Tài liệu Luận văn bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin​

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Trần Chi Phúc LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quá trình quá trình học tập và thực hiện Đồ án. Em xin cám ơn thầy, cô thuộc khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢỜNG, Trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em đầy rất kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Đặc biêt, em chân thành cám ơn cô Ts. Nguyễn Hoài Hƣơng đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đồ án. Em cũng xin cám ơn quý thầy, cô phụ trách Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢƠNG, Trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình. Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự và tất cả các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình. TP. Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014. Trần Chí Phúc Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ iii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................... v MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3 1.1. Độc tố nấm mốc ............................................................................................ 3 1.2. Độc tố aflatoxin............................................................................................ 3 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ................................................................................. 3 1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại .................................................................. 4 1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc ...................................................... 5 1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin ................................................................. 7 1.2.5. Độc tính của aflatoxin ............................................................................ 8 1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin ............................................. 10 1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin ............................................................ 11 1.2.8. Phương pháp phát hiện aflatoxin ........................................................ 12 1.3. Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin ........................................................... 15 1.3.1. Phương pháp vật lý học........................................................................ 15 1.3.2. Phương pháp hóa học .......................................................................... 17 1.3.3. Phương pháp sinh học ......................................................................... 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20 2.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu .............................................................. 20 2.2. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất..................................................................... 20 2.2.1. Vật liệu .................................................................................................. 20 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................... 20 2.2.3. Môi trường – Hóa chất ......................................................................... 20 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Phương pháp luận ................................................................................ 22 2.3.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 23 2.3.3. Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn ............................... 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40 3.1. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất ................................................................................................................ 40 3.1.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp ........................ 40 3.1.2. Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp .................................................. 42 3.2. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai. ................................................................................................................. 43 3.2.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm mốc trên môi trường PDA ............................................................................... 47 3.2.2. Khảo sát khả năng ức chế khả năng sinh aflatoxin của các chủng khuẩn phân lập với nấm trên môi trường CCA ............................................. 48 3.3. Khảo sát sinh hóa của chủng khuẩn phân lập đƣợc ............................... 50 3.3.1. Nhuộm bào tử ....................................................................................... 50 3.3.2. Thử nghiệm Simmon citrate ................................................................ 51 3.3.3. Thử nghiệm catalase ............................................................................ 52 3.3.4. Thử nghiệm protease ............................................................................ 52 3.3.5. Thử nghiệm chitinase ........................................................................... 53 3.3.6. Thử nghiệm lên men carbohydrate ..................................................... 