Tài liệu Luận án Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2 oxoindolin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : Hóa dược Mã số : 62720403 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Hải Nam HÀ NỘI, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu được sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh Đỗ Thị Mai Dung LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành luận án là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành đến GS.TS. Nguyễn Hải Nam - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện luận án này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án tiến sĩ. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến chồng và gia đình thân yêu đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 20 tháng 2 năm 2020 Nghiên cứu sinh Đỗ Thị Mai Dung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN..................................................................................................... 2 1.1. HISTON DEACETYLASE.........................................................................................2 1.1.1 Khái niệm ................................................................................................................2 1.1.2. Phân loại.................................................................................................................3 1.1.3. Cấu trúc các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV.................................4 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE.................................................8 1.2.1. Các acid hydroxamic ..........................................................................................12 1.2.2. Các benzamid.......................................................................................................32 1.2.3. Các peptid vòng...................................................................................................33 1.2.4. Các ceton ..............................................................................................................34 1.2.5. Các acid carboxylic.............................................................................................34 1.2.6. Các nhóm chất khác ............................................................................................35 1.3. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VÒNG TRIAZOL ................................................36 1.3.1. Xúc tác..................................................................................................................37 1.3.2. Phối tử...................................................................................................................38 1.4. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC TỪ ESTER .................39 1.5. ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC................................................................41 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................................43 2.1. NGUYÊN LIỆU..........................................................................................................43 2.2. THIẾT BỊ.....................................................................................................................43 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................44 2.3.1. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................44 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................45 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................54 3.1. KẾT QUẢ DỰ ĐOÁN TƯƠNG TÁC, TỔNG HỢP VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT..................................................................................................54 3.1.1. Kết quả dự đoán tương tác của các chất với HDAC2.....................................54 3.1.2. Tổng hợp hóa học................................................................................................55 3.1.3. Kết quả phân tích dữ liệu phổ............................................................................80 3.2. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM, ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ DỰ ĐOÁN MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC........................................................107 3.2.