Tài liệu Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng vi khuẩn ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lê Thị Thanh Thủy NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN Ralstonia solanacearum GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 (DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học : 1. TS. Lê Nhƣ Kiểu 2. PGS. TS. Lại Thúy Hiền Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia Hà Nội chấm luận án tiến sĩ họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Vào hồi……giờ…….ngày……..tháng.…..năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm thông tin – Thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội 2 Mở đầu 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh hại cây trồng đã gây thiệt hại đáng kể trong sản xuất và bảo quản nông sản. Trong đó, phải kể đến bệnh héo xanh (Bacterial wilt disease) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum (HXVK) gây ra, bệnh này được coi là một trong năm loại bệnh cây trồng thuộc đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nước thuộc cộng đồng châu Âu. Trước tình hình đó, đã có nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật cũng như áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các chế phẩm vi sinh, phân hữu cơ vi sinh chứa các chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế và làm giảm tính độc của R. solanacearum. Tuy nhiên, các biện pháp vẫn còn hạn chế là: khả năng giảm tỉ lệ bệnh còn thấp, thời gian bảo quản chế phẩm ngắn, hiệu quả chưa cao nên chưa đáp ứng nhu cầu của thực tiễn,...v...v... Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học để hạn chế vi khuẩn R. solanacearum không những không có hiệu quả mà còn gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sinh thái, chất lượng sản phẩm và sức khỏe cộng đồng. Do đó, việc thường xuyên phân lập các chủng vi khuẩn R. solanacearum mới, có tính độc cao từ ngoài đồng ruộng là rất cần thiết, vì những chủng này sẽ là đối tượng cho việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật vừa có khả năng đối kháng cao với chúng vừa cạnh tranh tốt với các vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh HXVK, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế cho người nông dân và xã hội là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng”. Lạc và ớt là 2 loại cây trồng có giá trị dinh dưỡng rất cao, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn cho xuất khẩu và phục vụ tiêu dùng trong nước. 1 Tuy nhiên, chúng thường bị bệnh HXVK ở mức độ cao, có lúc tới 3040%, có nơi không thể trồng được 2 loại cây này nữa, vì mầm bệnh tiềm tàng trong đất rất lớn và rất lâu. Trước tình hình thực tế trên, luận án sẽ đi sâu nghiên cứu bệnh HXVK ở cây lạc, ớt và phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng cũng như xác định cơ chế đối kháng với R. solanacearum để sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và ớt. 2. Mục tiêu của luận án Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn R. solanacearum để sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng trong phòng trừ bệnh HXVK cây ớt và lạc, giảm 70-75% bệnh, tăng năng suất 15%. Xác định được một số cơ chế đối kháng chính của vi sinh vật với vi khuẩn R. solanacearum. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Góp phần làm sáng tỏ mức độ đa dạng sinh học của quần thể R. solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng. Bổ sung một số chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao với R. solanacearum vào bộ sưu tập giống vi sinh vật nông nghiệp của Việt Nam. Cung cấp những luận cứ và cơ sở khoa học về hướng ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng chống bệnh héo xanh cây trồng nói chung, cây ớt và lạc nói riêng. Sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh HX trong phòng chống bệnh héo xanh cây ớt và lạc có hiệu quả cao, thân thiện với môi trường. 4. Đối tƣợng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn R. solanacearum, vi khuẩn đối kháng, cây ớt, cây lạc. Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và ớt, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum để sản xuất chế phẩm VKĐK. Địa điểm nghiên cứu: Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Thành phố Hà Nội, Nghệ An, Thanh Hóa. Thời gian nghiên cứu: 2010-2014. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đã phân lập và tuyển chọn mới được 2 chủng vi khuẩn B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 ức chế mạnh vi khuẩn R. solanacearum. 2 - Đã xác định được cơ chế kháng vi khuẩn R. solanacearum là do 2 chủng vi khuẩn đối kháng tiết chất kháng sinh Phenazine, Iturin A và sinh siderophore làm giảm tính độc của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh. - Đã sản xuất được chế phẩm HX chứa 2 chủng vi khuẩn đối kháng trên nền chất mang là: than bùn + 5% rỉ đường + 1% bột vỏ tôm cua. Khi thử nghiệm trên đồng ruộng chế phẩm vi sinh HX đã hạn chế 89,82% bệnh héo xanh cây ớt và 89,39% bệnh héo xanh cây lạc. 6. Cấu trúc của luận án Luận án có 158 trang, gồm các phần: Mở đầu (3 trang); Chương I: Tổng quan tài liệu (41 trang); Chương II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu (20 trang); Chương III: Kết quả và thảo luận (70 trang); Kết luận và Kiến nghị (2 trang). Luận án có 205 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 33 và tiếng Anh 172 tài liệu), 48 bảng số liệu và 36 hình. CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình trồng ớt, lạc ở Việt Nam và trên Thế giới 1.1.1. Tình hình trồng ớt và lạc ở Việt Nam * Cây ớt: Ở Việt Nam ớt cay được trồng ở nhiều tỉnh thành trong cả nước, phổ biến nhất là Hải Dương, Hải Phòng, các tỉnh miền Trung, thành phố Hồ Chí Minh. Quảng Bình trồng khoảng 125,000 ha (năm 2011), Thái Bình trồng ớt 1,200.0 ha (năm 2012) [Tổng cục thống kê 2011]. * Cây lạc: Lạc là một mặt hàng có kim ngạch xuất khẩu khá lớn. Hàng năm, Việt Nam xuất khẩu 100,000.0-135,000.0 tấn lạc (đạt khoảng 65-120 triệu USD) [Niên giám thống kê tỉnh Nghệ An, 01/11/2012]. 1.1.2. Tình hình trồng ớt và lạc trên Thế giới * Cây ớt: Diện tích trồng ớt cay trên thế giới khoảng 1,25 triệu ha, tổng sản lượng 11,25 triệu tấn. Một số nước có nhu cầu nhập khẩu ớt lớn để phục vụ cho công nghiệp chế biến như Thái Lan, Hông Kông, Đài Loan, Nga, Trung Quốc… * Cây lạc: Lạc được trồng ở tất cả các châu lục với hơn 100 nước trên thế giới, với tổng diện tích ít biến động ở các vụ trong năm. Năm 2009, diện tích trồng lạc trên thế giới khoảng 23,95 triệu ha, năng suất trung bình. đạt 15,2 tạ/ha và sản lượng đạt 36,45 triệu tấn/năm [FAOSTAT, 2011]. 3 1.2. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1.2.1. Vi khuẩn R. solanacearum Tế bào loài R. solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu, thường ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi. Tuy có sự dao động đáng kể nhưng kích thước của chúng khoảng 0,5 – 0,7 µm  1,5 - 2,0 µm [Stevention, W R. và cs., 2001]. Hầu như chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thường nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng. Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [Mehan V. K., và Liao B, S., 1994]. 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R. solanacearum R. solanacearum là loại vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử, có thể sinh trưởng trên nhiều loại môi trường khác nhau. 1.2.3. Các hình thức xâm nhập của R. solanacearum vào cây chủ R. solanacearum tấn công trước tiên là các mô mềm (nhu mô), hoặc thông qua côn trùng như: ong, kiến... hoặc các loại sâu gây hại khác .v..v... có mang R. solanacearum, chúng chích vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào cây chủ, hình thức này có thể là rất phổ biến và lan truyền nhanh [Li .W. R và cs., 1981]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của vi khuẩn R. solanacearum: Bao gồm: Nhiệt độ không khí; Nhiệt độ đất; Độ ẩm đất; Ảnh hưởng của các loại đất. 1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK ở Việt Nam và trên Thế giới 1.3.1. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Bệnh HXVK là một trong những bệnh thực vật quan trọng nhất và được E.F. Smith mô tả lần đầu tiên năm 1896 trên khoai tây, cà chua và cây cà, nhiều khi xuất hiện trên cây thuốc lá [Smith EF., 1908]. Khi bị xâm nhiễm bởi R. solanacearum sau một thời gian (phụ thuộc vào điều kiện môi trường) cây chủ bắt đầu bị héo toàn bộ cây và chết. 4 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK ở Việt Nam Sau năm 1945, công tác nghiên cứu bệnh cây ở Việt Nam ngày càng được quan tâm. Riêng bệnh do vi khuẩn R. solanacearum đã có nhiều cơ quan khoa học trong nước quan tâm. Đặc biệt như: Viện Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện KHKT Việt Nam (cũ), Viện Nghiên cứu Rau Quả, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa. Nhìn chung, những nghiên cứu về bệnh héo xanh do R. solanacearum ở Việt Nam còn chưa nhiều, chưa toàn diện và chưa sâu. Hiện nay, việc nghiên cứu R. solanacearum cũng đã trở thành một vấn đề quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK trên Thế giới Năm 1892, Halsted là người khởi đầu nghiên cứu bệnh héo xanh cây cà chua. Năm 1896, E.F. Smith đã mô tả bệnh HXVK ở khoai tây, cà chua và cà tím, năm 1909 ông lại phát hiện thấy bệnh này ở thuốc lá. Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn R. solanacearum, chúng ta phải kể đến các công trình nghiên cứu của các tác giả: Buddenhagen và Kelman, 1964; Hayward, 1994; Ayami và cs., 2003; Kiba và cs., 2003; Zhao và cs, 2011; Huang và cs., 2012; Cheng và cs., 2012; Y.B.Hong và cs., 2013; Q.Y Xue và cs., 2013; X. Wang, 2013. Tất cả các nghiên cứu đều tập trung vào vi khuẩn R. solanacearum và các biện pháp phòng trừ, trong đó sử dụng vi sinh vật đối kháng cũng là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa khoa học quan tâm. Năm 2012, Scholarly Brief đã xuất bản cuốn sách “Những tiến bộ trong nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Ralstonia solanacearum”, năm 2013 Scholarly Paper đã tái bản và bổ sung thêm các nghiên cứu mới vào cuốn sách. Điều này càng nói lên tầm quan trọng của việc nghiên cứu sâu và rộng về vi khuẩn R. solanacearum trên Thế giới. 1.4. Vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng 1.4.1. Vi sinh vật đối kháng Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng thường được gọi là vi sinh vật đối kháng. Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ 5 thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học. Biện pháp này được cho là một phương pháp quản lý bệnh cây trồng trực tiếp, bằng cách sử dụng các thành phần trong hệ sinh thái để giúp cây trồng chống lại những tác nhân gây bệnh, nó là chìa khóa để tạo một nền nông nghiệp bền vững [Azcon-Augiler và Barea., 1996]. 1.4.1.1. Vai trò của vi khuẩn đối kháng Các loài vi khuẩn đối kháng luôn tồn tại trong tự nhiên, đa số trong chúng đều có lợi cho con người. Đối với nông nghiệp những vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh trong đất. Trong quá trình sinh trưởng chúng tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều hòa sinh trưởng, acid, ..v...v... Những chất này rất có lợi cho sự phát triển của cây trồng như: kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây trồng, kích thích sinh trưởng cây, hòa tan dinh dưỡng trong đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để cây trồng hấp thụ được,..v...v... 1.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật Trong môi trường tự nhiên, quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: môi trường; tính đặc hiệu; Mối quan hệ giữa mật độ nhiễm vào của vi sinh vật đối kháng và mật độ của vsv gây bệnh; Sự hấp thụ, tính hoạt động và không hoạt động của những chất kháng sinh cũng phụ thuộc vào độ pH của đất. 1.4.2. Cơ chế đối kháng của vi sinh vật 1.4.2.1. Cơ chế do kháng sinh Kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong quá trình sinh trưởng của VSV để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúp cây trồng phát triển. Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu. 1.4.2.2. Cơ chế do siderophore Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore ...v...v... để sinh trưởng. 