit và transaminase oxit glutamic, cũng nhƣ axit nucleic, vitamin, axit amin, steroids, axit béo và khoáng chất [2, 3]. Nhau thai là một loại thuốc truyền thống đƣợc sử dụng để chữa lành vết thƣơng do đặc tính miễn dịch và chống viêm nên đƣợc sử dụng nhƣ là một bổ sung mỹ phẩm ở nhiều nƣớc châu Á [2, 4]. Các nghiên cứu tập trung vào hai nguồn chính là nhau thai ngƣời và nhau thai từ động vật. Mặc dù nhau thai ngƣời có hiệu quả trị liệu cao hơn so với nguồn nhau thai từ các động vật khác nên rất đƣợc ƣa chuộng nhƣng việc thu thập nguồn nhau thai ở ngƣời rất khó khăn. Do đó, hiện nay các nguồn nhau thai từ động vật nhƣ nhau thai ngựa, nhau thai cừu, nhau thai bò, nhau thai heo,… đang dần đƣợc nghiên cứu rộng rãi để phục vụ nhu cầu điều trị và chăm sóc sức khỏe, sắc đẹp. Chiết xuất từ nhau thai heo so với nhau thai ngƣời có sự tƣơng đồng cao về DNA, lại có hiệu quả vƣợt trội nên rất tƣơng thích với cơ thể ngƣời. Bởi vì nhau thai heo tƣơng đối an toàn và hiệu quả nên nó đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một mỹ phẩm bổ sung [2]. Tuy nhiên, hiện nay nghiên cứu về hiệu quả của dịch chiết từ nhau thai heo trong việc ngăn ngừa tổn thƣơng da do tia cực tím (UV) gây ra hiện nay chƣa đƣợc nghiên cứu chi tiết. Trên cơ sở đó, đề tài: “Nghiên cứu hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da của dịch chiết nhau thai heo” đƣợc thực hiện. 2 Mục đích nghiên cứu: Đánh giá đƣợc hiệu quả chống lão hóa da của dịch chiết từ nhau thai heo từ kết quả thử nghiệm in vitro và in vivo. Nội dung nghiên cứu: - Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nhau thai heo với các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ngƣời và xác định nồng độ tối ƣu và khảo sát sự biểu hiện của gene liên quan sự lão hoá dƣới tác động của dịch chiết ở nồng độ tối ƣu. - Tạo mô hình chuột lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của tia cực tím (UV). - Khảo sát hiệu quả của dịch chiết nhau thai heo trên mô hình chuột nhắt trắng bị gây lão hoá da. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài: Các nghiên cứu về hại của tia UV đối với da đã đƣợc thực hiện trong nhiều năm qua, trong đó phải kể đến một số công trình tiêu biểu sau: Năm 2017, Bhattacharyya và cộng sự đã xây dựng mô hình để đánh giá các đặc điểm mô học của da ở chuột dƣới sự ảnh hƣởng của UV và chế độ ăn. Mô hình đƣợc thực hiện trên chuột cái không lông (độ tuổi 6 - 8 tuần). Da lƣng của chuột đƣợc tiếp xúc với mô hình gồm 4 đèn UV đƣợc trang bị bộ điều khiển điện tử để điều chỉnh liều lƣợng tia cực tím. Đèn phát ra tia UV (bƣớc sóng 314 nm). Việc chiếu UV đƣợc thực hiện 3 lần một tuần trong 10 tuần cho những con chuột đƣợc di chuyển tự do trong lồng. Lƣợng phóng xạ tăng dần từ 45 mJ/cm 2 - 180 mJ/cm 2. Sau 10 tuần