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC...............................................................107 3.2.2 Kết quả thử tác dụng độc tính trên một số dòng tế bào ung thư .................108 3.2.3. Kết quả thử tác dụng độc tính trên tế bào thường .........................................110 3.2.4. Kết quả dự đoán một số thông số dược động học.........................................110 Chương 4. BÀN LUẬN.....................................................................................................111 4.1. TỔNG HỢP HOÁ HỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT111 4.1.1. Tổng hợp hóa học..............................................................................................111 4.1.2. Khẳng định cấu trúc..........................................................................................115 4.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC ........................................................................................125 4.2.1. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy dẫn chất Ia-g và IIa-g........................125 4.2.2. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy chất IIIa-g ...........................................129 4.2.3. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g .....132 4.2.4. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất VIIa-g và VIIIa-g .......136 4.2.5. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c ..............139 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................................................148 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ADME: ADN: AR: Arg: BBB: Cys : C-Myc: logP: logD: CHAP CuAAC: CTCL CTPT DFT DMF: DMSO: DNMT: E2F: EGFR: ERα: Gly: Glu: HAT: HDAC: HIF-1α: HMBC: HMPT: HMT: Nghĩa của từ (Từ gốc tiếng anh) Các thông số hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ (absorption, distribution, metabolism, and excretion) Acid deoxyribonucleic Thụ thể androgen (androgen receptor) Agrinin Hàng rào máu não (brain blood barier) Cys tein Họ gen điều chỉnh và gen tiền ung thư Hệ số phân bố phụ thuộc pH Hệ số phân bố không phụ thuộc pH Peptid vòng chứa acid hydroxamic (Cyclo hydroxamic acid peptide) Phản ứng đóng vòng azid - alkyn có xúc tác Cu(I) (Copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition) U lympho tế bào T ở da (cutaneous T cell lymphoma) Công thức phân tử Lý thuyết phiếm hàm mật độ (density functional theory) Dimethylformamid Dimethyl sulfoxid Enzym ADN methyltransferase (DNA methyltransferase) Yếu tố phiên mã ở các tế bào nhân thật bậc cao (Eukaryotes transcription factors) Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor) Thụ thể estrogen alpha (estrogen receptor α) Glycin Acid glutamic Enzym histon acetyltransferase (histone acetyltransferase) Enzym histon deacetylase (histone deacetylase) Yếu tố cảm ứng sự giảm oxi máu 1- α (hypoxia-inducible factor 1- α) Gắn kết dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear multiple bond coherence) Hexamethylphos phoramid Enzym histon methyl trans ferase (histone methyl transferase) HSP-90: HSQC: KLPT Ile: Ku70: Leu: Lys : MDB: MeCN: Met: MSin3: MW: N-CoR: NF-ĸB: p53: PB: PDB: Phe: Pro: TPSA: Rfx: RMSD: RUNX3: SAHA: Ser: SMRT: Smad7: TEA: Tyr: UDP: Val: VD: VEGFR: Protein sốc nhiệt - 90 (heat sock protein - 90) Tương quan lượng tử bội dị hạt nhân (Heteronuclear multiple quantum coherence) Khối lượng phân tử Isoleucin Protein chỉnh sửa Ku70 (DNA repair protein Ku70) Leucin Lys in Protein gắn methyl (methyl-binding protein) Acetonitril Methionin Protein mSin3 Khối lượng phân tử (molecular weight) Chất đồng kìm hãm thụ thể trong nhân (nuclear receptor corepressor) Yếu tố kappa B trong nhân Kháng thể chống khối u của tế bào p53 (cellular tumor antigen p53) Tỷ lệ gắn kết protein (protein binding) Ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank) Phenynalanin Prolin Tổng diện tích bề mặt protein (total protein surface area) Hồi lưu (Reflux) Độ lệch căn quân bình phương (root mean square difference) Yếu tố phiên mã RUNX3 (trans cription factor RUNX3) Acid suberoylanilid hydroxamic Serin Thụ thể của hóc môn retinoid hoặc thyroid (retinoid or thyroid-hormone receptors) Protein Smad7 Triethylamin Tyrosin Enzym glucuronos yltransferase Valin Thể tích phân bố (volume of distribution) Yếu tố tăng trưởng mạch nội mô (vas cular endothelial growth factor) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong luận án ............................................ 43 Bảng 2.2: Bảng tỷ lệ các thành phần trong các dung dịch để định lượng tác dụng ức chế HDAC2 ........................................................................................................................ 