6 6 Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe+3 trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vsv, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ không sinh trưởng được. 1.4.2.3. Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng) Tác dụng của vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật: Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Bacteria – PGPB) là vi khuẩn vùng rễ khi tương tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nấm và virut gây bệnh. Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng hệ thống - ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng hệ thống có điều kiện - SAR (Systemic Acquired Resistance) [Ryu, C. M. và cs., 2004]. PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) là các vi khuẩn sống xung quanh vùng rễ cây, dễ hình thành khuẩn lạc, nhân lên với số lượng lớn và ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp giúp cây ngăn cản những tác nhân gây bệnh thực vật, có khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh sắt thông qua thể mang sắt (siderophores), tạo ra kháng sinh hoặc tiết enzyme thủy phân tạo hệ thống đề kháng cho cây [Bhattacharyya P., D.K. Jha, 2012]. 1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng 1.5.1. Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở Việt Nam Các nghiên cứu về vsv đối kháng ở Việt Nam phải kể đến: Nguyễn Hoàng Chiến và cộng sự (2001), Đào Đức Thức, (2001); Phạm Văn Ty và cộng sự (2003), Phạm Văn Toản (2003), Phạm Thị Thuỳ và cộng sự (2003), Lê Như Kiểu và cộng sự (2002, 2004), Nguyễn Thị Hồng Hải và cộng sự (2006), Bùi Thị Việt Hà (2006), Đoàn Thị Thanh và cộng sự (2008), Lê Thị Thanh Thủy (2009), Đặng Thị Thùy Dương và cộng sự (2013), Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự (2013), Nguyễn Quốc Linh và cộng sự (2013), Võ Văn Phước Quệ 7 (2013), Đoàn Thị Kiều Tiên và cộng sự (2013), Chu Văn Chuông, Lê Lương Tề (2013)…v…v. 1.5.2. Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trên Thế giới Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX. Hiện nay có nhiều công trình nghiên cứu về sự đối kháng của vi sinh vật, phải kể đến các tác giả như: Zhengyu Huang và cs (2004), Rajesh Ramarathnam (2007); Wong JH và cs. (2008), Sarangi N.P.Athukorala, (2009), Kim P. (2010); Tanja B. (2012), Tanja Schacht và cs. (2012) và Abdlwareth A. Almoneafy và cs. (2012). 1.6. Những vấn đề cần nghiên cứu Phòng chống bệnh HXVK là vấn đề rất khó khăn. Hóa chất bảo vệ thực vật ít có tác dụng hạn chế bệnh này [Murakoshi và cs, 1984]. Các chế phẩm kháng sinh được coi là biện pháp có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng [Wang, 1982]. Hiệu quả phòng chống bệnh HXVK của nhiều chế phẩm vi sinh còn nhiều hạn chế. Đặc biệt, để phòng bệnh HXVK cây ớt và lạc thì đến nay chưa có một loại chế phẩm sinh học nào ổn định và có hiệu quả cao. Hơn nữa, các nghiên cứu về cơ chế đối kháng R. solanacearum hầu như chưa được đề cập và còn bỏ ngỏ. Để hiểu sâu bản chất tính đối kháng của vi sinh vật (cơ chế đối kháng), chúng tôi sẽ đi sâu nghiên cứu cơ chế đối kháng R. solanacearum của các chủng vi khuẩn lựa chọn, đây là việc làm rất cần thiết. Kết quả sẽ trả lời được một số cơ chế đối kháng chính với R. solanacearum của vi sinh vật. CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu: Mẫu cây lạc và ớt bị bệnh héo xanh, mẫu đất và cây lạc, ớt ở vùng không bị/hoặc ít bị bệnh héo xanh, chủng vi khuẩn R. 8 solanacearum Pss4 chuẩn, giống lạc L14 và giống ớt cay LN57, ớt cay Hàn Quốc. 2.1.2. Hoá chất và các thiết bị: Dụng cụ, máy móc, hoá chất, thiết bị (có nguồn gốc từ Mỹ, Đức, Nhật Bản, Úc, Pháp, Đài Loan, Trung Quốc... Việt Nam) của Bộ môn Vi sinh vật, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa. 2.1.3. Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường MPA; King B; PP (Pigment Production); SPA; PDA; Môi trường SX1(g/l): đậu trắng 100g; K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,5g; (NH4)2SO4 1,0g; CaCO3 1,0g; Glucose 5,0g; nước cất 1 lít; pH 7,0; Môi trường SX2 (g/l): Rỉ đường 10g; đậu 50g; CaCO3 1,0g; Cao nấm men 5,0g; nước cất 1000ml; pH 7,0; Môi trường SX3 (g/l): Rỉ đường 10g; CaCO3 1,0g; Bột nấm men 5,0g; (NH4)2SO4 1,0g; nước cất 1000ml; pH 7,0; Môi trường SX4 (g/l): MgSO4 20g; CaCO3 1,0g; Cao nấm men 10,0g; (NH4)2SO4 5,0g; CaCO3 1,0g; nước cất 1000ml ; pH 7,0; Môi trường thạch-chitin (g/l): chitin 1g; thạch 12g; nước cất 1000ml; TTC; Môi trường 523: MgSO4.7H2O (6,25%) 5 ml; K2HPO4 12,5%) 16,3 ml; yeast extract 4g; casein hydrolyzat 8g; sucaroza 10g; agar 18g; nước cất 1 lít. 2.2. Nội dung nghiên cứu Khảo sát tình hình bệnh héo xanh ớt và lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam; Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum; Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn đối kháng HX; Đánh giá hiệu quả của chế phẩm HX trên cây ớt và lạc. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp đánh giá tình hình bệnh héo xanh ớt và lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam: Theo Cục Bảo vệ thực vật, 1987; TCCS 58: 2013/BVTV. 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây ớt và lạc: Theo Hamidah S., và Lum K. Y., 1993. Phương pháp đánh giá sự khác nhau giữa 02 chủng LH3 (gây bệnh héo xanh trên lạc) và YH3 (gây bệnh héo xanh trên ớt) bằng cách phân nhóm biovar. 2.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu VKĐK với R. solanacearum 9 2.3.3.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn VKĐK R. solanacearum (chủng LH3 và YH3) theo Geels và Schippers, 1983. 2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng ĐKB1 và ĐKP1: Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) bằng phương pháp Salkowski cải tiến [Misra và Kaushik., 1989], Xác định khả năng phân giải chitin bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch-chitin. Xác định hoạt tính đối kháng với vi khuẩn R. solanacearum: Theo Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1975); Nguyễn Thành Đạt (1999), 10TCN 714 - 2006. Phương pháp tách Iturin A theo Hung-Yuh Lin, Yerra Koteswara Rao, Wen-Shi Wu và Yew-Min Tzeng (2007). Phương pháp tách Phenazine theo Kumaresan kavitha và cs. (2005); Phương pháp nghiên cứu cơ chế sinh siderophore theo Adriane M. F. Milagres và cs. (1999). 2.3.3.3. Phân loại chủng ĐKB1 và ĐKP1: Phân loại vi khuẩn đối kháng bằng hình thái, KIT sinh hóa và sinh học phân tử. 2.3.3.4. Đánh giá an toàn sinh học (trên chuột bạch) theo phương pháp LD50 của WHO. 2.3.3.5. Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc (trong nhà lưới) của chủng ĐKB1 và ĐKP1.Thí nghiệm được thiết lập trong nhà lưới với 8 công thức, lặp 4 lần. Cây lạc/ớt được trồng trong các vại đất (7kg/vại). Mỗi vại trồng 02 cây ớt/lạc. CT1: Đối chứng (không nhiễm VSV); CT2: Đối chứng 2 (Nhiễm R. solanacearum); CT3: Nhiễm chủng ĐKB1; CT4: Nhiễm chủng ĐKP1; CT5: Nhiễm hỗn hợp chủng ĐKP1 và ĐKB1; CT6: Nhiễm R. solanacearum + ĐKB1; CT7: Nhiễm R. solanacearum + ĐKP1; CT8: Nhiễm R. solanacearum +ĐKB1 và ĐKP1. Đo chiều cao cây sau 40-50 ngày trồng và đếm số cây bị bệnh, tính % cây bệnh. 2.3.3.6. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng ĐKB1 và ĐKP1 2.3.4. Phƣơng pháp sản xuất chế phẩm VKĐK HX: Phương pháp đánh giá khả năng tương tác giữa 2 chủng vi khuẩn; Phương pháp xác định các điều kiện phù hợp trong nhân sinh khối các chủng 10 vi khuẩn. Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân sinh khối; Xác định pH thích hợp; Xác định nhiệt độ phù hợp; Xác định lượng khí cung c p phù hợp; Xác định tốc độ khu y phù hợp; Xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp; Xác định tỷ lệ giống c p 2 thích hợp; Phương pháp nghiên cứu tạo ch t mang; Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xu t chế phẩm. 2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của chế phẩm HX trên cây ớt và lạc: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm HX trên cây ớt và lạc ở thí nghiệm ngoài đồng ruộng: Thí nghiệm được thiết kế trên diện tích 2,000 m2, chia thành 2 lô (Lô 1: đối chứng - không bổ sung chế phẩm HX; Lô 2 - bổ sung chế phẩm HX). Đánh giá hiệu quả của chế phẩm HX trên cây ớt và lạc trên mô hình ngoài đồng ruộng: Mô hình được xây dựng trên diện tích 10,000 m2; trong đó 5,000 m2 đối chứng (gieo trồng theo nông dân); 5,000 m2 thí nghiệm (có bổ sung chế phẩm HX). 2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo chương trình Excel 2003 và IRRISTAT 4.0. CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình bệnh héo xanh ớt và lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam 3.1.1. Bệnh héo xanh ớt ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam: Tỉ lệ bệnh trung bình trong khoảng 19 - 30%, có nơi có thể là 50 - 60%, giảm năng suất từ 50 đến 60%. 3.1.2. Tình hình bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam: Tỉ lệ bệnh trung bình trong khoảng 10 – 23%, đặc biệt có nơi rất cao khoảng 60 – 63%. 3.1.3. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và ớt:: Đã phân lập được chủng R. solanacearum ký hiệu YH3 có độc tính cao từ cây ớt và LH3 từ các mẫu bệnh lạc. 11 Cả 2 chủng YH3 và LH3 đều có hình thái khuẩn lạc giống với chủng R. solanacearum chuẩn (chủng Pss4). Kết quả này cũng trùng với báo cáo của một số tác giả khi nghiên cứu và mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum [Li W. R., và cs., 1981; Mehan V.K. và cs., 1994]. Kết quả xác định biovar cho thấy, chủng LH3 thuộc biovar 3, chủng YH3 thuộc biovar 1. Kết quả này cũng đã được các tác giả báo cáo trước đây [Nguyễn Xuân Hồng và cs, 1997]. Như vậy, 2 chủng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và ớt là thuộc 2 biovar, điều này chứng tỏ 2 chủng vi khuẩn trên là khác nhau. 3.2. Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum 3.2.1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 3.2.1.1. Phân lập, lựa chọn vi khuẩn đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây ớt: Đã phân lập được chủng ĐKB1 có đường kính vòng ức chế R. solanacearum đạt 15 mm, kể cả khi mật độ tế bào giữa chúng và vi khuẩn R. solanacearum-YH3 là 1:100, hoạt lực đối kháng của chủng này rất ổn định trong các lần thí nghiệm tiếp theo. 3.2.1.2. Phân lập, lựa chọn các chủng vi khuẩn đối kháng bệnh héo xanh cây lạc: Đã phân lập được chủng ĐKP1 có đường kính vòng ức chế R. solanacearum lớn nhất là 16 mm, kể cả khi mật độ tế bào giữa chúng và R. solanacearum-LH3 là 1:100, hoạt lực đối kháng ổn định trong thời gian dài. 3.2.1.3. Khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc trong nhà lưới của chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1. Sử dụng hỗn hợp 02 chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1 đã giảm 87,5% bệnh héo xanh ớt, các kết quả này tương tự với nghiên cứu của Nguyen M.T. và cs. (2010) khi đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn đối kháng chi Bacillus đến khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn do R. solanacearum gây ra trên cây ớt. 12 Kết quả thí nghiệm trên cây lạc cho thấy, hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1 đã có ảnh hưởng tốt đến sinh trưởng, phát triển cây lạc và giảm 87,5% bệnh héo xanh so với đối chứng (chỉ nhiễm vi khuẩn R. solanacearum). Các kết quả nghiên cứu trên tương tự với kết quả của Henok và cs., 2007. 3.2.2. Đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn Để đơn giản trong sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng, việc lựa chọn chủng vi sinh vật là rất quan trọng, ngoài các điều kiện nhân sinh khối nhanh thì số lượng chủng sử dụng càng ít càng tốt. Trên cơ sở đó, các thí nghiệm nhằm xác định chủng vi khuẩn ĐKP1 kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc liệu có kháng được vi khuẩn gây bệnh héo xanh ớt hay không và ngược lại (đối với chủng vi khuẩn ĐKB1) đã được tiến hành. Kết quả cho thấy, cả 2 chủng ĐKB1 và ĐKP1 đều có khả năng kháng vi khuẩn R. solanacerum gây bệnh trên lạc và ớt. Kích thước vòng ức chế trung bình trong khoảng 12 - 16 mm. Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc của hỗn hợp vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1 tốt hơn so với đơn chủng và cũng đã được xác định trong các thí nghiệm trên (mục 3.2.1.3.). Ngoài ra, hai chủng vi khuẩn đối kháng lựa chọn ĐKB1 và ĐKP1 có nhiều hoạt tính sinh học quí như khả năng sinh siderophore, phân giải kitin và sinh ch t kích thích sinh trưởng. Đây là 2 chủng vi khuẩn có tiềm năng để sản xu t chế phẩm vi sinh ứng dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và ớt do vi khuẩn R. solanacearum gây ra. 3.2.3. Phân loại vi khuẩn đối kháng 3.2.3.1. Sử dụng kit API 50 CHB và API 20 NE: Cho thấy, chủng ĐKB1 thuộc Bacillus subtilis với độ tương đồng 99%, chủng ĐKP1 thuộc Pseudomonas fluorescens với độ tương đồng 100%. 