Tài liệu Luận văn ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân giống cây hoa african violet (saintpaulia ionantha h. wendl.)​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- DƢƠNG BẢO TRINH ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA AFRICAN VIOLET (SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- DƢƠNG BẢO TRINH ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA AFRICAN VIOLET (SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt NCS. Nguyễn Phúc Huy TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017 TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG QLKH – ĐTSĐH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP.HCM, ngày..… tháng…..năm 2017 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: DƢƠNG BẢO TRINH Giới tính: NỮ Ngày, tháng, năm sinh: 07/03/1993 Nơi sinh: Bà Rị – V ng Tàu Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học MSHV: 1541880014 I- TÊN ĐỀ TÀI: Ảnh hƣởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.) II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Thứ nhất: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy.  Thứ hai: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.  Thứ ba: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm. III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: i V- CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt NCS. Nguyễn Phúc Huy Cán bộ hƣớng dẫn Khoa quản lý chuyên ngành (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) CBHDI CBHDII PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt NCS. Nguyễn Phúc Huy ii CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN Cán bộ hƣớng dẫn kho học : CBHDI PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt CBHDII NCS. Nguyễn Phúc Huy Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM ngày … tháng … năm … Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT 1 2 3 4 5 Họ và tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thƣ ký Xác nhận củ Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận s u khi Luận văn đã đƣợc sử chữ (nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin c m đo n nghiên cứu “Khảo sát ảnh hƣởng củ n no bạc lên quá trình khử trùng trong vi nhân giống cây ho african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.)” là công trình nghiên cứu củ tôi dƣới sự hƣớng dẫn củ PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt và NCS. Nguyễn Phúc Huy. Nghiên cứu này c ng là một phần trong nhánh số 3 củ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Kho học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tác động củ hạt n no kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trƣởng phát triển và tích l y hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế c o ở Việt N m” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá n toàn sinh học củ các chế phẩm n no”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/1518. Những kết quả nghiên cứu củ ngƣời khác và các số liệu đƣợc trích dẫn trong luận văn có chú thích đầy đủ. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên. Các số liệu, kết quả, đánh giá đƣ r trong luận văn chƣ đƣợc i công bố trong bất kỳ luận văn nào trƣớc đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trƣờng về c m đo n này. Tác giả luận văn Ký tên Dƣơng Bảo Trinh iv LỜI CẢM ƠN Chắc hẳn trong mỗi con ngƣời i c ng có những khoảnh khắc khó quên của cả cuộc đời, có thể là vui hay buồn,... Nhƣng với tôi có hai dấu ấn mà tôi mãi khắc ghi đến suốt cả cuộc đời. Đó là lúc tôi chập chững với những bƣớc đi cùng mẹ trong những ngày đầu tiên đi học, khi còn thơ bé. Và giờ đây, cái cảm giác ấy một lần nữa lại ùa về khi tôi bƣớc chân vào phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng. Chính các thầy cô, anh chị, các bạn ở đây đã tạo cho tôi có một sự tự tin, nỗ lực hơn trong cuộc sống c ng nhƣ trong học tập. Để hoàn thành luận văn này, tôi biết bản thân đã nhận rất nhiều sự giúp đỡ của mọi ngƣời. Đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Thầy, PGS. TS. Dƣơng Tấn Nhựt. Thầy đã tận tình chỉ bảo cho tôi biết thế nào là nghiên cứu kho học, qu sự giảng dạy củ Thầy, cả chân trời tri thức nhƣ rực sáng trƣớc mắt tôi. Có lẽ, tôi sẽ không b o giờ biết đƣợc những điều kỳ diệu ấy nếu nhƣ không có sự tâm huyết, nhiệt tình, tận tụy củ Thầy. Làm sao tôi quên đƣợc từng lời răng dạy nghiêm khắc trong những buổi họp, h y những câu chuyện hóm hỉnh trong bàn ăn, đặc biệt là hình ảnh đôi t y khẳng khiu, run run củ Thầy trong những ngày bệnh nhƣng vẫn cố gắng gƣợng, đích thân chụp hình kết quả thí nghiệm cho chúng tôi cốt là để số liệu, hình ảnh thu đƣợc chính xác và sắc nét nhất. Chính giây phút ấy, tôi biết bản thân thật m y mắn khi đƣợc trở thành học trò củ Thầy – “Ngƣời Thầy Toàn Tâm”. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Nguyễn Phúc Huy đã chi sẻ nhiều kinh nghiệm, những kiến thức thực tế, những lời động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn B n lãnh đạo Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên; Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo s u Đại học, các giảng viên củ Trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn tới các cán bộ phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên: TS. V Quốc Luận, NCS. V Thị Hiền, TS. Nguyễn Bá N m, NCS. Hoàng Th nh Tùng, cô Phi Phƣợng. Cảm ơn mọi ngƣời đã nhiệt tình, dành nhiều thời gi n để chỉ bảo, giúp đỡ tôi. v Tôi c ng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến tập thể các nh chị cán bộ, nhân viên tại công ty CP Công nghệ Sinh học Thái Dƣơng đã giúp tôi có những buổi kiến tập thực tế bổ ích. Xin cảm ơn tập thể lớp 15SSH21 trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cùng tất cả các nh chị, các bạn học sinh, sinh viên, học viên củ các trƣờng Đại học Kho học Tự nhiên, Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin Đà Lạt, Đại học Huế, Đại học Tôn Đức Thắng,… đã và đ ng thực tập tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên. Bằng sự tin yêu và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. BS. CKII. Trần Trọng Nhật Huy, kho Nội, Trung tâm Y tế Vietsovpetro – bác sĩ điều trị, ngƣời đã cứu sống tôi không chỉ một mà rất nhiều lần, cảm ơn nh vì đã luôn tận tình cứu chữ , qu n tâm, đồng hành cùng tôi trong cuộc sống. Tôi sẽ không thể có đủ sức khỏe để hoàn thành luận văn này nếu không có anh. Trên hết, con xin gửi lời cảm ơn đến b mẹ, chị h i và út. Dù có đi đâu, làm gì, con (em, chị) vẫn mãi là ngƣời con, ngƣời em, ngƣời chị trong gi đình; vẫn luôn cần một điểm tự , để đƣợc dỗ dành những phút con mít ƣớt, yếu lòng nhất. Con biết mọi ngƣời thƣơng con, lo cho sức khỏe củ con nên đã từng rất giận khi con quyết định rời x gi đình mình. Ông bà t thƣờng nói “Đi một ngày đàng, học một sàng khôn”, quả đúng là nhƣ thế, bởi con cảm thấy bản thân đã chín chắn hơn rất nhiều s u khoảng thời gi n rèn luyện. Và đặc biệt, khi càng x mọi ngƣời, con mới càng nhận r không đâu bằng gi đình. Con xin lỗi và cảm ơn mọi ngƣời vì đã luôn tin tƣởng con, ủng hộ cho lý tƣởng sống củ con, dẫu rằng con vẫn chƣ thành công nhƣ mọi ngƣời kỳ vọng. Nhà là nơi để về, là nơi để yêu thƣơng đong đầy, con mãi yêu mọi ngƣời. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Đà Lạt – Mảnh đất thân thƣơng gắn với những câu chuyện về “Lòng ngƣời và những Bài học trong Cuộc sống”. Trân trọng cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2017 Người thực hiện luận văn Dƣơng Bảo Trinh vi TÓM TẮT Khử trùng mẫu cấy là gi i đoạn vô cùng quan trọng của quá trình tạo nguồn mẫu b n đầu trong nuôi cấy in vitro. Các chất khử trùng hiện n y thƣờng có tính độc cao gây ảnh hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp cho sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nano bạc không chỉ kháng khuẩn hiệu quả mà còn n toàn cho con ngƣời. Do đó, n no bạc đ ng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nh u nhƣ: y học, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, sinh học, nông nghiệp,… Tuy nhiên, các báo cáo về ảnh hƣởng của nano bạc trong gi i đoạn khử trùng mẫu cấy thực vật vẫn còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] và nano bạc đã đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu cấy african violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl.) với dãy nồng độ, thời gian khử trùng khác nhau nhằm khảo sát khả năng khử trùng và cảm ứng mẫu cấy của nano bạc trong giai đoạn khử trùng mẫu. Sau khi khử trùng, chúng tôi tiến hành theo dõi và đánh giá sự sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy qu các gi i đoạn khác nhau. Kết quả cho thấy, mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05% trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất mà không có tác động xấu đến sự sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy. Nano bạc kích thích sự cảm ứng của mẫu cấy. Đây là nghiên cứu đầu tiên về khả năng khử trùng c ng nhƣ v i trò của nano bạc lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl.). vii ABSTRACT Surface sterilization is the most important step in preparation of explants for micropropagation, because controlling fungal and bacterial contamination of plant from field sources is very difficult. Most of surface disinfectants are now highly toxic influence either directly or indirectly to human health and the environment. Many studies have demonstrated not only nano silver antibacterial effect efficient but also extremely safe for humans. So, the silver nanoparticles have been widely used in many different fields of life, such as medicine, pharmaceuticals, cosmetics, biological, agricultural,... However, reports on the effect of silver nanoparticles for surface sterilization of plant explants are still limited. Nano silver and typical disinfectants [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] were tested for sterilization of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.), by varying their concentration and time of exposure. The target of this study was to examine evaluated the possibility of sterilization and stimulate explants of nano silver for micropropagation. After performing the decontamination step, we observed to evaluate the growth and development of explants through subsequent stages of the micropropagation process of african violet. The results indicated that among these sterilizing agents nano silver at concentration of 0.05% for 15 minutes was the best for controlling the infection. Nano silver could be applied without adverse effects on the plant growth and development. The induction of the explants in culture was also stimulated by silver nanoparticles. This is the first report on in vitro establishment using nano silver to reduce bacterial infections, as well as the role of silver nanoparticles on the growth and development of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.). viii MỤC LỤC Trang NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................v TÓM TẮT ................................................................................................................ vii CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ..............................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2 1.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................2 1.4. Ý nghĩ đề tài......................................................................................................2 1.4.1. Ý nghĩ kho học .........................................................................................2 1.4.2. Ý nghĩ thực tiễn ..........................................................................................3 1.5. Kết cấu luận văn .................................................................................................3 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................1 2.1. Tổng quan về cây african violet .........................................................................4 2.1.1. Phân loại và đặc điểm ..................................................................................4 2.1.2. Tình hình nghiên cứu african violet .............................................................5 2.2. Sơ lƣợc về gi i đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật ............................6 2.3. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ..................8 2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2] ................................................................8 2.3.1.1. Giới thiệu .................................................................................................8 2.3.1.2. Nhƣợc điểm .............................................................................................9 2.3.2. Mercury chloride (HgCl2) ............................................................................9 2.3.2.1. Giới thiệu .................................................................................................9 2.3.2.2. Nhƣợc điểm ...........................................................................................10 2.3.3. Một số chất khử trùng khác .......................................................................10 2.3.3.1. Hydro peroxide (H2O2) ..........................................................................10 2.3.3.2. Nƣớc brom .............................................................................................11 ix 2.3.3.3. Các chất kháng sinh ...............................................................................11 2.3. Sơ lƣợc về nano bạc .........................................................................................11 2.3.1. Nano bạc ....................................................................................................11 2.3.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc ..................11 2.3.1.2. Ƣu điểm của nano bạc ...........................................................................12 2.3.2. Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................13 2.3.2.1. Các nghiên cứu sinh trƣởng và phát triển của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................................13 2.3.2.2. Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................................................14 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................4 3.1. Đị điểm và thời gian tiến hành đề tài ..............................................................17 3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm...................................................................................17 3.2.1. Nguồn mẫu và nguyên liệu ........................................................................17 3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy ..................................................................................17 3.2.3. Điều kiện nuôi cấy .....................................................................................17 3.2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................18 3.2.4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy...........................................................................................18 3.2.4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro .....................................................................................20 3.2.4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm...............................................................................21 3.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học ...........................................................22 3.3. Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu......................................................................23 x CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................17 4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy .........24 4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro ..............................................................................................................46 4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm .........................................................................................................55 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................59 5.1. Kết luận ............................................................................................................59 5.1.1. Kết quả đạt đƣợc ........................................................................................59 5.1.2. Quy trình khử trùng mẫu cấy african violet bằng nano bạc ......................59 5.2. Kiến nghị ..........................................................................................................61 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ..........................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................63 1. Tài liệu tiếng Việt ...............................................................................................63 2. Tài liệu tiếng Anh ...............................................................................................64 PHỤ LỤC ..................................................................................................................71 xi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B5 : Gamborg và đồng tác giả (1968) BA : 6-Benzylaminopurine DNA : Deoxiribonucleic acid IBA : 3-Indol butyric acid MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : Naphthalene acetic acid SAM : S-Adenosyl methionine xii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác nhân vô trùng ...........................................................................................8 Bảng 3.1. So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy ....................................................19 Bảng 3.2. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy african violet in vitro từ nguồn mẫu khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] .......................................20 Bảng 3.3. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ..................................................................................................21 Bảng 3.4. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm ..............................................................................................22 Bảng 4.1a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm .........................................................................................25 Bảng 4.1b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm ....................................................................26 Bảng 4.2a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết ......................................................................................27 Bảng 4.2b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết .................................................................28 xiii Bảng 4.3a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công ...........................................................................30 Bảng 4.3b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công ......................................................31 Bảng 4.4. Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy.................................................41 Bảng 4.5. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cụm chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ...............................................47 Bảng 4.6. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................................52 Bảng 4.7. So sánh sự thích nghi, sinh trƣởng của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 4 tuần ở điều kiện ex vitro .................................55 xiv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Cây hoa african violet ..............................................................................4 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy .........................................................7 Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác nhân vô trùng ...........................................................................................8 Hình 4.1. Sự cảm ứng giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ...................................42 Hình 4.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học của các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và các chất khử trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy.........................................................................................43 Hình 4.3. Mẫu lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2, Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tái sinh chồi sau 30 ngày nuôi cấy .................................................................................................48 Hình 4.4. Mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2, Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 30 ngày nuôi cấy.........................................................................................53 Hình 4.5. Cây con tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................56 Hình 4.6. African violet ra hoa sau 4 tháng trồng ngoài vƣờn ƣơm .....................57 Hình 5.1. Sơ đồ khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc trong quy trình nhân giống cây african violet .........................................................................60 xv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet của HgCl2 ............................................................................................33 Biểu đồ 4.1b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african violet của HgCl2 ..................................................................................33 Biểu đồ 4.2a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet của Ca(ClO)2 .......................................................................................34 Biểu đồ 4.2b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african violet của Ca(ClO)2 .............................................................................35 Biểu đồ 4.3a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet của AgNO3 ..........................................................................................36 Biểu đồ 4.3b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african violet của AgNO3 ................................................................................36 Biểu đồ 4.4a. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu lá african violet thành công khi khử trùng bằng nano bạc ............................................................................37 Biểu đồ 4.4b. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu cuống lá african violet thành công khi khử trùng bằng nano bạc ...............................................................38 Biểu đồ 4.5. Biểu đồ thể hiện số chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ...........................................................................49 xvi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đƣ mẫu từ môi trƣờng ex vitro vào in vitro là gi i đoạn vô cùng khó khăn bởi vì ở gi i đoạn này mẫu cấy thông thƣờng dễ bị nhiễm nấm, khuẩn, bị chết hoặc mẫu cấy phát triển chậm, gây tốn kém và mất thời gi n cho ngƣời thực hiện. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên: chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng mẫu cấy chƣ phù hợp là những nguyên nhân chính dẫn đến sự thất bại trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu (Abdi et al., 2012). Phần lớn các chất khử trùng mẫu đ ng đƣợc sử dụng hiện nay [HgCl2, Ca(ClO)2,…] là các chất mang tính tẩy rửa cao, kháng vi sinh vật theo cơ chế ăn mòn vách, thành tế bào vi khuẩn và nấm nên thƣờng gây ảnh hƣởng đến mẫu cấy nhƣng vẫn không hiệu quả trong khử trùng mẫu (Ines et al., 2013). Ngoài ra, hầu hết các chất đƣợc sử dụng trong khử trùng mẫu cấy hiện nay đều có tác động xấu tới sức khỏe con ngƣời (WHO, 2000). Việc tìm ra một loại chất khử trùng mới an toàn cho sức khỏe, hiệu quả trong khử trùng mẫu và có tác dụng kích thích mẫu cấy là việc vô cùng cần thiết. Bạc và các muối bạc đã đƣợc sử dụng phổ biến trong khử trùng y khoa nhờ đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe và sự tăng sinh của các mô biểu bì (Abdi et al., 2012). Mặt khác, ion bạc còn đóng v i trò quan trọng trong việc tác động phát sinh phôi soma, tạo chồi và tạo rễ (Bais et al., 2000), ảnh hƣởng tích cực trong điều chỉnh quá trình sinh lý bao gồm cả hình thái của mẫu cấy (Halevy et al., 1981); do đó, ion bạc đã đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật nhằm kích thích mẫu cấy c ng nhƣ hạn chế số lƣợng mẫu nhiễm (Russell et al., 1994; Abdi et al., 2012). Thông thƣờng các ion bạc luôn đi kèm với các cation tồn tại ở dạng muối nhƣ: bạc nitrate, bạc thiosulph te,… điều này ảnh hƣởng đến hiệu quả hấp thu và khử trùng của ion bạc. Công nghệ n no r đời để khắc phục tình trạng trên, với các đặc tính ƣu việt nhƣ: tăng hiệu quả tiếp xúc bề mặt nên ion dễ dàng bám dính xâm nhập vào tế bào 1