Tài liệu Luận văn tách dòng và thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố apx ia từ actinobacillus pleuropneumoniae​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Thị Thu Ngà 2. PGS. TS. Dương Văn Cường Thái Nguyên, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS. Dương Văn Cường. Các số liệu trích dẫn rõ ràng, các kết quả trong luận văn là trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong luận văn này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2018 Tác giả luận văn Hoàng Thị Huyền Trang i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS. Dương Văn Cường đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Sinh học phân tử & Công nghệ tế bào - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, cảm ơn Công ty thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ trong quá trình làm đề tài. Tác giả luận văn Hoàng Thị Huyền Trang ii MỤC LỤC Trang TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii MỤC LỤC .........................................................................................................iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI .......................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ....................................................................................... 3 1.1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn ...................................................................... 3 1.1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ............................................. 5 1.2. Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh .................................................................... 7 1.2.1. Ngoại độc tố Apx ....................................................................................... 7 1.2.2. Các yếu độc lực khác ............................................................................... 10 1.2.3. Cơ chế gây bệnh ...................................................................................... 11 1.2.4. Gen mã hóa protein ApxIA ..................................................................... 12 1.3. Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra..... 12 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14 2.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu .................................................... 14 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 14 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 15 iii 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 15 2.2.1. Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen .................... 15 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ..................................................... 15 2.2.3. Phương pháp PCR ................................................................................... 16 2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng và biểu hiện ....................... 17 2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ....................................... 18 2.2.6. Phương pháp cắt kiểm tra ........................................................................ 19 2.2.7. Phương pháp xác định và phân tích trình tự DNA .................................. 20 2.3. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu ......................................................... 20 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................... 23 3.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự đoạn gen ApxIA của A.pleuropneumoniae .................................................................................. 23 3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen ApxIA........................................................ 23 3.1.2. Kết quả biến nạp đoạn gen ApxIA vào vector tách dòng pGEM ............ 24 3.1.3. Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA.......................................................... 25 3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA ............ 28 3.2.1. Kết quả sàng lọc các dòng plasmid mang vector biểu hiện chứa đoạn gen ApxIA ............................................................................................... 28 3.2.2. Kết quả chọn lọc vector pET– ApxIA bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn....................................................................................... 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 31 1. Kết luận .......................................................................................................... 31 2. Đề nghị........................................................................................................... 31 01 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .......... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 33 iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI App Actinobacillus pleuropneumoniae bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate Kb Kilo base LPS Lipopolysaccharide NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu....................... 3 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ...................... 17 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector biểu hiện....................... 17 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng BamHI và HindIII ........... 19 Bảng 2.4. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .................. 20 Bảng 2.5. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 21 Bảng 3.1. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen ApxIA của A.pleuropneumoniae serotype 5a và ApxIA (GQ369732.1) ........... 28 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae ............. 5 Hình 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae .................................... 6 Hình 2.1. Sơ đồ vector pGEM®-T Easy của Promega.................................... 14 Hình 2.2. Sơ đồ vector biểu hiện pET-28a (+) ................................................ 14 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện pET - ApxIA ............... 22 Hình 3.1. Kết quả nhân gen ApxIA từ App serotype 5a .................................. 23 Hình 3.2. Khuẩn lạc mang plasmid trên môi trường chọn lọc ........................ 24 Hình 3.4. Kết quả cắt vector pGEM- ApxIA bằng enzyme BamHI và HindIII ... 25 Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide ApxIA của A.pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên Genbank ........................................................... 26 Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen ApxIA của A. pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên Genbank ........................................................... 27 Hình 3.7. Kết quả tách plasmid các dòng có khả năng mang pET-ApxIA .... 29 Hình 3.8. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Apx ....................................................... 29 Hình 3.9. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA khi cắt bằng enzyme BamHI và HindIII...................................................... 30 vi MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lợn là vật nuôi chiếm tỷ trọng cao trong ngành chăn nuôi ở Việt Nam. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi thì dịch bệnh cũng phát sinh, lây lan và gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh viêm màng phổi ở lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới, nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển. Bệnh có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của đàn lợn với tỷ lệ chết có thể lên đến 20% khi có dịch cấp tính xảy ra. Tuy nhiên, các thiệt hại gián tiếp khi bệnh ở thể mãn tính gây ra như tăng trọng trên ngày giảm 50 gram và các chí phí thuốc cho điều trị cao hơn nhiều so với tỷ lệ chết. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ lâu đã được nghiên cứu nhiều và xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm màng phổi ở lợn. Nhiều công bố đã cho thấy, mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn. Độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố, trong đó độc tố ApxI có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính. Hiện nay để phòng bệnh viêm màng phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra chủ yếu sử dụng vaccine nhược độc. Đây đều là các loại vaccine có giá thành khá cao, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm cũng rất thất thường và không ổn định. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất vaccine đang được quan tâm, tạo ra vaccine thế hệ mới khắc phục được nhược điểm của các loại vaccine truyền thống như vaccine nhược độc. 1 Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA từ Actinobacillus pleuropneumoniae” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh sau này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tách dòng được đoạn gen ApxIA mã độc tố ApxIA của vi khuẩn A.pleuropneumoniae. Thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp Apx IA trên vi khuẩn Escherichia coli. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập và tách dòng đoạn gen ApxIA mã hóa độc tố ApxIA của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện pET-Apx IA mang đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 1.1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn Bệnh viêm phổi hay còn gọi là bệnh viêm phổi màng phổi dính sườn trên lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, bệnh có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất đàn lợn. Theo Jäger H. C. và đtg (2012) tổng hợp dữ liệu từ 14 lò mổ tại Anh cho thấy trong 15.237 lô hàng giết mổ từ tháng 7 năm 2005 đến tháng 10 năm 2008, 80% bị ảnh hưởng bởi viêm màng phổi. Các nghiên cứu ở các nước khác đã phát hiện thấy tỷ lệ viêm màng phổi tương tự và thậm chí tăng lên ( Bảng 1.1 ) [9]. Bảng 1.1. Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu. Năm Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi 2000 16% 2009 20,8 % 1987 14 1998 24% 2000 25% 1990 12% 2004 22,5% Na Uy 1991 41% Tây Ban Nha 2009 26,8% Anh 1988 16% Quốc gia Bỉ Đan mạch Hà Lan Nguyên nhân Nhiều nghiên cứu đã xác định vi khuẩn A. pleuropneumoniae là nguyên nhân chính gây ra các đợt bùng phát dịch hô hấp cấp tính ở lợn [8], [11], [20]... 