thí nghiệm, nhiều đặc điểm mô bệnh học đƣợc quan sát thấy ở vùng da tiếp xúc lâu dài với tia UV có sự dày lên của biểu bì, hình thành nếp nhăn và thay đổi cấu trúc da, nhƣ tổn thƣơng collagen I, tăng sản xuất sợi đàn hồi và xơ hoá. Mặt khác, nhóm này còn ghi nhận đƣợc cận nặng cơ thể chuột giảm khi bị chiếu UV so với nhóm chuột không bị chiếu [5]. Năm 2016, Lan Wang và cộng sự có nghiên cứu về tác hại của UV lên da chuột. Nhóm tiến hành chiếu UVB/UVA trên da chuột đƣợc cạo lông vùng lƣng trong 10 tuần (5 ngày trong tuần), cƣờng độ tối thiểu 100 mJ/cm2 trong tuần đầu và tăng dần từng tuần cho đến tuần thứ 4 đạt 400 mJ/cm2 thì duy trì đến hết thời gian thí nghiệm. Kết quả cho thấy sau 10 tuần chiếu, da lƣng của chuột có hiện tƣợng thô, dạng sóng, ban đỏ, phù nề và bỏng da; độ dày trung bình của biểu bì chuột ở nhóm chiếu UV tăng gấp 4,63 lần so với nhóm đối chứng (không chiếu UV, 15,62 3 µm). Sự xuất hiện những thay đổi bất thƣờng ở da đã chứng minh rằng mô hình ảnh ở chuột đã đƣợc thiết lập thành công. Ngƣợc lại, những con chuột trong nhóm chƣa đƣợc chiếu xạ cho thấy không có các vết nhăn cũng nhƣ tổn thƣơng, chứng minh rằng hoạt động cạo lông không gây tổn thƣơng vĩ mô đối với da [6]. Năm 2015, Yoon Jung Kim và cộng sự nghiên cứu phƣơng pháp châm cứu ức chế tác hại của tia UV gây lão hoá ở chuột không lông. Thí nghiệm thực hiện trên chuột cái đã loại bỏ lông, n = 20, đƣợc bố trí thành 4 lô thí nghiệm, bình thƣờng, đƣợc điều trị bằng châm cứu (TEA - Thread Embedding Acupuncture), đƣợc chiếu xạ UV và kết hợp chiếu xạ với điều trị bằng TEA. Kết quả cho thấy, so với những con chuột bình thƣờng, da của những con chuột đƣợc chiếu tia cực tím khô, thô ráp và bong tróc. Các nếp nhăn của chuột bình thƣờng mỏng và nông, độ dày biểu bì bình thƣờng; trong khi những con chuột chiếu tia cực tím cho thấy nếp nhăn dày và sâu, độ dày biểu bì lớn hơn. Trong khi đó, nhóm chuột chiếu UV kết hợp với điều trị TEA cho thấy sự phục hồi nếp nhăn theo tỉ lệ phần trăm vùng nhăn, chiều dài nếp nhăn và độ sâu nếp nhăn so với những con chuột đƣợc điều trị bằng UVB đơn thuần, tuy nhiên không có thay đổi đáng kể nào đƣợc quan sát thấy [7]. Năm 2014, Xue-Xuan Feng và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác hại của tia UV lên da chuột với liều chiếu 15 mJ/cm2 trong 9 tuần (5 ngày trong tuần), diện tích da đƣợc cạo lông 2,5 x 3 cm2. Kết quả cho thấy sau 5 tuần chiếu da xuất hiện ban đỏ nhẹ và có nếp nhăn thô; sau 9 tuần thí nghiệm, da hình thành nếp nhăn sâu, cấu trúc da lỏng lẻo, ban đỏ nặng, bong da, bong vảy. Về cấu trúc vi thể cho thấy có sự sừng hoá bất thƣờng: collagen bị rối, mật độ giảm và bị đứt gãy, thậm chí không còn giữ đƣợc cấu trúc [8]. Năm 2009, Kim và cộng sự đã xây dựng mô hình liên quan đến tác dụng của tia UV lên da chuột với các chỉ tiêu đánh giá bao gồm nếp nhăn da, độ dày của da và độ đàn hồi của da. Chuột đực 6 tuần tuổi đƣợc chiếu xạ UVB loại 15 W với bƣớc sóng 312 nm và cƣờng độ 100 W/cm2 (tƣơng ứng với cƣờng độ chiếu 36 mJ/cm2). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong 12 tuần với tần số chiếu xạ 3 lần/tuần và cƣờng độ thay đổi qua các tuần: từ 54 mJ/cm2; đến 122 mJ/cm2. Nếp nhăn đƣợc đƣợc nhận thấy ở mức độ vĩ mô từ tuần thứ 6 sau khi bắt đầu chiếu UVB. Sau 12 tuần chiếu UV, độ dày biểu bì tăng đáng kể từ tuần 2 - 12; độ đàn hồi giảm nhanh kể từ tuần 8 - 12; từ tuần 6, bắt đầu xuất hiện các nếp nhăn trên diện rộng. Sự xuất hiện những thay đổi bất thƣờng ở da đã chứng minh rằng mô hình ảnh ở chuột đã đƣợc thiết lập thành công và là nền tảng để thực hiện các thí nghiệm khác [9]. 4 Nếp nhăn gây ra bởi lão hoá, di truyền, các yếu tố môi trƣờng nhƣ tia cực tím, khói thuốc và sự suy giảm estrogen. Trong số này, tuổi tác là yếu tố có liên quan mật thiết tới nếp nhăn quanh mắt. Da trở nên mỏng hơn, khô hơn và giảm dần tính đàn hồi. Theo kết quả từ nhóm nghiên cứu của trƣờng Đại học Kanazawa (Nhật Bản), chiết xuất nhau thai heo 100% là một lựa chọn tối ƣu để cải thiện nếp nhăn quanh mắt nhờ khả năng kích thích sản sinh collagen từ nguyên bào sợi dƣới da và ức chế sự tiết enzyme phân huỷ collagen - Metalloproteinase (MMP)-9 [2]. Rất nhiều nghiên cứu trên tạp chí Obstetrics & Gynecology đã chứng minh chiết xuất nhau thai heo (tên thƣơng mại là Laennec P.O. Porcine) có hiệu quả cải thiện đáng kể các dấu hiệu lão hoá trên da ở phụ nữ lớn tuổi mà không làm thay đổi các chỉ số xét nghiệm máu. Điều này cho thấy chiết xuất từ nhau thai heo có hiệu quả và an toàn đối với cơ thể ngƣời. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này vẫn chƣa có một nghiên cứu cụ thể đƣợc tiến hành để đánh giá về mức độ lão hoá và tổn thƣơng do tia UV gây ra và hiệu quả ngăn ngừa lão hóa da của dịch chiết nhau thai heo. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da của dịch chiết nhau thai heo” đƣợc thực hiện. Đây là một nghiên cứu cơ bản nhằm hƣớng tới các nghiên cứu tiếp theo ở mức sâu hơn để dần tiến tới thƣơng mại hoá sản phẩm có thành phần từ dịch chiết nhau thai heo. 5 NỘI DUNG Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ DA 1.1.1. Cấu tạo da Da là mô lát tầng, là một loại mô liên kết biểu bì. Cấu trúc của da có nhiều lớp tế bào, trong đó các lớp ngoài luôn bị thoái hoá, bong ra và thay thế bằng các lớp tế bào bên dƣới. Nguồn gốc của sự thay mới thƣờng xuyên này là do một lớp tế bào của da ở vị trí tiếp giáp với mô liên kết có khả năng thƣờng xuyên tạo tế bào mới [10]. Ở động vật có vú nói chung và ở con ngƣời nói riêng, da có cấu tạo gồm 3 lớp chính: biểu bì, trung