Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn streptomyces alboniger

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------- Ngô Văn Hiếu NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ALBONIGER LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 11/2021 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------- Ngô Văn Hiếu NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ALBONIGER Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO Hà Nội, tháng 11 năm 2021 Lời cam đoan Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Thị Phương Thảo. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2021 Tác giả luận văn Ngô Văn Hiếu Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí từ nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thư – Bộ Khoa học và Công nghệ (mã số nhiệm vụ: NĐT.47.KR/18). Luận văn tốt nghiệp cao học này được hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Thị Phương Thảo đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt và giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Ứng dụng Hóa Sinh Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, phòng Tổng hợp Hữu cơ - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo của Học viện Khoa học và Công nghệ đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành cho tôi trong những năm tháng qua. Học viên cao học Ngô Văn Hiếu được tài trợ bởi Tập đoàn Vingroup – Công ty CP và hỗ trợ bởi chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata), mã số VINIF.ThS.107. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè, những người đã luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua./. Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Ngô Văn Hiếu Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Viết tắt Tiếng Anh 1 Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy 13 Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy HNMR CNMR Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 XK Xạ khuẩn VSV Vi sinh vật CKS Chất kháng sinh XKĐK Xạ khuẩn đối kháng Sắc ký cột CC Column chromatography NB-40 Neurological disease DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT Minimum bactericidal Nồng độ diệt khuẩn concentration tối thiểu Human promyelocytic leukemia Tế bào ung thư máu cấp cell line ở người MBC HL-60 PTP1B Protein tyrosine phosphatase 1B MCF-7 Breast carcinoma cell line Tế bào ung thư vú Gram dương Gr(+) Hep-G2 Hepatocellular carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô gan HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị hạt coherence HSQC IC50 nhân qua nhiều liên kết Heteronuclear single Phổ tương tác dị hạt quantum coherence nhân qua 1 liên kết Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration Gr(-) Gram âm TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng ESI-MS Electronspray ionization mass Phương pháp khối spectrum KB phổ Human epidemoid Tế bào ung thư biểu carcinoma cell line mô người MỤC LỤC CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ XẠ KHUẨN .................................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn ........................................................... 3 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................... 3 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của xạ khuẩn .................................. 5 1.1.1.3. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn ..................................................... 6 1.1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn .................................................................. 7 1.1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp phân lập từ xạ khuẩn................................................................................... 7 1.1.2.1. Các hợp chất kháng sinh ............................................................ 8 1.1.2.2. Các hợp chất kháng lao ............................................................ 10 1.1.2.3. Các hợp chất chống ung thư ..................................................... 11 1.1.2.4. Nghiên cứu thành phần hóa học từ các chủng vi sinh vật tại Việt Nam...................................................................................................... 14 1.2. CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ALBONIGER................... 17 1.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger .... 18 1.2.2. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học được phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces alboniger .................................................................. 20 1.2.2.1. Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư ................................. 20 1.2.2.2. Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ....................................... 21 1.2.2.3. Các hợp chất khác .................................................................... 23 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM ................................................................ 25 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 25 2.1.1. Vật liệu ........................................................................................... 25 2.1.2. Hóa chất ......................................................................................... 26 2.1.3. Thiết bị ........................................................................................... 26 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 26 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn ...... 26 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất ............................ 29 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào..... 29 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .......................... 