3 Vi khuẩn này xâm nhập vào lợn qua hệ thống hô hấp gồm miệng, phế quản, phế nang, thùy đỉnh và các thùy khác của phổi. Thời gian ủ bệnh thường ngắn, khoảng 12 giờ đến 3 ngày [9]. Triệu chứng Bệnh viêm màng phổi ở lợn có các triệu chứng lâm sàng khác nhau tùy thuộc vào nhiều yếu tốp như tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh. Tiến triển lâm sàng có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính. Bệnh viêm màng phổi thể quá cấp tính có đặc điểm lợn mắc bệnh sốt 41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy. Thời gian ngắn trước khi chết, thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tư thế ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh. Ngay trước khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn bộ cơ thể trở nên tím tái, lợn mắc bệnh thường chết sau 24 - 36 giờ [1], [21]. Bệnh viêm màng phổi thể cấp tính có đặc điểm lợn bệnh sốt từ 40,5oC 41oC, da đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn. Các dấu hiệu hô hấp nặng như khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ. Bệnh diễn biến khác nhau tùy thuộc vào từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ tổn thương ở phổi và thời điểm bắt đầu điều trị. Lợn thường sống sót nếu qua được 4 ngày đầu của bệnh [1], [21]. Bệnh viêm màng phổi thể bán cấp tính có đặc điểm xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất đi; lợn bệnh không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát, với các cường độ khác nhau, con vật kém ăn, giảm tăng trọng [1], [6]. Bệnh viêm màng phổi thể mãn tính có đặc điểm lợn mắc bệnh không có biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng. Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân tố truyền bệnh cho những lợn khác Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ 4 hơn nếu có nhiễm trùng kế phát các vi sinh vật đường hô hấp khác như Mycoplasma, Pasteurella, hay các nhân tố stress. Bệnh tích Lợn bị nhiễm A. pleuropneumoniae có những tổn thương chủ yếu ở đường hô hấp. Phần lớn các trường hợp lợn bị viêm hai bên phổi với tổn thương ở các thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm hoành. Viêm màng phổi tơ huyết và fibrin thường rất rõ ở những lợn chết trong giai đoạn cấp tính của bệnh. Những trường hợp lợn bị tử vong nhanh chóng như thể cấp tính thường quan sát thấy khí quản và các phế quản bị lấp đầy bởi các chất tiết nhày, bọt nhuốm máu, phổi trở nên sẫm màu, có rất nhiều máu ở lồng ngực và nhiều tơ huyết gắn giữa phổi, thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim (hình 1.1) [1] [21]. Hình 1.1. Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae [21] 1.1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Phân loại, hình thái Vi khuẩn A. pleuropneumoniae hay Haemophilus parahaemolyticus hoặc Haemophilus pleuropneumoniae Gammaproteobacteria, bộ thuộc Pasteurellales, ngành Proteobacteria, lớp họ Pasteurellaceae, chi Actinobacillus đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi 5 - màng phổi truyền nhiễm ở lợn [4]. A. pleuropneumoniae thuộc loại trực cầu khuẩn, kích thước nhỏ, thuộc nhóm gram âm, kích thước khoảng 0,3 - 0,5 x 0,6 - 1,4 pm. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô, trừ một số chủng không có giáp mô. Vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5 - 2 x 60 - 450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn App, loại không có vỏ ít tìm thấy hơn [4]. Hình 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae [12] Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có khả năng lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. A. pleuropneumoniae dương tính với các phản ứng urease, oxidase, âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey [5]. Phân loại A. pleuropneumoniae Căn cứ vào nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, A. pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype chính. Biotype 1 cần có NAD, 6 còn biotype 2 thì không cần NAD trong quá trình nuôi cấy, nhưng vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD [4]. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2 [10]. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào [7]. Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 [16]. Năm 2002, Blackall P.J. và đồng tác giả đã đề xuất một serotype mới của App - serotye 15 với HS143 là chủng tham chiếu cho serotype mới [5]. Các serotype phân bố khác nhau giữa các quốc gia. Ví dụ, các serotype 1 và 5 chiếm ưu thế ở Bắc Mỹ, serotype 2 chủ yếu được tìm thấy ở châu Âu, serotype 15 chủ yếu ở Úc và serotype 2, 1 và 5 ở Nhật Bản. Ở Việt Nam, serotype 2 và 5 rất phổ biến. Serotype 1, 2, 5, 9 và 11 thường được tìm thấy có độc lực hơn các serotype khác [11]. 1.2. Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh 1.2.1. Ngoại độc tố Apx Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn [15], [19], [21]. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX - toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII. Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae [14]. Độc tố ApxI 7 ApxI là một protein có trọng lượng phân tử từ 105 - 110 kDa, có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính. ApxI đầu tiên phát hiện và được đặt tên là haemolysin I (HlyI) hay cytolysin I (ClyI) [5]. ApxI được tiết ra bởi các A. pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10; 11 thuộc biotype 1 và serotype 14 của biotype 2. Operon mã hóa cho protein ApxI được xác định là gen apxI và gồm 4 cistron được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB, và apxID, trong đó C là chức năng tạo ra protein hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố và B cùng D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự tiết độc tố qua cả hai màng. Ion Canxi (Ca2+) cần thiết cho các hoạt động sinh học của độc tố dung huyết A. pleuropneumoniae [8]. Phân tích protein của độc tố ApxI cho thấy 56% tương đồng với HlyA- độc tố làm dung huyết của vi khuẩn E. coli [6]. Các chủng sản sinh ra ApxI thường có độc lực cao, điều này cho thấy độc tố có liên quan đến độc lực của A. pleuropneumoniae. Độc tố ApxII ApxII là loại độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình, trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa [7]. Đầu tiên ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII. Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết loại độc tố ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 [6]. Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các cistron apxIICA và thiếu các cistron bài tiết tương ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào cistron apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae , ngoại trừ serotype 3 [19]. Độc tố ApxIII ApxIII là loại độc tố không làm tan huyết, nhưng có khả năng gây dung giải tế bào mạnhk, trọng lượng phân tử 120 kDa [15]. Đầu tiên, ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay 8 độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) [15]. ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng có khả năng gây dung giải mạnh các tế bào khác. Cấu trúc của ApxIII giống 50% với cấu trúc của ApxI và HlyI của vi khuẩn E. coli. Vùng operon mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng operon mã hóa cho ApxI. Protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi các serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A. pleuropneumoniae [12], [19]. Độc tố Apx IV ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã được phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA [6]. Gen ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều này chứng tỏ nó có tính chất đặc trưng cho loài. Chưa có nghiên cứu cụ thể về vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae [6]. Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, phần lớn chỉ có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra 2 loại độc tố là ApxI và ApxII; các serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số serotype chỉ tiết ra một loại độc tố Apx như serotype 10 chỉ tiết ApxI; serotype 7 và serotype 12 chỉ tiết ApxII [11]. Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi mạnh hay yếu tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố. Theo Inzana và đồng tác giả (1991), A. pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5 [11]. 9 Đồng thời chủng A. pleuropneumoniae này được dùng làm giống gốc sản xuất vaccine và cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 [1], [2], [3], [19]. 1.2.2. Các yếu độc lực khác Protein màng ngoài Protein màng ngoài khác nhau giữa các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae nhưng có một số loại protein màng ngoài có mặt ở hầu hết các chủng. Protein màng ngoài đóng vai trò như một thụ thể thu nhận sắt (iron) và sắt là một yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng của A. pleuropneumoniae [4]. Kháng nguyên O Kháng nguyên O hay Lipopolysaccharides (LPS) là thành phần chính của màng ngoài tế bào vi khuẩn A. pleuropneumoniae, liên quan nhiều đến quá trình gây độc và có khả năng gây tổn thương đối với mô. LPS có vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của vi khuẩn A. pleuropneumoniae lên tế bào biểu mô và lớp nhầy khí quản của lợn. Bám dính là hoạt động ban đầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn, rồi từ đó gây bệnh [4]. Kháng nguyên K ` Kháng nguyên K hay Polysaccharides vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy. Lớp vỏ này của A. pleuropneumoniae có độ dày từ 80 – 230 nm tùy thuộc vào các chủng khác nhau. Các chủng A. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dày, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ. LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô và lớp màng nhày khí quản của lợn [4]. 10 Các protein thu nhận sắt Khả năng cạnh tranh hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của A. pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ. Chính protein gắn thụ thể vận chuyển đã giúp cho A. pleuropneumoniae được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng [4]. 1.2.3. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn A. pleuropneumoniae sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn sẽ gắn vào các tế bào biểu mô trên bề mặt, sau đó tiến sâu vào bên trong các hốc của hạch amidan, vi khuẩn A. pleuropneumoniae di chuyển xuống đường hô hấp dưới và tồn tại trong các phế nang, ở đây nó gây ra phần lớn các tổn thương. Khi vi khuẩn tăng số lượng sẽ giải phóng các độc tố Apx từ lớp màng ngoài của vi khuẩn có chứa lipopolysaccharides (LPS) (kháng nguyên O). LPS và độc tố Apx vừa giúp các vi khuẩn gây hại cho các tế bào vật chủ vừa ngăn chặn vi khuẩn bị phá hủy bởi thực bào. LPS thu hút bạch cầu trung tính đến khởi đầu quá trình viêm và sau đó bạch cầu trung tính bị phá hủy bởi các độc tố cytotoxins sản sinh ra lysozymes gây tổn hại mô lân cận. Các tổn thương mô có thể tiến triển nhanh chóng, lợn bị nhiễm A. pleuropneumoniae sẽ chết trong vòng 4-12 giờ tiếp xúc [4]. A. pleuropneumoniae không lây nhiễm sang người và không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ cộng đồng. Đường lây lan chính là lây trực tiếp từ lợn bệnh sang lợn khỏe. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có sức đề kháng kém, chỉ tồn tại trong môi trường tự nhiên trong thời gian ngắn. V i k h u ẩ n A. pleuropneumoniae k h i s ố n g t rong niêm dịch và môi trường có nhiều chất hữu cơ thì có thể sống sót trong vài ngày; trong nước sạch ở nhiệt độ 4oC, vi khuẩn có thể sống được 30 ngày. Ngoài ra, trong khí dung vi khuẩn có thể sống sót trong nhiều ngày. 11