bì và hạ bì (hình 1.1) [11]. Hình 1.1. Mô hình ba chiều của da ở động vật có vú [11] 6 1.1.2. Cấu trúc mô da 1.1.2.1. Lớp biểu bì Lớp ngoài cùng của da, gồm nhiều lớp tế bào mô xếp dính chặt với nhau, dày từ 0,07 - 1,8 mm. Lớp biểu bì gồm 5 lớp tế bào: lớp mầm, lớp gai, lớp hạt, lớp bóng và lớp tế bào sừng (hình 1.2) [11]. Hình 1.2. Các lớp của biểu bì [11] Lớp đáy (Stratum germinatum): đƣợc tạo thành bởi một hàng tế bào khối vuông và trụ có khả năng phân chia liên tục, sản sinh ra các tế bào cho lớp biểu bì. Gồm các loại tế bào: tế bào sừng, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans và tế bào Merkel [11]. Lớp gai (Stratum spinosum hoặc filamentosum): Gồm các tế bào có hình khối đa diện, nhân tròn, nằm trên lớp đáy, có 7 - 15 tầng tế bào. Những khe trống giữa các tế bào này chứa dịch nuôi đƣợc tạo ra từ lớp nhú của trung bì để trao đổi dinh dƣỡng với tế bào biểu bì. Các khe trống này bảo đảm cho sự chuyển hoá, tăng trƣởng và biệt hoá của các tế bào sừng. Các đầu tận cùng của dây thần kinh nhận cảm giác đau cũng nằm rải rác trong các khe này [11]. Lớp hạt (stratum granilosum): Gồm những tế bào dẹt có nhân chứa các chất sừng trong suốt. Các tế bào này không chỉ tổng hợp, biến hoá và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hoá mà còn làm nhiệm vụ tự hủy theo chƣơng trình để biến từ tế bào hạt thành tế bào sừng [11]. 7 Lớp bóng (stratum lucidum): Là lớp tế bào trong suốt, đƣợc hình thành tạo nên từ lớp đáy, các lớp tế bào già đƣợc đẩy dần ra khỏi môi trƣờng nuôi dƣỡng và sự biệt hoá cũng hoàn thành. Lớp bóng nằm ngay dƣới lớp tế bào sừng, có chức năng giữ cho da không bị mất nƣớc và bảo vệ lớp tế bào phía dƣới đối với các tác động cơ học [11]. Lớp sừng (Stratum corneum): Là lớp ngoài cùng có 15 - 20 tầng tế bào, có hình khối dẹt rộng, hoặc hình đa diện. Các tế bào này đã mất khả năng sống, hoàn toàn sừng hoá. Chúng dính chặt vào lớp tế bào trong suốt tạo thành một lớp bảo vệ ngoài cùng của da [11]. 1.1.2.2. Lớp trung bì Trung bì nằm dƣới lớp biểu bì, dày từ 0,7 - 7 mm, dày hơn chiều dày của biểu bì từ 15 - 40 lần. Trung bì là một lớp xơ rất chắc, đƣợc tạo nên từ các chất nền (chất gian bào), các tế bào liên kết, bó sợi liên kết, sợi đàn hồi, các tuyến ống, cơ dựng nang lông, mạch máu và dây thần kinh. Nguyên bào sợi đƣợc coi là tế bào chủ của trung bì, chúng sản sinh ra chất keo mạng lƣới (reticular collagen), các sợi đàn hồi và các chất nền của trung bì. Trung bì gồm hai lớp: lớp nhú và lớp dƣới [11]. Lớp nhú (Papillary dermis): Là một lớp tế bào mỏng, nằm sát ngay dƣới màng nền và lớp tế bào mầm của lớp đáy hình thành nhiều gai nhú gồ lên hình làn sóng. Lớp nhú có các sợi tơ tạo keo, sợi tơ đàn hồi, chất keo đặc giữa các sợi tơ và các tế bào liên kết, bạch cầu, tế bào