51 Bảng 3.1: Bảng tổng kết năng lượng liên kết dự đoán của các cấu trúc thiết kế với HDAC2 .............................................................................................................................................. 54 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 2D NMR HM BC và HSQC của dẫn chất Ia. ......................... 81 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 2D HMBC và HSQC của dẫn chất VIIa. ............................... 96 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 2D HMBC và HSQC của dẫn chất IXa. ............................... 103 Bảng 4.1: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất Ia-g và IIa-g ............................ 126 Bảng 4.2: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất IIIa-g ........................................ 130 Bảng 4.3: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g................................................................................... 132 Bảng 4.4: Kết quả dự đoán về độ tan và các thông số ADME của Va-f và VIc, VId ............................................................................................................................................ 136 Bảng 4.5: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào của các dãy dẫn chất VIIa-g, VIIIa-g ........................................................................................ 137 Bảng 4.6: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của các dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c .......................................................................................................... 139 Bảng 4.7: Kết quả thử tác dụng ức chế các loại enzym HDAC khác nhau của Xc. 140 Bảng 4.8: Kết quả thử tác dụng độc tính trên tế bào thường của một số chất ......... 141 Bảng 4.9: Kết quả nghiên cứu docking của hai chất IXg và Xc với HDAC1, 2, 6 và 8 ......................................................................................................................................... 142 Bảng 4.10: Kết quả dự đoán một số thông số lý hóa và thông số dược động học của chất IXg và Xc ................................................................................................................. 144 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng đóng vòng click có xúc tác Cu(I) ..................................... 36 Sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng hợp acid benzohydroxamic........................................................ 40 Sơ đồ 1.3: Sơ đồ tổng hợp acid hydroxamic sử dụng cột Dowex 50.......................... 40 Sơ đồ 1.4: Sơ đồ tổng hợp acid hydroxamic từ một số ester có khả năng phản ứng mạnh .............................................................................................................................................. 40 Sơ đồ 1.5: Sơ đồ tổng hợp acid hydroxamic có thêm xúc tác KCN ........................... 41 Sơ đồ 1.6: Sơ đồ tổng hợp acid hydroxamic sử dụng sóng vi sóng ............................ 41 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ tổng hợp dãy chất Ia-g ........................................................................ 55 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tổng hợp dãy chất IIa-g ...................................................................... 58 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tổng hợp dãy chất IIIa-g ..................................................................... 61 Sơ đồ 3.4. Sơ đồ tổng hợp các dãy chất IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g ........ 65 Sơ đồ 3.5. Sơ đồ tổng hợp dãy chất IXa-g ..................................................................... 75 Sơ đồ 3.6. Sơ đồ tổng hợp dãy chất Xa-c ....................................................................... 78 Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng alkyl hoá .......................................................................... 111 Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng azid hoá............................................................................ 112 Sơ đồ 4.3. Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester............................... 114 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình biểu diễn cơ chế deacetyl hoá lysin của HDAC ................................... 2 Hình 1.2: Mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC2...................................... 4 Hình 1.3: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC8..................................................... 5 Hình 1.4: Hình ảnh bề mặt của các HDAC1, 2, 3 và 8 ................................................... 