29 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ....................... 31 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................... 33 3.1. KẾT QUẢ ............................................................................................ 33 3.1.1 Phân lập và tạo sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger .. 33 3.1.2. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng Mycobacterium smegmatis ................................................................................................. 34 3.1.3. Phân loại 5 chủng xạ khuẩn ............................................................ 35 3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VH19-A121 .................................................................. 37 3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất VTBE.01 .......................... 37 3.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 121CN.02 ......................... 42 3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC................ 48 3.3.1. Hoạt tính kháng lao và kháng vi sinh vật kiểm định .................... 48 3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................. 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. . PHỤ LỤC ...................................................................................................... . Danh mục các bảng Bảng 1. 1: Sự thay đổi của Streptomyces alboniger ở các nhiệt độ khác nhau [37] .............................................................................................................. 18 Bảng 1. 2: Sự thay đổi của Streptomyces alboniger ở các điều kiện môi trường khác nhau [37] .................................................................................. 19 Bảng 1. 3: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất puromycin A (1), puromycin B (2) và puromycin C (3) [39] ...................................................................... 21 Bảng 1.4. Các hợp chất thuộc khung pamamycin…………………………...22 Bảng 1. 5: Phổ kháng khuẩn của panamycin [41] ......................................... 23 Bảng 3. 1: Các chủng XK được phân lập tại các địa điểm khác nhau ........... 33 Bảng 3. 2: Kết quả hoạt tính kháng M. smegmatis của các chủng XK .......... 34 Bảng 3. 3: Bảng phân loại dựa trên hình thái và 16S rADN ......................... 35 Bảng 3. 4: Số liệu phổ NMR của hợp chất VTBE.01 và obscurolide B2 [53] ..................................................................................................................... 41 Bảng 3. 5: Số liệu phổ NMR của hợp chất 121CN.02 và Chartreusin [54] ... 46 Bảng 3.6: Hoạt tính kháng lao của 2 hợp chất VTBE.01 và 121CN.02…….49 Bảng 3. 7: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của hợp chất 121CN.02 ..................................................................................................... 49 Bảng 3. 8: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 121CN.02 ........................ 50 Danh mục các hình Hình 1. 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn ......................................................... 4 Hình 1. 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn ....................................................................... 5 Hình 1.3: Các hợp chất kháng sinh được phân lập từ các chủng vi sinh vật………………………………………………………………………..........9 Hình 1.4: Các hợp chất kháng lao được phân lập từ các chủng xạ khuẩn………………………………………………………………………...11 Hình 1.5: Các hợp chất chống ung thư được phân lập từ các chủng vi sinh vật ……………………………………………………………………………….13 Hình 1.6: Các hợp chất kháng lao được phân lập từ các chủng xạ khuẩn tại Việt Nam………………………………………………………………………….14 Hình 1.7: Các hợp chất thuộc lớp cyclopeptit từ vi sinh vật biển tại Việt Nam từ năm 2013-2017. ………………………………………………………….15 Hình 1.8: Các hợp chất thứ cấp được phân lập từ chủng vi sinh vật Micromonospora sp G019 từ vùng biển Hạ Long…………………………..16 Hình 1. 9: Chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger dưới kính hiển vi điện tử…….………………………………………………………………………………..17 Hình 1. 10: Hình dạng Streptomyces alboniger trên đĩa thạch tổng hợp……18 Hình 1.11: Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư được phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger…………………………………………………21 Hình 1.12 : Các hợp chất thuộc khung pamamycin…..………………………..21 Hình 1.13: Các hợp chất khác được phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger. ……………………………………………………………………………23 Hình 2. 1: Sơ đồ phân lập các chất từ các dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces alboniger…………………………………………………………...………..38 Hình 3. 1: Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng XK được phân lập ........... 33 Hình 3. 2: Ảnh minh họa khả năng kháng M. smegmatis của các chủng XK 34 Hình 3. 3: Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng XK có hoạt tính kháng M. smegmatis cao nhất ...................................................................................... 35 Hình 3. 4: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1H-1H COSY ( ) của hợp chất VTBE.01 .............................................................................................. 37 Hình 3. 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất VTBE.01………...………………….37 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất VTBE.01……………….…………...38 Hình 3. 7: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01 .............................................. 39 Hình 3. 8: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01 ............................................. 39 Hình 3. 9: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01 ........................................... 40 Hình 3. 10: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1H-1H COSY ( ) của hợp chất 121CN.02 ............................................................................................. 42 Hình 3.11: Phổ (-)-ESI-MS của hợp chất 121CN.02………………………..42 Hình 3. 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 121CN.02 ....................................... 43 Hình 3. 13: Phổ 13C-NMR của hợp chất 121CN.02 ...................................... 44 Hình 3. 14: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 ........................................... 45 Hình 3. 15: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 .......................................... 46 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, do số nhóm vi sinh vật (VSV) kháng thuốc và độc tính của một số thuốc kháng sinh (KS) bán tổng hợp đang ngày càng gia tăng, các nhà khoa học đã hướng tới nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất từ VSV, đặc biệt là xạ khuẩn (XK). Đến nay, với số lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện, XK đã trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành công nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc mới, đặc biệt là thuốc kháng sinh [1]. Streptomyces là chi xạ khuẩn lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh Streptomycetaceae. Có hơn 500 loài XK thuộc chi Streptomyces đã được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là chủng khuẩn gram dương (Gr(+)), có bộ gen với tỉ lệ G-C %(tỉ lệ phần trăm Cytosine-Guanine) cao. XK thuộc chi Streptomyces được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát, bùn dưới đáy sông, biển. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất, thường sống ở đất có vai trò là VSV phân hủy. Chủng VSV này sản xuất hơn một nửa số thuốc KS trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế. Chủng XK Streptomyces alboniger là một chủng thuộc chi Streptomyces. Một số nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp được sản sinh từ chủng này cho thấy đây là một chủng hứa hẹn tiềm năng sản sinh ra các hợp chất kháng sinh như puromycin, paramycin và các hoạt chất có hoạt tính sinh học thú vị [2]. Việt Nam là một đất nước có địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng đa dạng và phong phú. Vì vậy, các chủng XK cũng sẽ sản sinh ra các hợp chất thứ cấp rất đa dạng và phong phú. Qua tra cứu tài liệu cho thấy, cho đến nay trên thế giới có rất ít tài liệu công bố về các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger. Ở Việt Nam chưa có nhóm nghiên cứu nào công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất 2 phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger” thu tại đỉnh Mây Bạc, rừng Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Kết quả của đề tài sẽ góp phần vào kho tàng hợp chất thiên nhiên được phân lập từ xạ khuẩn ở Việt Nam. Mục đích nghiên cứu: + Nghiên cứu phân lập và chiết tách các chủng xạ khuẩn từ dịch sinh khối + Xác định cấu trúc các chất sạch phân lập được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger + Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất sạch phân lập được 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ XẠ KHUẨN 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn (Bacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn XK là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) [3]. Các loài liên quan đến bệnh ở người và động vật bao gồm Nocardia, Gordona, Tsukamurella, Streptomyces, Rhodococcus, Streptomycetes và Corynebacteria. Các chi kỵ khí có tầm quan trọng trong y tế bao gồm Actinomyces, Arachnia, Rothia, và Bifidobacterium [4]. XK có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của XK phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Trong mỗi gam đất thường có trên 1 triệu XK (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch). XK có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh, chất nhân và các thể ẩn nhập [3]. Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 µm có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào và chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozit, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 – 120 Å, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng 50 Å. Thành tế bào XK không chứa cellulose và chitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [3]. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 µm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK. Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và polisacarit. Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, 4 toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty [3]. Đa số XK có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám ... Màu sắc của XK là một đặc điểm phân loại quan trọng. Đường kính sợi của XK khoảng từ 0,1 – 0,5 μm. Có thể phân biệt được hai loại sợi khác nhau. Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc XK, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh. Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng. Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường (hình 1.1) [3]. Hình 1. 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn Khuẩn lạc XK thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loài XK và tùy điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm là do XK sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức 5 chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm (hình 1. 2) [3]. Hình 1. 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å, gồm có 3 lớp, giúp cho bào tử tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [3]. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của xạ khuẩn XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên, khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau. Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 – 30o C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) thường chỉ nằm trong khoảng 18 – 28o C. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5. XK không có giới tính [4]. XK có khả năng hình thành enzym, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các CKS nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men. Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [4]. 6 1.1.1.3. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn Phân loại theo phương pháp truyền thống: Cũng như đối với vi khuẩn, việc phân loại XK hiện nay chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA. Bên cạnh đó, các đặc điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được kết hợp để định danh XK một cách chính xác đến tên loài. Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào được coi là đặc điểm quan trọng nhất. Các đặc điểm khác như thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC trong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại XK. Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong phân loại XK là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời [3]. Phân loại theo phương pháp hiện đại: Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng. rRNA là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì: Phân tử này có mặt trong mọi tế bào VSV. Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên riboxom, bộ máy tổng hợp protein của tế bào. Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ. Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến hóa. Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá. Mặc dù mang tính đặc trưng cao, các gen mã hóa cho rRNA cũng chứa những vùng có mức độ đặc trưng thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác nhau. Dựa vào những vùng sai khác trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch 7 đại toàn bộ chiều dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi [3]. 1.1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn XK là nhóm VSV phân bố rộng rãi trong đất, chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như cellulose, tinh bột v.v... góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính này còn được ứng dụng trong quá trình chế biến phân hủy rác v.v... Nhiều XK có khả năng sinh chất KS. Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các CKS dùng trong y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm [3]. XK có vai trò chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng XK có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật. Theo Kamada (1974), khi điều tra VSV đối kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi nào có nhiều XK thì ở đó các loài Fusarium biến mất nhanh. Thông thường một loài xạ khuẩn đối kháng (XKĐK) có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng các chủng có hoạt phổ rộng phải chú ý tránh XK ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có lợi trong vùng rễ. Không phải tất cả XK có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4% – 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. XK ngoài việc chống nấm bằng cách tiết chất đối kháng còn sinh enzym tác động lên hệ VSV như enzym chitinase tác động lên thành tế bào nấm mốc, các enzym phân giải hợp chất hữu cơ khó tan như cellulase giúp phân giải cellulose tạo thành phân bón hữu cơ cho cây trồng. Dùng để sản xuất nhiều enzym như protease, amylase, cellulase, chitinase… một số axit amin và axit hữu cơ. Ngoài ra, nhiều loài XK còn sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật cũng như các loài VSV có lợi cho đất. Một số chủng XK vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến trùng hại cây trồng. XK còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Một số XK có thể gây bệnh cho người, động vật [4]. 1.1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất 8 thứ cấp phân lập từ xạ khuẩn XK được biết đến là thành phần tích cực và đa dạng về loài trong quần xã VSV biển cũng như đa dạng về các hệ sinh thái biển khác. VSV có giá trị này có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp có cấu trúc với hoạt động sinh học phong phú và đa dạng. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất chuyển hóa thứ cấp của XK có tiềm năng như thuốc KS mới, kháng khuẩn, kháng lao, chất chống khối u, chất ức chế miễn dịch và chất ức chế enzym [5]. Cho đến nay, khoảng 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học do VSV tạo ra đã được báo cáo, 10.000 trong số các hợp chất này được phân lập từ XK [6]. Điều đáng nói là trong số 10.000 hợp chất, khoảng 80% được thu nhận từ Streptomyces, đây là chi sản xuất trong thế giới VSV [7]. 1.1.2.1. Các hợp chất kháng sinh Trong những năm bốn mươi và đầu những năm mươi của thế kỉ 20, hầu hết các nhóm KS quan trọng được phát hiện tetracyclines (1), cephalosporin (2), aminoglycoside (3), macrolide (4). Thuốc KS được phát hiện trong thời kỳ này chủ yếu được phân lập từ các loài Streptomyces, đại diện cho khoảng 70- 80% của tất cả các hợp chất được phân lập. Rất nhiều trong số các hợp chất chuyển hóa thứ cấp hình thành nên hoạt tính KS từ VSV có một số đặc điểm cấu trúc chung. Bao gồm các yếu tố cấu trúc đặc trưng nhất như là khung cyclopeptide (5), depsipeptide (6) và các dẫn xuất của hệ thống vòng lactam (7), macrolacton (8,9), glycopeptide (10) đa vòng khác nhau, điều đặc biệt là các dạng khung này thường được phát hiện trong các sản phẩm XK [6]. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng một chủng Streptomyces sp. được thu thập từ mẫu trầm tích tại Guam có khả năng sinh kháng sinh piperazimycin A (11). Những nghiên cứu sàng lọc của viện ung thư quốc gia Mỹ (NCI) cho thấy hợp chất này có khả năng gây độc tế bào và có hoạt tính kháng sinh với phổ rộng [6]. 9 Hình 1.3: Các hợp chất kháng sinh được phân lập từ các chủng vi sinh vật