Langerhans... Lớp nhú là nơi trao đổi các yếu tố tăng trƣởng, cytokine và các chất cơ bản của trung bì gắn kết với các tế bào biểu bì qua thụ cảm xuyên màng [11]. Lớp lƣới (Reticular dermis): Có chiều dày 4 - 5 mm, có ít tế bào và mạch hơn lớp nhú. Lớp lƣới chứa các bó sợi liên kết gồm các sợi tạo keo, sợi đàn hồi, các sợi bắt màu bạc. Lớp lƣới chia làm hai vùng: vùng trên (nông) có nhiều tế bào liên kết, nguyên bào sợi, tế bào viêm, các bó keo, các sợi chung dãn xếp theo hƣớng ngang và vùng dƣới (sâu). Chức năng của lớp lƣới là làm nền cho da bền chắc [11]. 1.1.2.3. Lớp hạ bì Là một lớp mô liên kết - mỡ, dày 0,25 mm đến vài cm. Hạ bì gồm 3 lớp: lớp mỡ, lớp chân nông và lớp tế bào dƣới da. Lớp mỡ: các bó xơ dày, to, hình nón quây thành những khoang chứa các tế bào mỡ. Chúng góp phần tạo hình, dự trữ năng lƣợng và cách nhiệt. Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1 mm. 8 Lớp tế bào dƣới da: là mô liên kết lỏng lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên cơ, gân, xƣơng. Các tổ chức tế bào lỏng lẻo này có khả năng thấm nƣớc và các chất hòa tan của dịch [12]. 1.1.3. Dấu hiệu lão hoá da 1.1.3.1. Dấu hiệu bên ngoài Có 3 biểu hiện chính của làn da lão hoá. Mỗi biểu hiện có ảnh hƣởng đến vẻ ngoài của da bằng mỗi cách khác nhau [12, 13]. Nếp nhăn Dấu hiệu đầu tiên có thể nhận biết lão hoá là các nếp nhỏ và nếp nhăn. Các nếp này xuất hiện ở các vùng khác nhau của da và là dấu hiệu dễ nhận biết nhất của lão hoá da. Xuất hiện đầu tiên là các nếp nhăn. Chúng đƣợc liên kết với sự chùng xuống của da và thƣờng gắn liền với sự giảm thể tích da [12]. Sự giảm mật độ da Một tình trạng da phổ biến của lão hoá da là giảm mật độ da, chúng biểu thị rõ ràng trên bề mặt làm da mỏng và yếu hơn. Không giống nhƣ nếp nhăn hay sự giảm thể tích, sự giảm mật độ da ảnh hƣởng đến làn da hơn là chỉ tập trung ở một vùng nhất định. Chúng thƣờng gắn liền với các nếp nhăn sâu và có xu hƣớng làm da nhìn có vẻ xỉn màu [12]. Sự giảm thể tích da Sự giảm thể tích da thông thƣờng thì rất khó để nhận biết, và cũng đƣợc biết là nhƣ là sự chảy xệ của da, sự mất đi các đƣờng nét. Không giống nhƣ sự giảm mật độ hay nếp nhăn, chúng thay đổi toàn bộ vẻ bên ngoài da theo cách mà da bị biến đổi nhƣng rất khó để xác định chính xác. Dễ nhận biết nhất là sự thu nhỏ thể tích da và các đƣờng nét của làn da bị chùng xuống, lỏng lẻo [12]. 