53 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ .................................................................... 57 4.1. Kết luận ....................................................................................................... 57 4.2. Đề nghị ........................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TĂT A.O.A.C: Association of Analytical Communities CCA: coconut cream agar Ctv: cộng tác viên ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA: Food and Drug Administration HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth ppb: parts per billion TFA: Tryfloacetic acid TLC: Thin layer chromatographi UV: Ultraviolet iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 1.1. Tính chất hóa lý một số aflatoxin .............................................................5 Bảng 1.2. Một số loài nấm có khả năng sinh aflatoxin .............................................6 Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi ...................................................................................................................9 Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở 1 số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA .............................10 Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam ..................................................................11 Bảng 1.6. Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học .........16 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập ............40 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b. ........................................51 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. .................................. 7 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin ............................................................................................................. 23 Hình 2.2. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ nhất ........................................................................ 24 Hình 2.3. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai .......................................................................... 29 Hình 3.1. Kết quả đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng hỗn hợp. ..................................................................................................................... 41 Hình 3.2. Kết quả đối kháng nấm của các dịch tăng sinh trên môi trƣờng PDA ...... 44 Hình 3.3. Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê. .......................................... 45 Hình 3.4. Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê........................................... 46 Hình 3.5. Kết quả đối kháng nấm của các dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc trên môi trƣờng PDA. ....................................................................................................... 48 Hình 3.6. Kết quả ức chế sự phát triển và khả năng tổng hợp aflatoxin của nấm mốc bởi dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn trên môi trƣờng CCA. ................................... 49 Hình 3.7. Kết quả nhuộm bào tử khuẩn CS1b .......................................................... 51 Hình 3.8. Thử nghiệm Simmon citrate. CS1b cho kết quả dƣơng tính..................... 51 Hình 3.9. Thử nghiệm catalase. CS1b cho kết quả dƣơng tính. ............................... 52 Hình 3.10. Thử nghiệm protease. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. ................. 52 Hình 3.11. Kết quả thí nghiệm chintinase. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. ........ 53 Hình 3.12. Kết quả lên men Glucose. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính............ 54 Hình 3.13. Kết quả lên men Lactose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính .................. 54 Hình 3.14. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. ................ 55 Hình 3.15. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính ................. 55 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề 1. - Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là nhóm độc chất tự nhiên do nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển. Ngƣời ta đã phát hiện ra hàng ngàn loại mycotoxin (đƣợc sinh ra chủ yếu bởi 3 nhóm nấm mốc chính là Aspergillus, Penicillium và Fusarium), trong đó phải kể đến là aflatoxin. Aflatoxin vừa gây độc cấp tính (ở liều lƣợng lớn có thể gây chết một số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lƣợng thấp tích tụ ở gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận…). Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng aflatonxin là nguyên nhân gây ung thƣ cho động vật thí nghiệm, do đó có thể rất nguy hiểm đối với con ngƣời. Nhóm độc tố aflatoxin sinh ra chủ yếu bởi hai loài nấm mốc là Aspergillus flavus và Aspergillus parisiticus. Các loài nấm mốc này có mặt rất nhiều ở một số loại lƣơng thực nhƣ ngô, lạc… và một vài loại hạt có chứa dầu. Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tƣơng đối cao nhƣ nƣớc ta, việc bảo quản nguồn lƣơng thực sau thu hoạch cũng nhƣ các nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là hết sức cần thiết. Nếu không có điều kiện bảo quản thích hợp sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin. Ngoài việc làm giảm chất lƣợng dinh dƣỡng cho lƣơng thực là nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, mà còn gây tích tụ độc tố trong chính các nguồn này. Điều này sẽ gây ra những tổn thất rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và cho ngƣời nông dân nói riêng. Bên cạnh đó, việc sử dụng các nguồn lƣơng thực và thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin sẽ ảnh hƣởng không nhỏ đến sức khỏe ngƣời tiêu dung. - Nhận ra đƣợc tình hình thực tế đó, các nhà khoa trong nƣớc và thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm giải quyết vấn đề này. Các tác nhân nhƣ vật lí, hóa học đã đƣợc đƣa ra thí nghiệm nhằm làm mất hiệu lực của aflatoxin. Đặc biệt, xu hƣớng đang đƣợc chú trọng hiện nay là dựa vào các tác nhân vi sinh vật. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus…) đã đƣợc thử nghiệm khả năng làm giảm aflatoxin và đã thu đƣợc những kết quả khá khả quan. 1 Đồ án tốt nghiệp - Vì những lí do thực tiễn nhƣ trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp này. Mục đích 2. - Phân lập và tuyển chọn đƣợc các vi khuẩn có khả năng kháng nấm. Mục tiêu đề tài 3. - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có khả năng kháng nấm sinh aflatoxin. Nôi dung đồ án 4. - Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin. - Sàng lọc và tuyển chọn vi khuẩn dựa trên hoạt tính đối kháng và hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc. - Định danh sơ bộ vi khuẩn và xác định cơ chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin bằng các thử nghiệm sinh hóa. Kết cấu đồ án 5. - Chƣơng I: Tổng quan tài liệu – nội dung chƣơng đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. - Chƣơng II: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu – nội dung chƣơng đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phƣơng pháp nghiên cứu trong đồ án. - Chƣơng III: Kết quả và thảo luận – nội dung chƣơng đƣa ra những kết quả mà đề tài thực hiện đƣợc và đƣa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu đƣợc. - Chƣơng IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chƣơng tóm lại những kết quả mà đề tài đạt đƣợc và đề nghị cho những hƣớng cần cải thiện thêm trong đề tài. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. - Độc tố nấm mốc: Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxin là những hợp chất có phân tử nhỏ, khá bền trong các điều kiện, là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp trong quá trình phát triển của loài vi nấm. Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập và giữ đƣợc độc tính trong các chuỗi thức ăn do cực kỳ khó khăn để loại bỏ hoặc tiêu diệt. - Độc tố nấm mốc đƣợc phát hiện lần đầu liên vào năm 1960, sau cái chết hàng loạt của hàng trăm cá thể tại các trang trại gà tây ở Anh. (T. Asao và ctv,1963; F.Wu và P. Khlangwiset, 2010) - Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm mốc đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Nhƣng chỉ có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại. - Bệnh nấm mốc ở ngƣời và động vật đều không có khả năng lây lan vì chúng do tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu nhƣ tất các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con ngƣời. Khi gia súc ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và nhƣ vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con ngƣời. 1.2. Độc tố aflatoxin: 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu: - Aflatoxin là mycotoxin đƣợc phát hiện sớm nhất vào năm 1961 bởi nhà khoa học Butler. Qua việc xác định đƣợc loài Aspergillus flavus tiết ra độc tố gây chết hàng loạt gà tây ở Anh, ông đặt tên cho độc tố này là aflatoxin (độc tố sinh ra bởi Aspergillus flavus). (W.H Butler, 1964) - Các công trình nghiên cứu sau đó đã xác nhận rằng Aflatoxin đƣợc tạo bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây khối u ở gan động vât. (Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn bởi Chaver-Sanchelez, 1994). 3 Đồ án tốt nghiệp - Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định đƣợc công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin. 1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại: - Aflatoxin là một nhóm khoảng 20 chất là sản phẩm trao đổi bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Bốn nhóm aflatoxin chính đƣợc tạo ra trong tự nhiên là B1, B2, G1 và G2. Bốn chất đƣợc phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nƣớc biển), và G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò đƣợc chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk). (F. Wu và P. Khlangwiset, 2010) - Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 đƣợc tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn chúng có công thức cấu tạo nhƣ sau: O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin B1 O O O O O OH OH OCH3 O O O Aflatoxin M2 O O O OCH3 O Aflatoxin M1 O OCH3 Aflatoxin B2 O O O O O O O O OCH3 O Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 4 O OCH3 Đồ án tốt nghiệp - Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong dung môi không phân cực. Aflatoxin tƣơng đối không ổn định khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dung môi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10. Aflatoxin có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhƣng không bị phá hủy trong điều kiện nấu ăn bình thƣờng. Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấp tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý bằng chất tẩy rữa. Bảng 1.1 Tính chất hóa lý của một số aflatoxin. Công Trọng thức phân lƣợng tử phân tử B1 C17H12O6 312 268-269 Xanh lam B2 C17H14O6 314 268-289 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Aflatoxin Điểm nóng chảy (0C) Huỳnh quang Nguồn: Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003 1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc: - Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu đƣợc tìm thấy ở hai chủng nấm mốc Asp.flavus và Asp. parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của Asp. flavus là rất phổ biến và thƣờng đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa... Theo số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân lập của Asp. flavus có khả năng tạo aflatoxin. - Ngoài hai loài Asp. flavus và Asp. parasiticus còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhƣng yếu hơn nhƣ Asp. nominus (C.P. Kurtzman và ctv, 1987) và Asp. bombycis (S.W. Peterson và ctv,2001). 5 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin. Loài nấm mốc Aflatoxin G1 Tác giả B1 B2 G2 Aspergillus flavus + + Aspergillus parasiticus + + + + Coduer và ctv, 1963 Aspergillus nomius + + + + Kurzman vad ctv, 1987 Aspergillus oryzae + Basappa và ctv, 1967 Aspergillus niger + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus wentii + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus ruber + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus ostianus + Aspergillus orchraceus + Penicillium puberulum + Penicillium variabile + Kulik và Holaday, 1967 Penicillium frequentans + Kulik và Holaday, 1967 Penicillium citrinum + Kulik và Holaday, 1967 Rhizopus sp. + Van Walbeck và ctv, 1968 Sargeant và ctv, 1961 + Scot và ctv, 1968 Van Walbeck và ctv, 1968 + + + Kulik và Holaday, 1967 Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007. - Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin nhƣ chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nƣớc, các yếu tố môi trƣờng… - Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120C, 270C và 40 – 420C theo thứ tự. Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trƣờng không thích hợp, nhƣng khả năng sinh độc tố cũng có thể tăng khi chủng nấm mốc đƣợc cấy chuyển trên môi trƣờng thích hợp. - Môi trƣờng có bổ sung nấm men hoặc peptone hoặc là các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 280C) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin. 6 Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin. - Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Ngƣời ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thƣ và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trƣởng bình thƣờng của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A. Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001). - Để có thể gây độc với tế bào gan cũng nhƣ tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan. Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm dialdehyde phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính. (Hình 1.1) Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. (Cliford và Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003) 7 Đồ án tốt nghiệp 1.2.5. Độc tính của aflatoxin: Theo Dƣơng Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con ngƣời và động vật. Những tác hại đó nhƣ sau: - Gây tổn thƣơng tế bào gan: tất cả các trƣờng hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hƣ hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có biểu hiện khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tƣơi, mật sƣng. Sau đó gan sƣng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể. - Thận cũng bị sƣng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng. - Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thƣơng ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn. - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thƣờng, có thể gây tử vong cho thú. - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thƣờng, gây rối loạn sinh sản. - Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn. - Làm thay đổi thành phần dinh dƣỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dƣỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển. - Làm giảm thấp sự sinh trƣởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi. 8 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003) Loại gia súc Lợn (20-70kg) Lợn (40-100kg) Lợn (70-100kg) Lợn nái (có chửa) Gà tây (1 ngày tuổi) Gà thịt (1 ngày tuổi) Vịt (7 ngày tuổi) Bê (4 ngày tuổi) Lƣợng Thời aflatoxin kỳ trong thức ăn nuôi hằng ngày dƣỡng (mg/kg) (tuần) 0.14 12 Trung bình Bình thƣờng 0.28 12 Nhẹ Giảm sút 0.41 12 Nhẹ Giảm sút 0.28 và 0.41 20 Nhẹ Giảm sút 0.69 7 Trung bình Bình thƣờng 0.3-0.55 4 Rõ 0.25 4 Rõ 0.2 7 Nhẹ 0.42 7 Nhẹ 0.5 7 Nặng 0.03 4 0.2 16 Ảnh hƣởng tới Tổn thƣơng gan phát triển và hiệu quả thức ăn Suy giảm và một số con chết Chậm phát triển và giảm trọng lƣợng. Giảm trọng lƣợng trong 3 tuần. Đặc điểm điển hình Giảm trọng lƣợng, nhiễm aflatoxin. chết 50%. Trung bình Giảm trọng lƣợng từ 0-3 tháng. Giảm lƣợng sữa. Bò sữa 1.5 4 Trung bình Aflatoxin M1 có mặt trong sữa 9 Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin. Trƣớc thực trạng nhiễm aflatoxin trên lƣơng thực, thực phẩm ở mức độ cao - cũng nhƣ tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hƣởng của nó đối với sức khỏe con ngƣời, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lƣơng thực, thực phẩm. Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở một số nƣớc theo tiêu chuẩn của FDA Giới han Aflatoxin cho phép Nƣớc 20 ppb Loại thức ăn Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau. Hàm lƣợng tối đa cho phép trong thức ăn Mỹ 20 ppb cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô. Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho ngƣời. Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số Canada 15ppb tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 Úc 15 ppb 10 ppb Nhật Châu Á - 100 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tƣơng và lạc. Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1. Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi. 30 ppb Tất cả các loại lƣơng thực, thực phẩm. 120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc. Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định về hàm lƣợng tối đa aflatoxin B1 và hàm lƣợng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) đƣợc tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm (ppb). 10 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. (Tài liệu của Vụ KHKT và CLSP Bộ Nông nghiệp và PTNT) Lƣợng Aflatoxin Nguyên liệu B1 tối đa (ppb) Tổng số Aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 (ppb) Ngô hạt 100 150 Sắn khô 50 100 Đậu tƣơng 50 100 Cám gạo 50 100 Bột cá 10 20 Thức ăn cho gà (1 – 21 ngày tuổi) 10 30 Thức ăn cho gà (nhóm còn lại) 30 50 Thức ăn cho vịt (1 – 21 ngày tuổi) 5 10 Thức ăn cho vịt (nhóm còn lại) 10 20 Thức ăn cho lơn con (1 – 60 ngày tuổi) 20 50 Thức ăn cho lợn (nhóm còn lại) 100 200 Bò nuôi lấy sữa 20 50 1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin. - Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có dầu nhƣ lạc, đậu tƣơng và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp là rất đáng kể. - Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản. 11 Đồ án tốt nghiệp - Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong số 94 trƣờng hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trƣờng hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trƣờng hợp ở bò và 4 trƣờng hợp ở gia cầm. Hàm lƣợng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) - Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm đƣợc phân tích thì có 13 mẫu chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên đến 50 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003). 1.2.8. Phƣơng pháp phát hiện aflatoxin: 1.2.8.1. - Phương pháp phát quang sinh học : Dùng tia cực tím tạo ra huỳnh quang màu vàng xanh sáng từ acid kojic (acid này đƣợc tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin, chỉ gián tiếp phát hiện sự có mặt của aflatoxin). Phƣơng pháp này không thông du ̣ng vì it́ chin ́ h xác . 1.2.8.2. - Phương pháp "ELISA test": Dƣ̣a trên nguyên tắ c kháng thể kháng nguyên p hát hiện aflatoxin (và các độc tố khác) thông qua những phƣơng tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã đƣợc tách chiết từ hạt hay các thành phần của thƣ́c ăn . Sau khi chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ thị màu. Cƣờng độ màu sắc sẽ chỉ thị có độc tố hay không. 1.2.8.3.  - Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatographi-TLC ) Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định hàm lƣợng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Ngƣời ta sử dụng các bản mỏng đƣợc tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin. 12 Đồ án tốt nghiệp - Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform: aceton. Việc thêm nƣớc vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. - Hệ dung môi gồm nƣớc: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) đƣợc đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã đƣợc chảy qua các dung môi chạy đƣợc đƣa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf đƣợc so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phƣơng pháp này có thể đƣợc xác định lƣợng từ 0.3-0.4 mg. - Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là phụ thuộc vào ngƣời phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%. - Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lƣu ý tới phƣơng pháp phân tích định lƣợng sử dụng TLC. Phƣơng pháp này đƣợc mở rộng thành chƣơng trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới. Các kết quả của chƣơng trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin: - Một số chất đƣợc tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phƣơng pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân. - Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích đƣợc phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và đƣợc hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận. - Aflatoxin B1 đƣợc đƣợc acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a. Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxin B1. Theo phƣơng pháp của Przybylski, aflatoxin Bi đƣợc chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryfloacetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trƣớc khi chạy trong dung môi. 13