6 Hình 1.5: Cấu trúc vùng trung tâm hoạt động của HDAC6 và HDAC10 .................... 7 Hình 1.6: Cấu trúc 3 phần chính của các chất ức chế HDAC........................................ 8 Hình 1.7: Cấu trúc của Apicidin và Azumamid E........................................................... 9 Hình 1.8: Cấu trúc của nhóm gắn kẽm theo Vanommeslaeghe K. và cộng sự.......... 10 Hình 1.9: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Salmi-Smail C. .......... 12 Hình 1.10: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Wang T..................... 13 Hình 1.11: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Fang H. ..................... 13 Hình 1.12: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Piral T. ...................... 14 Hình 1.13: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Jiang S. ..................... 14 Hình 1.14: Cấu trúc các chất ức chế HDAC do Dai Y. tổng hợp................................ 15 Hình 1.15: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Liu H......................... 15 Hình 1.16: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Zhu L. ....................... 16 Hình 1.17: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Chao S.W. ................ 16 Hình 1.18: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Yang F...................... 17 Hình 1.19: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu tiếp theo của Yang F...... 17 Hình 1.20: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Kozikowski A.P. .... 18 Hình 1.21: Cấu trúc của chất ức chế HDAC có vòng cyclodextrin ............................ 18 Hình 1.22: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Sodji Q.H. ................ 19 Hình 1.23: Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất tương tự SAHA được gắn thêm nhóm thế trên cầu nối........................................................................................................ 21 Hình 1.24: Cấu trúc các acid hydroxamic mang khung γ– lactam.............................. 21 Hình 1.25: Cấu trúc các chất mang khung isoxazol hoặc isoxazo lin .......................... 22 Hình 1.26: Cấu trúc các acid hydroxamic mang vòng furan........................................ 22 Hình 1.27: Cấu trúc các acid hydroxamic phát triển từ cấu trúc ADS100380 .......... 23 Hình 1.28: Cấu trúc các 3-(4-benzoyl-1H-2-pyrrolyl)-N-hydroxy-2-propenamid .... 23 Hình 1.29: Cấu trúc hai chất mới được phát triển tiếp từ 24a ..................................... 24 Hình 1.30: Những thay đổi cấu trúc dựa trên công thức của chất 24a ....................... 24 Hình 1.31: Cấu trúc các (aryloxo-propenyl)pyrrolyl hydroxamat............................... 25 Hình 1.32: Cấu trúc và liên quan cấu trúc tác dụng của các chất được phát triển từ NSC746457 ........................................................................................................................ 25 Hình 1.33: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Jiang Y...................... 26 Hình 1.34: Cấu trúc các acid biphenylacrylohydroxamic ............................................ 27 Hình 1.35: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Fang H. ..................... 27 Hình 1.36: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Lee H.Y. ................... 28 Hình 1.37: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Mehndiratta S. ......... 28 Hình 1.38: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Zhang Y.................... 29 Hình 1.39: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Li X. .......................... 29 Hình 1.40: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Zhou M..................... 30 Hình 1.41: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Choi Y.S................... 30 Hình 1.42: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Micheal S. ................ 31 Hình 1.43: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Gopalan B. ............... 31 Hình 1.44: Liên quan cấu trúc tác dụng trong nghiên cứu của Ning C. ..................... 32 Hình 1.45: Cấu trúc các acid hydroxamic do Kim D. tổng hợp .................................. 32 Hình 1.46: Cấu trúc của MS-275 và CI-994 .................................................................. 33 Hình 1.47: Tổng hợp một số hướng nghiên cứu từ chất dẫn đường là MS-275........ 33 Hình 1.48: Cấu trúc của một số peptid vòng.................................................................. 34 Hình 1.49: Cấu trúc của một số ceton ức chế HDAC................................................... 34 Hình 1.50: Cấu trúc của một số muối carboxylic mạch ngắn ...................................... 