1.1.3.2. Dấu hiệu bên trong Những sự thay đổi trong các lớp da sẽ thể hiện lên bề mặt da nhƣ là các dấu hiệu của lão hoá. Lớp biểu bì Quá trình tái tạo tế bào chậm hơn và sự sản sinh lipid bị suy giảm làm cho làn da bị khô ráp và sần sùi. Khi có hiện tƣợng lão hoá xảy ra, lớp da này trở nên nhạy cảm hơn với tia UV. Lúc này, vai trò của da trong việc tự lành vết thƣơng ít hiệu 9 quả hơn và chức năng miễn dịch suy yếu, dẫn đến việc khả năng da bị nhiễm trùng rất cao, và các vết thƣơng tự lành rất chậm [12]. Lớp trung bì Mỗi năm, làn da bị mất đi lƣợng collagen tự nhiên, cùng với sự thiếu hụt chất elastin đã làm cho các mô trung bì bị phá hủy. Lúc này cấu trúc của da bị tổn thƣơng và xuất hiện các nếp nhăn. Kế đến, sự đàn hồi của da suy giảm, làn da có xu hƣớng bị tổn thƣơng và các mao mạch bị phá vỡ, lƣu thông máu kém dẫn đến việc vận chuyển các chất dinh dƣỡng và oxy đến bề mặt da không đƣợc hiệu quả. Kết quả cuối cùng làm cho làn da không còn hồng hào và trở nên yếu hơn [12]. Lớp hạ bì Ở các lớp da sâu hơn, các thay đổi đáng chú ý là về kích thƣớc và số lƣợng các tế bào tạo lipid ở các lớp mỡ dƣới da. Chúng bị sụt giảm làm ảnh hƣởng rất lớn đến việc giảm thể tích da, và có thể làm cho các nếp nhăn sâu hơn, da bị hõm vào và các vết thƣơng khó tự lành đƣợc [12]. Lão hoá đƣợc gây ra bởi các sự thay đổi xảy ra ở mỗi lớp của da, ảnh hƣởng đến cả hình dạng và cấu trúc các thành phần trong da. 1.1.4. Nguyên nhân lão hoá da 1.1.4.1. Nguyên nhân bên trong Một số các nguyên nhân gây nên lão hoá da là không thể tránh đƣợc và không thể thay đổi đƣợc. Tuổi sinh học của mỗi loài động vật có vú nói chung và con ngƣời nói riêng quyết định sự thay đổi cấu trúc da và tính hiệu quả của chức năng của các tế bào. Qua thời gian, những tác nhân bên ngoài, đặc biệt là ánh sáng mặt trời sẽ tác động đến các mô liên kết, các sợi collagen, elastin bên trong da làm cho da bị lão hoá [12]. Yếu tố di truyền (đột biến gen, sự biến dƣỡng của tế bào, sự thay đổi nội tiết tố) đóng vai trò quan trọng trong việc lão hoá da. Sắc tộc và loại da mà chúng ta có đƣợc từ lúc sinh ra tạo nên sự khác biệt về độ nhanh chậm mà các dấu hiệu lão hoá xảy ra trên bề mặt của da. Ví dụ nhƣ làn da khá nhạy cảm thì có thiên hƣớng có nếp nhăn ở độ tuổi sớm, trong khi làn da châu Á thì dễ bị chứng không đều màu da và các nếp nhăn xuất hiện trễ hơn. Sự khô ráp da do tuổi tác cao có thể là do yếu tố di truyền học của mỗi ngƣời [12, 14]. 10 1.1.4.2. Nguyên nhân bên ngoài Các nhân tố bên ngoài đẩy nhanh sự lão hoá đều do sự oxy hoá da. Đây là sự giải phóng các phân tử đƣợc gọi là các gốc tự do hay các loại phản ứng oxy trong cơ thể. Thuyết các gốc tự do về quá trình lão hoá cho rằng chúng ta già đi là bởi sự tích lũy của các gốc tự do gây hại theo thời gian. Gốc tự do là một nguyên tử rất dễ bay hơi hay là phân tử có chứa các electron riêng lẻ ở lớp vỏ bên ngoài. Phần lớn các gốc tự do có khả năng làm tổn thƣơng cấu trúc tế bào bao gồm lipid và protein. Các gốc tự do bị giữ và trung hòa bởi các chất chống oxy hoá có trong da. Tuy nhiên, theo thời gian, chức năng làm các gốc tự do không hoạt động đƣợc của da bị suy yếu. Kết quả là gây tổn thƣơng