3.2.3.2. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử: Kết quả cho thấy, chủng ĐKB1 có độ tương đồng cao (99%) với loài Bacillus subtilis và chủng ĐKP1 có độ tương đồng cao (100%) với loài Pseudomonas fluorescens. Trình tự gen 16S rARN của chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 đã được gửi 13 đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) và đang chờ mã số đăng ký. 3.2.4. Đánh giá an toàn sinh học của vi khuẩn đối kháng 3.2.4.1. Xác định độc tính của vi khuẩn đối kháng bằng danh mục an toàn sinh học của vi sinh vật: Hai chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 đều thuộc nhóm an toàn cấp 1. 3.2.4.2. Xác định độc tính của vi khuẩn đối kháng trên chuột bạch Bổ sung dịch vi khuẩn đối kháng tương ứng với các nồng độ 2.107; 2.108 và 2.109 cfu/g thức ăn cho chuột. Theo dõi 24 giờ, kết quả cho thấy tất cả số chuột thí nghiệm đều phát triển bình thường không có hiện tượng ngộ độc cấp tính xảy ra. Như vậy, 2 chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 đều có đủ điều kiện để sản xu t chế phẩm vi sinh đối kháng. 3.2.5. Khả năng tổng hợp kháng sinh của các chủng VK tuyển chọn Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu trong và ngoài nước, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tập chung nghiên cứu sâu về cơ chế mang tính chất đặc trưng và cơ bản của vi sinh vật đối kháng đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm, đó là: Cơ chế do kháng sinh. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, một số loại vi sinh vật có khả năng kháng cao với vi sinh vật gây bệnh do có khả năng sinh kháng sinh. Tuy nhiên đến thời điểm hiện tại có r t ít nghiên cứu chứng minh điều này trên vi sinh vật của Việt Nam. Theo các tài liệu nghiên cứu, các chủng vi khuẩn lựa chọn thuộc chi Pseudomonas và Bacillus thường sinh ra các chất kháng sinh như: Phenazin và Iturin A. Vấn đề đặt ra ở đây là, liệu trong dung dịch nhân sinh khối của các chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 có 2 chất kháng sinh là phenazine và iturin A hay không ? Đây là câu hỏi lâu nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu và câu trả lời chính xác, do đó chúng tôi đã tiến hành một số thí nghiệm trên B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 để tìm hiểu cũng như trả lời câu hỏi nêu trên. 14 3.2.5.1. Xác định phenazine bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy: trong dịch nhân sinh khối của chủng vi khuẩn P. fluorescens ĐKP1 có chất kháng sinh phenazine, chất này có tác dụng diệt khuẩn cao và kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của Thomashow (1990) và Kyoung-Ja Kim (2000). Tuy nhiên, để khẳng định phenazine trong dịch nhân sinh khối của chủng P. fluorescens ĐKP1, bản gen đã chạy TLC được tách chiết ngược lại và đánh giá khả năng ức chế R. solanacearm trên đĩa thạch. Hình 3.17. Ảnh chụp TLC mẫu phenazine dịch nhân sinh khối (1) và phenazine chuẩn (2) Kết quả cho thấy, vùng ức chế của phenazine đối với R. solanacearm rất điển hình. Kết quả này một phần đã trả lời được câu hỏi nêu trên. Kết quả trên giống với nghiên cứu của Nansathit (2009) về khả năng ức chế vi khuẩn R. solanacearum của phenazine - 1- carboxylic acid sinh ra từ vi khuẩn Pseudomonas. 3.2.5.2. Xác định Iturin A bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp (UPLC/MS/MS) cho th y: trong sinh khối vi khuẩn B. subtilis ĐKB1 có một hợp chất với thời gian lưu mẫu trong UPLC tương tự như iturin A chuẩn. Tuy nhiên, cũng như Phenazine, để khẳng định Iturin A trong dịch nhân sinh khối của chủng B. subtilis ĐKB1 có khả năng ức chế R. solanacearm hay không? IturinA cũng được tiến hành đánh giá khả năng ức chế R. solanacearum trên đĩa thạch. Kết quả cho thấy, vùng ức chế rất điển hình. Kết quả này một phần đã trả lời IturinA đã ức chế được vi khuẩn R. solanacearm. 