35 Hình 1.51: Cấu trúc một số nhóm gắn kẽm trong các chất ức chế HDAC ................ 35 Hình 1.52: Một số cấu trúc phần cầu nối trong các chất ức chế HDAC..................... 35 Hình 1.53: Một số cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt của các chất ức chế HDAC .............................................................................................................................................. 36 Hình 1.54: Cấu trúc một số phối tử thường dùng trong phản ứng CuAAC............... 39 Hình 4.1: Cấu trúc chung của dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g ........................................ 117 Hình 4.2: Công thức cấu tạo chung của dãy IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g ............................................................................................................................................ 121 Hình 4.3: Công thức cấu tạo chung của dãy IXa-g và Xa-c ...................................... 122 Hình 4.4: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của dãy chất Ia-g, IIa-g.................. 125 Hình 4.5: Hình ảnh docking của chất Ib và IIb........................................................... 128 Hình 4.6: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của dãy chất IIIa-g ......................... 129 Hình 4.7: Hình ảnh docking của dãy chất IIIa-g......................................................... 131 Hình 4.8: Hình ảnh docking của chất IVb, Va, VIg ................................................... 134 Hình 4.9: Hình ảnh docking của chất VIIg và VIIIf .................................................. 138 Hình 4.10: Hình ảnh docking của chất IXg và Xc ...................................................... 142 Hình 4.11: Các vị trí chuyển hóa quan trọng được dự đoán bằng phương pháp XenoSite của chất IXg .................................................................................................... 145 Hình 4.12: Các vị trí chuyển hóa quan trọng được dự đoán bằng phương pháp XenoSite của chất Xc...................................................................................................... 145 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, enzym histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là một phân tử mục tiêu quan trọng trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư. Các chất ức chế HDAC được chứng minh có thể tạo ra nhiều tác dụng giúp ngăn chặn quá trình phát sinh và phát triển của tế bào ung thư [172]. Một số chất ức chế HDAC đang được dùng làm thuốc điều trị ung thư có thể kể đến như acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006), depsipeptid (Romideps in ®, 2009), belinostat (Beleodaq ®, 2014), panobinostat (Farydak®, 2015). Bên cạnh đó, rất nhiều chất khác với tác dụng ức chế enzym HDAC nổi bật, cũng đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng cho những kết quả ban đầu tương đối khả quan. Về mặt cấu trúc, các chất ức chế HDAC có cấu trúc khá đa dạng và được phân loại thành một số nhóm chất chính gồm: acid hydroxamic, các benzamid, các peptid vòng, các ceton, các acid béo mạch ngắn và một số cấu trúc hỗn hợp khác. Trong đó, nhóm các acid hydroxamic ức chế HDAC là nhóm chất được nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ức chế enzym mạnh. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật chụp X-quang tinh thể, cơ chế tương tác của các chất với trung tâm hoạt động của enzym dần được làm sáng tỏ. Trên cơ sở đó, các nhà nghiên cứu đã xây dựng những mô hình 3D mô phỏng trung tâm hoạt động của các HDAC. Những mô hình này có thể được sử dụng làm dữ liệu cho nghiên cứu docking nhằm dự đoán tương tác của các cấu trúc mới với enzym. Hội nhập cùng xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế và tổng hợp được nhiều dãy acid hydroxamic mới có tác dụng ức chế HDAC. Trong đó, có thể kể đến các dẫn chất mang khung benzothiazol với tác dụng ức chế enzym cũng như độc tính tế bào tương đương với acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) [109]. Các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới đều cho thấy acid hydroxamic mang một hay nhiều khung cấu trúc giàu electron như phenyl, benzothiazol, indol, indolin... có tiềm năng tạo ra tác dụng ức chế HDAC tốt. Khung indolin có mặt trong cấu tạo của nhiều chất mang hoạt tính kháng ung thư nhưng chưa có nhiều cấu trúc mang khung này được khảo sát về tác dụng ức chế HDAC. Trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu trong và ngoài nước, luận án “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Tổng hợp được khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mới mang khung 2-oxoindolin. 2. Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng kháng một số dòng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được. 1 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. HISTON DEACETYLAS E 1.1.1 Khái niệm Histon deacetylasse (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm ε-N-acetyl của lysin ở đầu N tận cùng của protein histon. Histon acetyltransferase (HAT) có tác dụng đối lập với HDAC và phối hợp hoạt động với HDAC để điều chỉnh số lượng acetyl histon theo các tín hiệu phiên mã nhận được [95]. Các HDAC tồn tại cả ở dạng protein đơn lẻ và phức hợp với các protein như mSin3, N-CoR và SMRT để tạo thành các phức hợp đồng kìm hãm phiên mã [132]. Những phức hợp này sau đó được vận chuyển đến những vùng genom xác định nhờ tương tác với các yếu tố có vị trí gắn đặc hiệu trên ADN bao gồm các yếu tố phiên mã, các thụ thể trong nhân, các gen điều chỉnh di truyền biểu sinh, cụ thể như protein gắn methyl (MDB), enzym ADN methyl transferase (DNMT) và enzym histon methyl transferase (HMT). Biến đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể bởi hoạt động của enzym histon deacetylase là một trong những cơ chế của di truyền biểu sinh [161]. Quá trình acetyl hoá lys in của protein histon được khám phá ra bởi Allfrey V.G. và cộng sự từ khoảng năm thập kỷ trước [3]. Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã chỉ ra tầm quan trọng của sự acyl hoá nhóm ε-amino của phân tử lys in ở đầu N tận cùng của histon trong quá trình biểu hiện gen. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học nhận định rằng sự cân bằng trong hoạt động của enzym HAT và HDAC là yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt hoá hay bất hoạt quá trình phiên mã [48]. Cơ chế deacetyl hoá lys in xúc tác bởi HDAC được minh hoạ trong hình dưới đây (Hình 1.1). Nhóm chức N-ε-acetyl trên lys in được gắn với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của enzym. Enzym được hoạt hoá, nhóm chức acetyl bị tấn bởi một phân tử nước tạo ra sản phẩm là lysin ở dạng amoni không gắn nhóm acetyl và sản phẩm phụ là acid acetic ở dạng acetat. Hình 1.1: Hình biểu diễn cơ chế deacetyl hoá lysin của HDAC 2 HDAC được đặt tên theo protein histon do các nhà nghiên cứu khám phá ra chức năng của nhóm enzym này đầu tiên là loại bỏ nhóm acetyl của histon [46]. Tuy nhiên, sau này các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của nhóm enzym này cho thấy các enzym HDAC còn có khả năng deacetyl hoá rất nhiều protein không phải histon khác bao gồm các yếu tố phiên mã như RUNX3 [62], p53 [59], E2F [97], cMyc [112], yếu tố kappa B của nhân (NF-ĸB) [21], yếu tố cảm ứng sự giảm oxi máu 1-alpha (HIF-1α) [70], thụ thể estrogen alpha (ERα) [41], thụ thể androgen (AR) [131], chaperon (HSP90) [7], nhân tố điều chỉnh tín hiệu Stat3 [166] và Smad7 [134], protein chỉnh sửa (Ku70) [26] và một yếu tố phiên mã quan trọng cho sự phát triển xương cũng được xác định là cơ chất của HDAC [60]. 1.1.2. Phân loại Cho đến nay, 18 loại enzym HDAC đã được xác định và phân chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men. Trong 4 nhóm này các enzym nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc kim loại (metalloenzym), trong quá trình hoạt động cần có sự phối hợp của ion kẽm nằm ở trung tâm xúc tác của các enzym [106]. Ngược lại, các enzym HDAC nhóm III (các sirtuin) được xác định là các enzym có hoạt động phụ thuộc NAD+. Và khái niệm các chất ức chế HDAC thường được đề cập đến là các chất có khả năng ức chế các HDAC nhóm I, II và IV. Các HDAC có độ dài chuỗi amino acid không giống nhau, thay đổi từ 347 amino acid (HDAC11) đến 1215 amino acid (HDAC6). Tất cả các HDAC đều có vùng deacetyl được bảo tồn cao. Sự khác biệt lớn nhất giữa các enzym được tìm thấy ở vùng cửa vào của trung tâm hoạt động. Ngoài ra, các HDAC nhóm I cho thấy có thêm một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, được dự đoán là vị trí có vai trò đưa phân tử nước vào và loại bỏ sản phẩm phụ là acid acetic. Khoang phụ này dường như không có mặt ở các HDAC nhóm II. Với các HDAC nhóm III, không có ion kẽm ở trung tâm hoạt động, các phân tử lys in mang nhóm acetyl được gắn với ADP-ribose. Vị trí phân bố trong tế bào của các HDAC không giống nhau, các HDAC nhóm I và IV có ở nhân tế bào, các HDAC nhóm IIb có ở bào tương, còn các HDAC nhóm IIa được tìm thấy ở cả nhân và bào tương. Chức năng và cơ chất của từng enzym trong nhóm cũng không hoàn toàn giống nhau. Trong đó, đặc biệt nhất là nhóm I, tất cả các enzym nhóm này đều có chức năng sinh học liên quan đến quá trình sinh sản của tế bào [96]. 