đến các thành phần cấu thành tế bào. Sự oxy hoá da còn bị ảnh hƣởng bởi các nhân tố về lối sống [12, 13]. Ánh nắng mặt trời Tiếp xúc nhiều với ánh nắng mặt trời là nhân tố bên ngoài cơ bản gây ra việc lão hoá da thông qua sự oxy hoá da. Da bị thƣơng tổn do phơi nắng quá nhiều và tiếp xúc với tia UV mỗi ngày đƣợc gọi là chứng làm cho da mất cân bằng sắc tố [15]. Ô nhiễm Việc da tiếp xúc với ô nhiễm môi trƣờng quá mức có thể làm cho giải phóng các gốc tự do gây hại cho da. Đồng thời khi da tiếp xúc nhiều dƣới ánh nắng mặt trời làm quá trình oxy hoá da nhanh hơn [13, 16]. Hút thuốc lá Các chất hoá học và nicotin trong thuốc lá là nguyên nhân gây nên sự gia tăng các gốc tự do ở da. Giống nhƣ ô nhiễm môi trƣờng, việc hút thuốc lá sẽ thúc đẩy quá trình oxy hoá da nhanh hơn [12, 13]. Chế độ dinh dưỡng Các chất chống oxy hoá là các phân tử với khả năng trung hòa các gốc tự do gây hại và làm da nhanh lão hoá. Một chế độ ăn thiếu các chất chống oxy hoá sẽ gia tăng quá trình lão hoá. Ăn nhiều trái cây và rau củ có chứa các chất chống oxy hoá là một phần quan trọng của phƣơng pháp khoa học ngăn chặn quá trình lão hoá xảy ra [12, 14]. 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ GIẢI PHẪU DA CHUỘT NHẮT TRẮNG MUS MUSCULUS VAR. ALBINO 1.2.1. Khái quát về chuột trắng Mus musculus var. albino Nòi: Chuột trắng Mus musculus var. albino Linnaeus, 1758 Loài: Chuột trắng Mus musculus Linnaeus, 1758 Giống: Chuột Mus Linnaeus,1758 Họ: Chuột Muridae Phân bộ: Răng đơn hàng Simplicidentata Bộ: Gặm nhấm Rodentia Tổng bộ: Gặm nhấm Glires Phân lớp: Thú nhau Placentalia Lớp: Thú (Hữu nhũ có vú) Mammalia Tổng lớp: Động vật có bốn chân Tetrapoda Phân ngành: Có xƣơng sống Vertebrata hay có hộp sọ Craniota Ngành: Có Dây sống Chordata Giới: Động vật Animalia [17]. Chuột nhắt trắng tên Latinh là Mus musculus var. albino, hình dạng tƣơng tự với chuột nhắt nhà. Chuột nhắt trắng có đặc điểm: lông trắng, mắt sáng, tai vểnh, đuôi dài, miệng thuyền. Chuột mới sinh nặng 1 - 2 g, chuột trƣởng thành (8 - 12 tuần tuổi) dài 12 - 15 cm (tính từ mũi tới chóp đuôi), nặng từ 18 – 35 g [18, 19]. Chuột nhắt trắng thành thục giới tính sau khoảng 4 - 6 tuần tuổi, mang thai từ 19 - 21 ngày, chu kì động dục 3 - 5 ngày, đẻ 5 - 11 con/lứa, đẻ từ 5 - 10 lứa/năm và số lƣợng con giảm dần theo độ tuổi. Chuột đực và chuột cái đƣợc phân biệt dựa vào khoảng cách giữa lỗ hậu môn và lỗ sinh dục (khoảng cách này ở con đƣợc dài hơn ở con cái), đặc điểm sinh dục ngoài (chuột cái có vú, chuột đực có hai tinh hoàn to) [19, 20]. 1.2.2. Cấu trúc da của chuột trắng Mus musculus var. albino Ở chuột trắng da có cấu tạo tƣơng tự nhƣ ở ngƣời gồm 3 lớp chính: biểu bì, trung bì và hạ bì. Sự tƣơng quan về mặt cấu tạo giữa da ngƣời và da chuột đƣợc thể hiện qua bảng: