Tài liệu Luận văn thạc sĩ đánh giá biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu jak stat ở bệnh nhân ung thư biểu mô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Hoàng Văn Tổng 2. TS. Vũ Thị Thu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cho luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều tập thể và cá nhân. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hoàng Văn Tổng - Phòng An toàn Sinh học, Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và TS. Vũ Thị Thu - Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tin tưởng giao đề tài và hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các kỹ thuật viên bộ môn Sinh lý bệnh Học viện Quân y đã hướng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành thí nghiệm của đề tài luận văn này. Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ Nguyễn Việt Phương và các bác sĩ viện K cơ sở 3 đã cung cấp mẫu mô gan và thông tin lâm sàng để tôi có thể hoàn thành thí nghiệm và phân tích số liệu của luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2020 Học viên TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Trần Thị Phương Thảo, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: 1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hoàng Văn Tổng và TS. Vũ Thị Thu. 2. Công trình này không trùng lập với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2020 Người viết cam đoan Trần Thị Phương Thảo 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................1 LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................2 CHỮ VIẾT TẮT..........................................................................................................5 DANH MỤC HÌNH.....................................................................................................6 DANH MỤC BẢNG...................................................................................................8 ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................9 Chương 1. TỔNG QUAN..........................................................................................11 1.1. Virus viêm gan B và ung thư gan........................................................................11 1.1.1. Tình hình nhiễm hepatitis B virus trên thế giới và ở Việt Nam........................11 1.1.2. Con đường nhân lên của virus..........................................................................11 1.1.3. HBV và đáp ứng miễn dịch của cơ thể.............................................................13 1.2. Ung thư biểu mô tế bào gan................................................................................16 1.2.1 Thực trạng.........................................................................................................16 1.2.2. Các giai đoạn của ung thư biểu mô tế bào gan.................................................17 1.2.3. Ung thư gan do HBV.......................................................................................19 1.2.4. Cơ chế gây ung thư của HBV..........................................................................19 1.3. Con đường tín hiệu JAK/STAT...........................................................................20 1.3.1. Cấu trúc của con đường JAK/STAT.................................................................20 1.3.2. Các phối tử và các thụ thể của con đường JAK/STAT.....................................21 1.3.3. Cơ chế truyền tin của con đường JAK/STAT...................................................23 1.3.4. Điều hòa con đường JAK/STAT.......................................................................30 1.3.4.1. Các protein ức chế con đường truyền tín hiệu JAK/STAT............................30 1.3.4.2. Protein Tyrosine phosphatase (PTPs) điều hòa con đường JAK/STAT.........33 1.4. Tính thiết yếu của đề tài......................................................................................33 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................35 2.1. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................35 2.2. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................35 2.3. Lựa chọn đối tượng, thu thập và bảo quản mẫu nghiên cứu................................35 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................35 2.3.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu.......................................................................................35 2.3.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu................................................36 3 2.4. Phương pháp và kỹ thuật sử dụng.......................................................................36 2.4.1. Phương pháp tách chiết RNA...........................................................................36 2.4.2. Quang phổ hấp thụ đo nồng độ RNA...............................................................37 2.4.3. Kỹ thuật xác định biểu hiện gen bằng phương pháp QuantiGene Plex............38 2.5. Phân tích kết quả.................................................................................................46 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................................48 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.........................................................48 3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới.......................................................................................48 3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng....................................................................................48 3.2. Mức độ biểu hiện các gen nghiên cứu...............................................................49 3.2.1. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm gen tín hiệu.........................................................................................................49 3.2.2. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm gen JAK/STAT....................................................................................................60 3.2.3. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm gen đích chức năng..............................................................................................63 3.2.4. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm gen điều hòa........................................................................................................68 3.3. Tương quan biểu hiện các gen nghiên cứu với chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng...74 3.3.1. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số mô bệnh học............................74 3.3.2. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số cận lâm sàng............................76 KẾT LUẬN...............................................................................................................83 KIẾN NGHỊ...............................................................................................................83 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................84 4 CHỮ VIẾT TẮT Các từ viết tắt Phần viết đầy đủ (Tiếng Anh) AFP Alpha-fetoprotein ALT Alanin Amino Transferase AST Aspartate Amino Transferase Carbohydrate antigen 19-9 hoặc CA19-9 cancer antigen 19-9 CEA Carcinoembryonic antigen DC Dendritic cells HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B evolope Antigen HBsAg Hepatitis B surface Antigen HBV Hepatitis B virus HCC Hepatocellular Carcinoma IFN Interferon IL Interleukin The Janus kinase/signal JAK/STAT transducers and activators of transcription LCU MDSCS MELD NF-κB NK ORF SOCS TLR TNF Phần viết đầy đủ (Tiếng Việt) Alpha-fetoprotein Alanin Amino Transferase Aspartate Amino Transferase Kháng nguyên ung thư CA19-9 Kháng nguyên ung thư CEA Tế bào tua Kháng nguyên lõi HBV Kháng nguyên e của HBV Kháng nguyên bề mặt HBV Virus viêm gan B Ung thư biểu mô tế bào gan Interferon Interleukin Con đường truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã Lân cận u Myeloid-derived suppressor cells Tế bào có nguồn gốc tủy xương Model for End-Stage Liver Mô hình bệnh gan giai đoạn cuối Disease Yếu tố hạt nhân kappa-ánh sáng Nuclear factor kappa-lightchuỗi tăng cường của các tế bào chain-enhancer of activated B B kích hoạt Natural Killer cell Tế bào giết tự nhiên Open reading frame Khung đọc mở Suppressor of cytokine signaling Ức chế tín hiệu cytokine Toll-like Recepter Thụ thể giống Toll Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u 5 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Quá trình nhân lên của HBV trong cơ thể ...............................................12 Hình 1.2: Đáp ứng miễn dịch của đại thực bào với các thành phần của HBV ........13 Hình 1.3: Đáp ứng miễn dịch của Đại thực bào và hệ gen của HBV ......................14 Hình 1.4: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan ....................15 Hình 1.5: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan ....................21 Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn cấu trúc các thành phần của con đường JAK-STAT ......24 Hình 1.7: Sơ đồ hoạt hóa STAT ..............................................................................24 Hình 1.8: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư ...........................25 Hình 1.9: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư ...........................27 Hình 1.10: Cơ chế phân tử của protein SOCSs khi điều hòa các tín hiệu cytokine ...31 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu của đề tài.....................................................................35 Hình 2.2: Quy trình xác định mức độ biểu hiện gen ...............................................38 Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CNTFR, EPOR, IL4R và IL4 ở mô LCU và mô U......................................................................................50 Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CSF1R, EGFR, FAS, TSLP ở mô LCU và mô U.......................................................................................52 Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen GHR, INSR, IFNAR1, IL6ST ở mô LCU và mô U......................................................................54 Hình 3.4: Mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10, IL10RA, LEP, LEPR, PRLR ở mô LCU và mô U....................................................................................................56 Hình 3.5: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen LEP, CNTFR, EGFR, FAS ở mô LCU và mô U.................................................................................................58 Hình 3.6: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen IL4, IL4R, INSR, PRLR ở mô LCU và mô U....................................................................................................58 Hình 3.7: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô LCU và mô U................................................................................................................... 60 Hình 3.8: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô LCU và mô U................................................................................................................... 60 Hình 3.9: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA gen STAT5B ở mô LCU và mô U....62 6 Hình 3.10: Mức độ biểu hiện mRNA các gen A2M, CCND1, CEBPB, CRK ở mô LCU và mô U..........................................................................................................63 Hình 3.11: Mức độ biểu hiện mRNA các GPB1, CRP, MPL ở mô LCU và mô U...64 Hình 3.12: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen CEBPB và MPL ở mô LCU và mô U..........................................................................................................67 Hình 3.13: Mức độ biểu hiện mRNA các gen CISH, SOCS2, SOCS3, SLA2 ở mô LCU và mô U..........................................................................................................68 Hình 3.14: Mức độ biểu hiện mRNA các gen PTPN1, PTPN6, PTPRC, SMAD1, SMAD2, SMAD3 ở mô LCU và mô U.....................................................................71 Hình 3.15: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA CISH ở mô LCU và mô U.........73 7 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giai đoạn của ung thư gan và tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm ..........16 Bảng 1.2: Tiêu chuẩn phân giai đoạn HCC theo AJCC ..........................................17 Bảng 1.3: Các phối tử của con đường JAK/STAT và đích truyền tín hiệu ..............22 Bảng 1.4: STAT1, STAT4 và các gen đích hoạt hóa phiên mã ................................26 Bảng 1.5: STAT3 và các gen đích hoạt hóa phiên mã .............................................28 Bảng 1.6: STAT 5, STAT6 và các gen đích hoạt hóa phiên mã ...............................30 Bảng 1.7: Chức năng, vai trò của SOCS trong sinh lý ............................................32 Bảng 2.1: Dụng cụ hóa chất chính dùng trong nghiên cứu......................................36 Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp hạt từ......................................................................39 Bảng 2.3: Các gen tín hiệu.......................................................................................43 Bảng 2.4: Các gen JAK/STAT..................................................................................44 Bảng 2.5: Các gen đích............................................................................................44 Bảng 2.6: Các gen điều hòa.....................................................................................45 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi và giới của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu...........48 Bảng 3.2: Đặc điểm huyết học của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu..............48 Bảng 3.3: Đặc điểm cận lâm sàng............................................................................49 Bảng 3.4: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen tín hiệu giữa mô LCU và mô U....................................................................................................57 Bảng 3.5: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen JAK/STAT giữa mô LCU và mô U............................................................................................62 Bảng 3.6: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen đích chức năng giữa mô LCU và mô U....................................................................................67 Bảng 3.7: . Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen điều hòa giữa mô LCU và mô U....................................................................................................73 Bảng 3.8: Kết quả phân tích hồi quy đa biến 76 gen và mức độ xâm lấn mạch...........74 Bảng 3.9: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số Fibrinogen..........76 Bảng 3.10: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AST (SGOT).........77 Bảng 3.11: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AFP...................80 Bảng 3.12: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số CEA..................81 Bảng 3.13: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số MELD..............81 8 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư gan là loại ung thư phổ biến thứ sáu và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới vào năm 2018, với khoảng 841.000 trường hợp mới phát hiện và 782.000 ca tử vong hàng năm. Tỷ lệ mắc và tử vong cao gấp hai đến ba lần ở nam giới so với nữ giới ở hầu hết các khu vực trên thế giới. Ung thư gan nguyên phát bao gồm: ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC), chiếm khoảng 75% ‐ 85%; ung thư đường mật chiếm khoảng 10%‐15% và một số loại hiếm gặp khác . Một trong những nguyên nhân chính dẫn tới HCC là do nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) mạn tính, chiếm ít nhất 50% trường hợp HCC trên toàn thế giới . HBV là một loại virus tấn công vào các tế bào gan gây ra viêm gan cấp tính và mạn tính. Theo thống kế của tổ chức y tế thế giới (World Health Organization -) có khoảng 780.000 người trên thế giới chết mỗi năm do HBV và các bệnh lý gan liên quan như xơ gan và ung thư gan. Viêm gan B hiện tại đang là gánh nặng sức khỏe cộng đồng nhất là tại những nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Trong thời kỳ nhiễm HBV, hệ miễn dịch bẩm sinh đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng tới cơ chế gây bệnh của HBV bằng việc ức chế sao chép trong giai đoạn đầu sau nhiễm . Một trong những cơ chế đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của cơ thể khi bị nhiễm HBV là sự tiết ra các interferon (IFN) và các cytokine khi kích hoạt quá trình viêm. Quá trình này được thực hiện nhờ con đường tín hiệu JAK/STAT (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription - con đường truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã). Con đường tín hiệu JAK/STAT hoạt động thông qua sự gắn phối tử là các IFN, cytokine với thụ thể tiếp nhận trên bề mặt tế bào; protein JAK được hoạt hóa bằng phosphoryl dẫn tới sự phosphoryl hóa protein STAT. Sau khi được phosphoryl hóa, STAT di chuyển vào trong nhân tế bào và thực hiện hoạt hóa yếu tố phiên mã của các gen trong con đường tín hiệu đáp ứng lại với những kích thích từ bên ngoài môi trường. Bên cạnh đó, khi STAT được hoạt hóa quá mức dẫn đến sự biểu hiện mạnh mẽ của các gen tiền ung thư (oncogene) là nguyên nhân dẫn tới sự hình thành và phát triển ung thư trong đó có HCC . 9 Từ điều kiện thực tế đặt ra, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Đánh giá biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm gan B” với các mục tiêu sau: - Tìm hiểu mức độ biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT ở mô ung thư và mô lành. - Tìm hiểu mối tương quan trong biểu hiện của các gen nghiên cứu trong mô ung thư và mô lành. - Tìm hiểu mối liên quan giữa mức độ biểu hiện gen với các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm gan B. 10 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Virus viêm gan B và ung thư gan 1.1.1. Tình hình nhiễm hepatitis B virus trên thế giới và ở Việt Nam Nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus - HBV) hiện đang là một vấn đề lớn trong sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới, là nguyên nhân phổ biến gây ra các bệnh lý gan và ung thư gan. Theo số liệu thống kê của tổ chức y tế thế giới, tính đến thời điểm tháng 7 năm 2018, ước tính có khoảng 257 triệu người đang bị nhiễm HBV. Số liệu thống kê trong năm 2015, có 887.000 ca tử vong do nhiễm HBV, chủ yếu là do các biến chứng bao gồm xơ gan và HCC. Trong đó có đến 40% nam giới và 15% phụ nữ bị nhiễm HBV mạn tính tử vong vì xơ gan và HCC mỗi năm. Cứ 100.000 thì có khoảng 20 người được chẩn đoán mắc HCC, đây là bệnh lý nguy hiểm được xếp sau ung thư phổi và là một trong những bệnh phổ biến ở các nước đang phát triển . Tại Việt Nam, năm 2012, tỷ lệ các ca xét nghiệm dương tính với kháng nguyên bề mặt của HBV ( Hepatitis B surface Antigen-HBsAg) chiếm từ 10% đến 20% trong toàn dân, từ 20% đến 40% ở những người tiêm chích ma túy và bệnh nhân dương tính với HIV . Nghiên cứu dịch tễ học năm 2008 đã sử dụng mô hình toán học dự đoán tỷ lệ mắc HBV ở Việt Nam qua các năm. Ước tính số người nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam đã tăng từ 6,4 triệu ca vào năm 1990 lên 8,4 triệu ca vào năm 2005. Tỷ lệ lưu hành HBV có thể được quan sát giữa năm 2003 (8,6 triệu ca) và 2025 (8 triệu ca). Tỷ lệ mắc xơ gan liên quan đến HBV, tỷ lệ HCC và tử vong liên quan đến HBV được dự đoán sẽ tăng đáng kể trong 15 năm tới. Ước tính số ca tử vong liên quan đến xơ gan, HCC và liên quan đến HBV sẽ tăng từ 36.500; 15.600 và 23.300 ca vào năm 2005 tương ứng lên 58.600; 25.000 và 40.000 vào năm 2025 . 1.1.2. Con đường nhân lên của virus HBV là một thành viên của họ Hepadnaviridae, có hệ gen là DNA. HBV nhân lên trong tế bào gan thông qua phân tử RNA trung gian và có thể chèn hệ gen vào hệ gen của vật chủ . Con đường nhân lên của HBV được được mô tả trong Hình 1.1. Khi nhiễm vào cơ thể, HBV xâm nhập vào các tế bào gan thông qua quá trình hoạt động của các protein bề mặt virus. Trong các thụ thể liên quan đến quá trình 11 xâm nhập của virus, carboxypeptidase D là đóng vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập của HBV. Sau khi đưa hệ gen của virus vào nhân của tế bào chủ, các vùng cách giữa hai mạch trong hệ gen của virus được sửa chữa bởi protein pol, DNA của virus được chuyền hóa thành dạng DNA vòng (cccDNA) . Hình 1.1: Quá trình nhân lên của HBV trong cơ thể DNA của HBV dạng vòng là khuôn để phiên mã của các nhóm gen và các RNA của hệ gen và là thành phần ổn định trong chu trình sao chép của virus (Hình 1.2; 1.3). Sau khi xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ, các cấu trúc ARN được tạo ra có vai trò làm sợi trung gian cho quá trình nhân đôi hệ gen virus. Các RNA pregenomic (pgRNA) được tổng hợp làm khuôn cho phiên mã ngược và là RNA thông tin cho gen lõi và polymerase; pre-core RNA định hướng dịch mã của sản phẩm gen precore. Protein HBsAg lớn (L-HBsAg) được dịch từ RNA subgenomic 2,4 kb, các protein HBsAg trung gian (MHBsAg) và nhỏ (S-HBsAg) nhỏ từ các dạng khác nhau của RNA 2,1 kb và protein HBxAg từ RNA 0,7 kb . Sự sao chép hệ gen HBV kết thúc bằng sự đóng gói của bộ gen trong lõi capsid. Tín hiệu đóng gói là một phần tử cis-acting được gọi là epsilon, có chứa cấu trúc vòng lặp. Protein của pol tương tác với epsilon và hòa hợp với protein lõi tạo thành nucleocapsid. Sau khi đóng gói, pol trung hòa phiên mã ngược của pgRNA thành DNA sợi ngoại vi và tổng hợp sợi dương sau đó. Dạng DNA vòng được hoàn thành thông qua một số bước phức tạp trong chuyển giao giữa hai sợi âm và dương. Cuối cùng, hệ gen của virus tương tác với các protein trong lưới nội chất để tập hợp 12 thành virion trưởng thành, sau đó được đi ra tạo thành virus hoàn chỉnh xâm nhập vào các tế bào khác . 1.1.3. HBV và đáp ứng miễn dịch của cơ thể Hậu quả nhiễm HBV cũng như mức độ nghiêm trọng của bệnh lý gan do HBV gây nên có mức độ khác nhau tùy thuộc từng cá thể. Trong khi hầu hết các trường hợp nhiễm HBV ở tuổi trưởng thành đều có khả năng tự khỏi - cơ thể tự loại bỏ virus, chỉ có khoảng 5% người trưởng thành nhiễm bệnh nhưng có khoảng hơn 90% trẻ sơ sinh khi nhiễm HBV sẽ tiến triển thành viêm gan mạn tính . Trong tế bào gan của những bệnh nhân nhiễm HBV có khả năng tích lũy protein vỏ trong mạng lưới nội chất rất lớn . Do đó, hậu quả của nhiễm HBV và mức độ nghiêm trọng của các bệnh lý gan được xác định bởi tính chất và sức mạnh của phản ứng miễn dịch bẩm sinh của cơ thể vật chủ . Hình 1.2: Đáp ứng miễn dịch của đại thực bào với các thành phần của HBV Trong tế bào gan bị nhiễm HBV, virus nhân lên sẽ giải phóng ra các thành phần của virus như DNA, RNA, capside, được chứa trong các túi tiết, và được phát hiện bởi hệ thống miễn dịch bẩm sinh (Hình 1.2). Hệ thống miễn dịch nhận biết bởi các thụ thể nhận dạng mẫu bẩm sinh (PRR) có mặt trong các tế bào miễn dịch, bao gồm các thụ thể Toll-like (TLR), thụ thể RIG-I-like (RLR), thụ thể NOD-like, các lectin loại C và các thụ thể khác. PRR trong các tế bào miễn dịch được kích hoạt bằng các thành phần của virus bao gồm axit nucleic của virus, oligome của protein vỏ và nucleocapsid gây ra phản ứng tế bào: 13 - HBcAg (vỏ capsid) tác động tới TLR2, dẫn tới tăng tiết các cytokine như IL6, IL10, IL12; TNF-α (Hình 1.3) . - Các hạt HBV được hấp thụ bởi đại thực bào sẽ được nhận diện bằng các TLR nội sinh trong đại thực bào dẫn tới việc sản xuất các chemokine, kích hoạt các tế bào trong hệ thống miễn dịch . - HBV-DNA hoặc HBV-RNA sẽ được các TLR của tế bào miễn dịch nhận biết, truyền tín hiệu miễn dịch, thay đổi phiên mã và kích hoạt các tế bào. Cụ thể đối với đại thực bào, HBV dsRNA được nhận biết bởi TLR3; HBV ssRNA được nhận biết bởi TLR8; HBV DNA được nhận biết bởi TLR9. Sau khi các thụ thể nhận biết các cấu trúc phân tử của virus HBV sẽ trình diện kháng nguyên, kích hoạt miễn dịch dẫn tới sự sản xuất các yếu tố miễn dịch như cytokine (IFN-1, IL-12 và IL-18), chemokine (CCL2, CCL3 và CXCL9), từ đó kích hoạt các tế bào miễn dịch khác trong hệ miễn dịch bẩm sinh như tế bào NK (Natural killer, giết tự nhiên), tế bào tua và tế bào T. Các cytokine loại I IFN (IFN-α và IFN-γ), IL-12 và IL-18 sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch loại 1 trong các tế bào T CD4+ và T CD8+. Các tế bào tua được kích hoạt để trình diện các kháng nguyên virus cho các tế bào T và các tế bào T được hoạt hóa sẽ phá vỡ những tế bào bị nhiễm (Hình 1.3) . Hình 1.3: Đáp ứng miễn dịch của Đại thực bào và hệ gen của HBV DNA/RNA của virus được nhận biết bởi các TLR nội sinh TLR3 (DSRNA), TLR8 (RNA chuỗi đơn [ssRNA]) và TLR9 (DNA), dẫn đến việc truyền tín hiệu, hoạt hóa phiên mã và kích hoạt đại thực bào cũng như trình bày kháng nguyên. 14 Kết quả dẫn tới các cytokine (IFN-1, IL-12 và IL-18) và chemokine (CCL2, CCL3 và CXCL9) được sản xuất thêm, hoạt hóa thêm các tế bào miễn dịch khác của hệ thống miễn dịch bẩm sinh và thích nghi (tế bào NK, DC và T) (Hình 1.3). Quá trình phản hồi tích cực được thông qua IFN do tế bào NK tạo ra để kích hoạt lại các đại thực bào. Các cytokine sản xuất đại thực bào loại I: IFN (IFN-α và IFN-β), IL-12 và IL-18 kích thích phản ứng miễn dịch loại 1 trong các tế bào T CD4 + và CD8+. Các DC được tuyển dụng trình bày các kháng nguyên virus, bao gồm các tế bào T gây độc tế bào CD8 + được kích hoạt, đến các tế bào T, phá hủy các tế bào bị nhiễm bệnh (Hình 1.3). Hình 1.4: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan Những cytokine và chemokine này kiểm soát trực tiếp tới sự nhân lên và lan rộng của virus qua việc truyền tin tế bào qua con đường JAK/STAT hoạt hóa các gen như IGSs ngăn cản sự hình thành của vỏ virus (Hình 1.4). Các thụ thể PRR trung gian gây đáp ứng miễn dịch bẩm sinh sớm trong tế bào gan nhiễm virus cũng được phối hợp kích hoạt và phát triển các phản ứng miễn dịch thích ứng như sản xuất các IFN, mà mục đích cuối cùng là để loại bỏ sự xâm nhiễm của virus cũng như tiếp tục bảo vệ cơ thể chống nhiễm trùng có khả năng xảy ra sau khi nhiễm (Hình 1.4). Khi nhiễm HBV mạn tính, các tế bào luôn kích hoạt trạng thái miễn dịch; các phân tử cytokine, IFN được tiết ra quá mức đáp ứng của tế bào dẫn tới sự 15 kích hoạt quá mức con đường tín hiệu JAK/STAT dẫn tới tăng cường biểu hiện các oncogene . 1.2. Ung thư biểu mô tế bào gan 1.2.1 Thực trạng Ung thư biểu mô tế bào gan là ung thư thường gặp ở Việt Nam và trên thế giới. Tỷ lệ mắc HCC từ khoảng 5,6 đến 7,2% đứng thứ năm trong tần suất bắt gặp và đứng thứ ba về tỷ lệ tử vong trên tổng số các loại ung thư . HCC chiếm 1% các ca tử vong trên toàn thế giới theo số liệu năm 2004 và là nguyên nhân đứng hàng thứ hai trong số các bệnh lý ung thư gây tử vong (chiếm 9,1% các ca tử vong do ung thư) . Tỷ lệ mắc HCC không đồng đều ở các nơi trên thế giới, các trường hợp mắc chủ yếu ở các nước châu Á và châu Phi (khoảng 80%). Nguyên nhân mắc HCC ở những nước này do HBV mạn tính chiếm 40-90%. Do tỷ lệ mắc bệnh ở các khu vực khác nhau nên cũng có sự khác biệt về tỷ lệ tử vong của bệnh ở các khu vực . Sự tương đồng về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc của HCC cho thấy đây là bệnh lý có tiên lượng sống kém. Thời gian sống trung bình của bệnh nhân HCC thường dưới 1 năm sau phát hiện. Tuy nhiên nếu không được điều trị đúng và hiệu quả, thời gian sống trung bình là dưới 5 tháng . Tỷ lệ sống sót cao hơn đối với những bệnh nhân có thể phẫu thuật để loại bỏ khối u dù đang ở bất kì giai đoạn nào. Đối với những người bị ung thư gan giai đoạn đầu đã ghép gan, tỷ lệ sống sót sau 5 năm nằm trong khoảng 60% đến 70% . Do vậy để có thể phát hiện sớm nhằm điều trị sớm cho những bệnh nhân HCC là một trong những yếu tố quan trọng giúp người bệnh và gia đình có thêm hy vọng và nâng cao chất lượng sống. Bảng 1.1: Giai đoạn của ung thư gan và tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm Giai đoạn SEER (Surveillance, Tỷ lệ sống tương đối sau 5 năm Epidemiology, and End Results) Khu trú (Localized) 31% Khu vực (Regional) 11% Di căn (Distant) 2% Tất cả các giai đoạn SEER kết hợp 18% 1.2.2. Các giai đoạn của ung thư biểu mô tế bào gan Hệ thống phân loại giai đoạn theo hệ thống phân chia giai đoạn khối u rắn TNM (Tumor, Note, Metastasis) đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American Joint Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế (Union for 16 International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được sửa đổi theo các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ thống phân loại AJCC phiên bản thứ 7 cho HCC . Bảng 1.2: Tiêu chuẩn phân giai đoạn HCC theo AJCC [35] Giai đoạn AJCC TNM T1a IA N0 M0 T1b IB N0 M0 Mô tả giai đoạn Xuất hiện khối u đơn khoảng 2cm (4/5 inch), hoặc khối u nhỏ chưa có sự phát triển của mạch máu. Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa. Xuất hiện khối u lớn hơn 2 cm (4/5 inch), tuy nhiên chưa có sự phát triển của mạch máu Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa Một khối u có kích thước lớn hơn 2cm (4/5 inch), phát triển T2 II đã có mạch máu hoặc có nhiều hơn một khối u tuy nhiên tổng kích thước < 5cm IIIA N0 M0 T3 N0 M0 Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa Có nhiều hơn một khối u, ít nhất một khối u lớn hơn 5cm Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa Xuất hiện ít nhất một khối u (kích thước bất kỳ) đã phát triển T4 IIIB IVA IVB một nhánh chính của một tĩnh mạch lớn trong gan (hệ tĩnh mạch cửa của gan hoặc tĩnh mạch gan) N0 M0 T N1 M0 T N M1 Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa Một khối u đơn lẻ hoặc nhiều khối u có kích thước bất kì. Lan xa đến các mạch bạch huyết lân cận Chưa lan đến các vị trí xa Một hoặc nhiều khối u có kích thước bất kì Có hoặc không có sự lan đến các hạch bạch huyết lân cận Đã lan xa đến các cơ quan khác như xương, phổi. Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ được duy trì bởi viện Ung thư Quốc gia (NIC) cho thấy tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm đối với bệnh gan ở Hoa kỳ (Bảng 1.1). Tuy nhiên cơ sở dữ liệu SEER không nhóm ung thư theo giai đoạn 17 TNM mà nhóm thành các giai đoạn khu trú (localized), khu vực (regional), và di căn (distant) . ­ Khu trú: Không có dấu hiệu cho thấy ung thư đã lan ra ngoài gan. Giai đoạn này bao gồm giai đoạn I, II và một số bệnh ung thư giai đoạn III theo AJCC. Điều này bao gồm một loạt các bệnh ung thư, một số trong đó dễ điều trị hơn ­ những bệnh khác. Khu vực: Tế bào ung thư đã lan ra ngoài gan, đến các cấu trúc hoặc hạch bạch huyết gần đó. Điều này bao gồm một số bệnh ung thư giai đoạn III cũng ­ như ung thư giai đoạn IVA trong hệ thống phân loại AJCC. Di căn: Ung thư đã lan đến các bộ phận xa của cơ thể, chẳng hạn như phổi hoặc xương. Điều này bao gồm ung thư giai đoạn IVB. Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán HCC bao gồm chẩn đoán hình ảnh, các dấu ấn sinh học và mô bệnh học, trong đó dấu ấn sinh học được sử dụng trong chẩn đoán sớm, đánh giá giai đoạn và tiên lượng bệnh. Các dấu ấn HCC được hướng tới như enzyme, isoenzyme, hormone, kháng nguyên ung thư, các epitope carbonhydrate, các sản phẩm của gen ung thư và đột biến gen. Trong đó alphafetoprotein (AFP) là dấu ấn sinh học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Đây là một glycoprotein bào thai xuất hiện với nồng độ tăng ở những bệnh nhân xơ gan và ung thư gan. Hơn 70% các trường hợp HCC có nồng độ AFP cao do sự sản xuất của khối u . AFP cũng tăng trong trường hợp ung thư đường mật trong gan hay trong một số trường hợp di căn từ ung thư đại tràng . Khuyến cáo của Hội Gan Mật Châu Á Thái Bình Dương (Asian Pacific Association for the Study of Liver -APASL) năm 2010 cũng đưa ra nhận định rằng không chỉ sử dụng AFP để chẩn đoán HCC, nếu sử dụng AFP cần phối hợp cùng hai dấu ấn sinh học khác với ngưỡng chẩn đoán của AFP là 200 ng/mL . 1.2.3. Ung thư gan do HBV Nhiễm HBV có thể dẫn tới một loạt các bệnh gan khác nhau, từ cấp tính (bao gồm cả suy gan cấp), viêm gan mạn tính, xơ gan và HCC. Nhiễm HBV gây nhiễm trùng cấp tính có thể không có triệu chứng. Hầu hết người lớn bị nhiễm virus sẽ phục hồi nhờ hoạt động của hệ miễn dịch tự nhiên, còn lại khoảng 5-10% những người bị nhiễm không có khả năng loại bỏ virus, trở thành những người bị nhiễm virus mạn tính. Trong số đó có những người bị nhiễm virus mạn tính có thể bị bệnh 18