3 1.1.3. Cấu trúc các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV 1.1.3.1. HDAC nhóm I HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 là các enzym thuộc nhóm I. HDAC1, HDAC2 và HDAC3 là hợp phần trong các phức hợp protein có liên quan đến quá trình ức chế phiên mã. Mô hình cấu trúc được xây dựng dựa trên sự tương đồng của các biến thể HDAC1 khác nhau, vốn được dùng để giải thích những đột biến trên HDAC, cũng rất hữu ích cho việc phát triển các chất ức chế HDAC và xây dựng cấu trúc mang hoạt tính (pharmacophore) cho các chất này. Quá trình phân tách cấu trúc tinh thể bằng tia X của HDAC1 cho thấy cấu trúc của trung tâm hoạt động được tạo bởi một kênh kỵ nước kích thước 11Å với một ion kẽm có vai trò xúc tác và một khoang phụ thân nước có kích thước 14Å nằm ở đáy của kênh enzym. Khi không có phối tử, khoang phụ này tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng deacetylase hoá, giúp cho sản phẩm phụ acetat được loại ra khỏi phản ứng thông qua những tương tác ưu tiên [37, 153]. Cấu trúc của các HDAC2 bao gồm 8 phiến gấp nếp β (β sheet) và 13 cấu trúc xoắn α (α helice) trong một domain α/β, với các phiến β kẹp giữa các xoắn α (Hình 1.2). Kênh enzym kết nối bề mặt enzym với ion kẽm cũng có bản chất thân dầu, kích thước xấp xỉ 11Å, được bao phủ bởi các amino acid là Gly154, Phe155, Phe210 và His183 có khả năng tạo phức với ion kẽm. Từ vị trí liên kết với kẽm, khoang phụ có kích thước 14Å và bản chất thân nước có vị trí hướng về phần trung tâm của enzym. Các amino acid gồm Met35, Phe114 và Leu144 là những amino acid chính tạo nên khoang phụ [79, 152]. Hình 1.2: Mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC2 Khoang phụ của HDAC8 được bộc lộ ra bên ngoài cho thấy sự linh động của kênh enzym trên bề mặt protein (Hình 1.3). Khoang phụ này chứa một số amino acid Arg được bảo tồn cao và phần cấu trúc quan trọng nhất là arginin trung tâm của 4 chuỗi bên R37. Acid amin này được cho là giúp cải thiện cả hoạt tính xúc tác cùng với ái lực acetat của HDAC8, và có vai trò bảo vệ kênh enzym khi tham gia vào quá trình vận chuyển nước và acid acetic ra khỏi trung tâm hoạt động của enzym. Sự chuyển động của phân tử nước hoặc acid acetic bị ức chế bởi liên kết bền vững giữa G139 và G303. Do đó cần có sự sắp xếp lại cấu trúc của chuỗi bên R37 và vòng xoắn (loop) để mở rộng vị trí hoạt động để các phân tử này có thể di chuyển ra ngoài thông qua kênh enzym [50, 154, 155]. Hình 1.3: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC8 Cho đến nay, theo dữ liệu cấu trúc trên Ngân hàng dữ liệu protein (PDB) có 7 enzym gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, HDAC7 và HDAC8 ở người hoặc nấm men đã được công bố cấu trúc tinh thể kết tinh (có hoặc không kèm với chất ức chế có liên quan). So sánh cấu trúc của các HDAC nhóm I cho thấy cả 4 loại enzym đều có cấu trúc chuỗi polipeptid xương sống (backbone) gần như giống hệt nhau. Cấu trúc ống của kênh enzym trong nhóm I được đặc trưng bởi hai phenylalanin tạo ra một dạng xếp chồng π (π-stacking), và vị trí phối hợp với ion kẽm được bảo tồn cao ở tất cả các enzym trong nhóm I. Bề mặt ngoài của HDAC8 có sự khác biệt lớn so với HDAC1, HDAC2 và HDAC3, với các amino acid khác biệt quan trọng là Lys33, Ile34, Tyr100, Pro205, Pro273, Met274 và Ser276. Cụ thể, Tyr204/209 ở HDAC1/HDAC2 được thay thế bằng Phe199/207 ở HDAC3/HDAC8. Việc mất đi nhóm hydroxyl ở vị trí này có thể tạo nên sự chọn lọc giữa các đồng phân nhưng đặc điểm này cũng có thể bị che khuất bởi các amino acid khác. Sự hiện diện thêm của Gly206 và tiếp theo đó là Pro205 ở vị trí của Asn203/208 ở HDAC1/HDAC2 và Asp197 ở HDAC3. Một sự khác biệt quan trọng nữa là Lys 33 ở HDAC8 thay thế His33 ở HDAC1, HDAC2, HDAC3 và 5 Tyr100 thay thế cho Glu98/104 của HDAC1/HDAC2 và Asp93 của HDAC3. Ở vị trí đầu vào của kênh enzym, sự thay đổi của HDAC8 là Ile34 và Pro273 và Met274 thay thế cho lần lượt là Pro, Arg và Leu ở HDAC1, HDAC2, HDAC3. Phân tử Tyr100 ở HDAC8 tạo nên một đường viền nhỏ hơn so với các enzym còn lại. Hình biểu trung tâm hoạt động (Hình 1.4) giúp làm nổi bật hơn sự khác biệt về hình học giữa các enzym, yếu tố có thể tạo nên tính chọn lọc [125]. Hình 1.4: Hình ảnh bề mặt của các HDAC1, 2, 3 và 8 Nghiên cứu về khoang phụ của các HDAC nhóm I bằng các đột biến gây ra trên HDAC1 hướng về vùng cấu trúc khoang phụ nhằm tìm hiểu rõ hơn về cách thức di chuyển của phân tử acid acetic [153]. Danh sách các amino acid tạo nên khoang phụ của các enzym nhóm I được công