15 Nhận xét: Có thể khẳng định Phenazine và Iturin A đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sinh trưởng của R. solanacearm. Cả 2 ch t này đều có khả năng ức chế R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và ớt. Đây cũng là kết quả r t mới ở Việt Nam. Hướng nghiên cứu sử dụng kháng sinh từ vi sinh vật trong bảo vệ thực vật còn r t mới mẻ ở nước ta, trên cơ sở kết quả nghiên cứu này sẽ mở ra hướng có thể tách chiết Phenazine và Iturin A từ sinh khối vi sinh vật với khối lượng lớn để ứng dụng phòng bệnh cây trồng trong nông nghiệp. 3.3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng HX 3.3.1. Phối hợp các chủng vi khuẩn đối kháng 3.3.1.1. Đánh giá khả năng tồn tại cùng nhau trên môi trường của 2 chủng B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1: Kết quả cho thấy, khi nuôi cấy ở điều kiện hỗn hợp trên cùng môi trường dinh dưỡng thì 2 chủng đều sinh trưởng tốt cùng nhau, không kìm hãm lẫn nhau. Như vậy, có thể sử dụng 2 chủng trên để sản xu t chế phẩm sinh học trong cùng môi trường. 3.3.1.2. Đánh giá khả năng ức chế R. solanacearum của tổ hợp 2 chủng B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1. Kết quả cho thấy, hoạt lực đối kháng của hỗn hợp chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 cao hơn so với đơn chủng (đường kính vòng ức chế đạt 30 – 35 mm, trong khi đó đơn chủng chỉ đạt 14 - 16 mm). Sau 60, 90 ngày bảo quản, tuy có sự thay đổi về hoạt lực đối kháng so với thời điểm 30 ngày, nhưng không đáng kể. 16 Hình 3.27. Hoạt tính đối kháng R. solanacearum 2 chủng vi khuẩn B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 trong ch t mang sau 30 ngày nhiễm, trong điều kiện hỗn hợp chủng vi khuẩn (A) và đơn chủng vi khuẩn (B) Như vậy, trong điều kiện nuôi c y hỗn hợp thì các chủng vi khuẩn B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 đều tồn tại tốt cùng nhau và hoạt tính đối kháng tăng cao hơn so với nuôi c y đơn chủng. 3.3.2. Xác định điều kiện nhân sinh khối phù hợp của 2 chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 Bảng 3.29. Điều kiện phù hợp trong nhân sinh khối chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 TT 1 2 3 4 5 6 7 Điều kiện pH Nhiệt độ (0C) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Lượng cấp khí (lít không khí/lít môi trường/phút) Tỷ lệ giống cấp 2 (%) Môi trường Thời gian (giờ) Chủng vi khuẩn B. subtilis P. fluorescens ĐKB1 ĐKP1 7,0 7,0 30 30 300-350 300-350 0,75 0,75 1 SX3 36 1 SX3 30 Số liệu ở bảng 3.29 cho thấy, đã xác định được các điều kiện phù hợp trong nhân sinh khối hai chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1. 3.3.3. Nghiên cứu tạo chất mang Từ các nghiên cứu bổ sung bột vỏ tôm cua; rỉ đường; bột sắn vào than bùn để chọn chất mang sản xuất chế phẩm vi sinh. Kết quả cho thấy, than bùn bổ sung 5% rỉ đường và 1% bột vỏ tôm cua là chất mang phù hợp nhất cho sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng. 17 3.3.4. Sản xuất chế phẩm vi sinh HX 3.3.4.1. Xây dựng Quy trình sản xu t chế phẩm vi sinh HX phòng chống bệnh héo xanh cây lạc và ớt Trên cơ sở tổng hợp kết quả nghiên cứu về các chủng B. subtilis ĐKB1, P. fluorescens ĐKP1, lựa chọn chất mang và kế thừa quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh cây lạc và ớt, chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm vi sinh HX và đánh giá khả năng đối kháng R. solanacearum. Kết quả cho thấy, mật độ tế bào 2 chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 trong chế phẩm vi sinh HX sau 6 tháng bảo quản đều đạt 108 CFU/g và hoạt lực đối kháng của chế phẩm giảm không đáng kể (ĐK vòng ức chế đạt 24,6 mm). Hình 3.29. Nhãn bao bì chế phẩm vi sinh HX phòng bệnh héo xanh lạc và ớt 3.3.4.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng R. solanacearum của chế phẩm HX Hình 3.31. Hoạt lực đối kháng R. solanacearum của chế phẩm vi sinh HX sau 6 tháng bảo quản 3.4. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm HX trên cây ớt và lạc 18