bố trước, sau đó các amino acid tương ứng của các enzym nhóm II và IV cũng được trình bày (mặc dù ở hai nhóm enzym này không có khoang phụ). Thay thế những amino acid quan trọng của vùng này có thể dẫn đến sự giảm đáng kể hoạt tính xúc tác. Những amino acid có vai trò then chốt có thể kể đến Tyr23, Tyr24, Arg34, Cys 151 và đặc biệt là Tyr303 ở HDAC1. Thêm vào đó, Val19, Met30, Ile35, Phe109 và Leu139 là những amino acid quyết định hình dạng của khoang phụ chứa ion acetat. Những đột biến của alanin làm giảm hoạt tính xúc tác mặc dù các alanin không tham gia trực tiếp vào quá trình gắn ion acetat. Nhìn chung, những nghiên cứu về khoang phụ cũng gợi ý rằng những chất ức chế có nhóm chức tương đương acetat có thể gắn vào khoang phụ sẽ có khả năng tăng tính chọn lọc. 1.1.3.2. HDAC nhóm II HDAC nhóm II là các enzym có nhiều ở mô và có liên quan đến quá trình biệt hoá cũng như phát triển của mô như mô xương, tim, cơ trơn, hệ miễn dịch, hệ mạch, 6 não thông qua tác dụng ức chế phiên mã [106]. Nhóm II được chia thành hai phân nhóm nhỏ hơn là phân nhóm IIa gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9 và phân nhóm IIb gồm HDAC6, HDAC10. Các HDAC nhóm IIa tạo thành một domain deacetylase vĩnh viễn chứa một đầu N được bảo tồn cao tương đồng với HDAC1 của nấm mem. Domain này điều chỉnh liên kết ADN thông qua vận chuyển nhân và tế bào chất. Quá trình phos phoryl hoá phụ thuộc tín hiệu của serin điều chỉnh vùng chứa đầu N tận cùng quyết định liệu các HDAC IIa sẽ ở lại hay rời nhân tế bào và quyết định khả năng trở thành đồng yếu tố ức chế phiên mã ở trong nhân. HDAC4 ức chế RunX2 và điều chỉnh quá trình cứng hoá và phình to của mô xương [141]. HDAC9 ở chuột bị gây đột biến gen cho thấy sự nhạy cảm với các tín hiệu stress dẫn đến phì đại cơ tim. Điều đó chứng tỏ vai trò của HDAC9 trong quá trình biệt hoá cơ tim [103]. Trong tế bào tiền tạo máu, HDAC7 có liên quan đến quá trình điều chỉnh sự chết theo chương trình. Enzym này thúc đẩy quá trình phiên mã MEF2D và ức chế thụ thể Nur77. Mặc dù, mức độ HDAC5 rất thấp trong tuyến ức ở người, nhưng enzym này rất quan trọng cho quá trình kìm chế Nur77. Trong tế bào nội mô, HDAC5 kìm chế FGF2 và Slit2, những gen chịu trách nhiệm cho quá trình tạo mạch [32]. Phân nhóm IIb bao gồm HDAC6 và HDAC10, hai enzym có sự tương đồng cao về mặt cấu trúc, đặc biệt là trung tâm hoạt động (Hình 1.5). HDAC6 có hai vùng xúc tác có tương tác với nhau và cả hai vùng này đều hướng ra mặt ngoài của protein và luôn sẵn sàng để tương tác với cơ chất. Vùng xúc tác thứ hai CD2 của HDAC6 không thể thiếu cho các chức năng phụ thuộc enzym của HDAC6, vùng xúc tác thứ nhất CD1 liên quan đến những hoạt động xúc tác của enzym. CD1 của HDAC6 tham gia vào xúc tác loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở đầu N của cơ chất, trong khi đó CD2 chủ yếu tham gia vào deacetyl hoá α-tubulin [101]. Hình 1.5: Cấu trúc vùng trung tâm hoạt động của HDAC6 và HDAC10 7 Mặc dù không chỉ giới hạn hoạt động trong nhân, HDAC10 có ít liên quan đến sự chết tế bào theo chu trình hơn HDAC6. HDAC10 cũng có vùng deacetyl thứ hai liên kết với những cơ chất khác nhưng chưa được xác định chính xác. HDAC10 điều chỉnh sự thoái hoá thụ thể của yếu tố tăng trưởng mạch nội mô (VEGFR) bởi các proteas om thông qua acetyl hoá và deacetyl hoá HSP-90 [75]. Nhóm II hiện có 3 enzym đã được nghiên cứu cấu trúc kết tinh gồm HDAC4, HDAC7 và HDAC6. So sánh các cấu trúc này cho thấy vùng trung tâm hoạt động của các enzym có cấu hình tương đối giống nhau, sự khác biệt được ghi nhận khi quan sát bên ngoài kênh enzym chứa ion kẽm. HDAC4 và HDAC7 giống nhau về trình tự amino acid xung quanh trung tâm hoạt động hơn so với HDAC6. Đặc biệt amino acid có nhiệm vụ cho proton liên quan đến cơ chế thuỷ phân là Tyr293 ở HDAC6 được thay thế bởi histidin tương ứng ở HDAC4 và 7. Một khác biệt đáng chú ý khác là sự có mặt của Gly290 ở HDAC6 thay cho Glu329/840 ở HDAC4/HDAC7. Thêm vào đó, HDAC4 và HDAC7 có mặt ion kẽm thứ hai, không xuất hiện trong cấu trúc của HDAC6 [125]. 1.1.3.3. HDAC nhóm IV Không có nhiều nghiên cứu công bố về vai trò của HDAC11 trong bệnh ung thư. HDAC11 hiện nay được biết đến nhiều trong bệnh u lympho Hodgkin [13]. Nồng độ cao HDAC11 được tìm thấy ở khối u thần kinh mạn tính [135]. 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLAS E Cấu trúc của các chất ức chế HDAC thường có 3 phần chính gồm: nhóm nhận diện bề mặt, vùng cầu nối và nhóm gắn kẽm (Hình 1.6). Một số chất có thể có thêm đơn vị kết nối nằm giữa nhóm nhận diện bề mặt và vùng cầu nối. Hình 1.6: Cấu trúc 3 phần chính của các chất ức chế HDAC 8