Tài liệu Luận án tiến sĩ phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 02 01 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 02 01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GS. TS. HÀ THANH TOÀN PGS.TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG 2020 LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tôi đã nhận được sự hỗ trợ quý báu từ các đơn vị và cá nhân trong và ngoài Trường. Xin trân trọng gởi lời tri ân sâu sắc Quý Thầy, Cô, gia đình, người thân, đồng nghiệp và bạn bè! Đầu tiên, tôi xin trân trọng và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn chính Giáo sư Tiến sĩ Hà Thanh Toàn và Cô hướng dẫn phụ Phó Giáo sư Tiến sĩ Ngô Thị Phương Dung đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và hoàn thành luận án. Xin cảm ơn sâu sắc đến Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Văn Thành đã hướng dẫn giúp tôi hoàn thành chuyên đề chuyên môn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Công nghệ sinh học thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Khoa Sau Đại học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi được thực hiện chương trình Nghiên cứu sinh trong những năm qua. Xin cảm ơn đến Giáo sư Mamoru Yamada Trường Đại học Yamaguchi đã nhiệt tình giúp đỡ về điều kiện vật chất phòng thí nghiệm tại Nhật Bản cho nội dung giải trình tự DNA trong luận án. Kết quả của luận án cũng nhờ vào sự đóng góp không nhỏ của Tiến sĩ Huỳnh Xuân Phong, Thạc sĩ Nguyễn Ngọc Thạnh, Thạc sĩ Bùi Hoàng Đăng Long, cán bộ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, các em học viên cao học, sinh viên đại học ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ. Bên cạnh đó, trong thời gian vừa học tập vừa làm việc, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi của Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ thuật - Công nghệ Cần Thơ; sự chia sẻ, động viên của đồng nghiệp Khoa Công nghệ thực phẩm và Công nghệ sinh học. Xin gửi đến gia đình, chồng và các con, anh, chị, bạn bè và những người thân lòng biết ơn và những tình cảm yêu thương nhất về sự giúp đỡ, động viên, chia sẻ để tôi có thêm nghị lực hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn và sự kính yêu vô cùng đến Ba, Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng và giáo dục tôi bằng tất cả lòng yêu thương và luôn là điểm tựa tinh thần cho tôi phấn đấu để vượt qua mọi thử thách! Trân trọng, Đoàn Thị Kiều Tiên i TÓM TẮT Trái giác (Cayratia trifolia) chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng kháng oxy hóa, giảm sự tăng trưởng của khối u và được sử dụng làm dược liệu, là nguồn nguyên liệu tốt lên men rượu vang, một sản phẩm rất phổ biến hiện nay. Ngày nay trái giác đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới về thành phần cũng như hoạt tính của nó, tuy nhiên ở Việt Nam các nghiên cứu về trái giác vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tìm ra nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men rượu vang trái giác. Kết quả phân tích 53 mẫu trái giác được thu ở 13 tỉnh/thành phố thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy trái giác chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mg đương lượng acid gallic trong 1 mL (GAE/mL) và khả năng kháng oxy hóa từ 16,6 đến 82,86%, hàm lượng đường tổng trong trái giác từ 0,41 đến 2,17 g/100 mL, hàm lượng đường khử từ 0,22 đến 0,96 mg/100 mL. Từ 53 mẫu trái giác thu ở 13 tỉnh đã phân lập được 151 chủng nấm men được phân loại sơ bộ thuộc bốn giống Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, và Cadida. Các chủng nấm men đều phát triển tốt mức nhiệt độ 30ºC đến 35oC, trong đó có 64/151 chủng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37ºC trong môi trường có nồng độ ethanol từ 9 đến 12% v/v. Dựa vào kết quả đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác ở 37ºC đã tuyển chọn được 30/64 chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt từ 37ºC đến 45ºC, có khả năng phát triển ở nồng độ ethanol trong môi trường từ 9 - 12% và lên men sinh ra ethanol đạt từ 6% (v/v). Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự DNA của 30 chủng nấm men chịu nhiệt được tuyển chọn, dựa trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) cùng với kết quả phân tích về hình thái, sinh lý và sinh hóa đã xác định 30 chủng nấm men thuộc bốn giống Saccharomyces, Candida, Pichia và Clavispora, trong đó Saccharomyces cerevisiae được tìm thấy khá phổ biến. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae HG1.3 có khả năng chịu nhiệt đến 43ºC, lên men rượu trái giác ở nhiệt độ 35ºC với pH ban đầu 4,5, 20 ºBrix và mật số chủng nấm men 105 tế bào/mL, sau 6 ngày lên men đạt hàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v). Sản phẩm rượu vang trái giác có chứa hàm lượng polyphenol 0,60 mg GAE/mL, có khả năng kháng oxy hóa là 57,3% và có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị. Từ khóa: khả năng kháng oxy hóa, nấm men chịu nhiệt, polyphenol, rượu vang, Saccharomyces cerevisiae, trái giác. ii ABSTRACT Cayratia trifolia (L.) Domin berry is a source of high biological activity compounds, having the antioxidant capacity, reducing the growth of tumors, and is used as a medicinal ingredient as well as a good source for alcoholic wine, a very popular product. Nowaday, in the world, Cayratia trifolia (L.) Domin has been studies chemical component and biological activity, however, in Vietnam, this studies are limited. The aim of this study was to isolate and to select the thermotolerant yeasts having the fermentation ability for the production of three-leaf cayratia wine. The analysis results of 53 samples of Cayratia trifolia berries collected in 13 cities and provinces in the Mekong Delta showed that the threeleaf Cayratia contained 0.47 to 1.54 mg equivalent gallic acid in 1 mL (GAE/mL), 16.6 to 82.86% antioxidant ability, and 0.41 to 2.17 mg/100 mL total sugar and 0.22 to 0.96/100 mL reducing sugar. From 53 threeleaf cayratia samples, 151 yeast strains were isolated and classified into 4 genera Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, and Candida. The yeast strains could grow on plates incubated at 30ºC and 35oC. Among them, 64/151 strains could grow at 37°C on plates supplemented with 9 to 12% (v/v) ethanol. Thirty over sixty-four strains could tolerate to the temperature at 37 to 45°C and could grow on plates added with 9 to 12% (v/v) ethanol. The produced ethanol content reached at least 6% (v/v) without optimization proccess. Based on the DNA sequencing, sequences of 30 strains of yeasts were classified and aligned with GenBank Database (NCBI). With the combination with morphological, physiological and biochemical properties, 30 yeast strains were identified to be belonged to 4 genera including Saccharomyces, Candida, Pichia and Clavispora, in which Saccharomyces cerevisiae accounted for the highest proportion. The results indicated that Saccharomyces cerevisiae strain HG1.3 could tolerate to 43°C, could ferment wine from Cayratia trifolia at 35°C, pH 4.5, 20°Brix with the initial inoculation density at 105 cell/mL. After a six-day fermentation, the ethanol content reached 11.68% (v/v) with the polyphenol content of produced wine at 0.60 mg GAE/mL and the antioxidant abilities at 57.3%. The produced wine had unique color, flavor and aroma. Keywords: antioxidant, Cayratia trifolia, polyphenol, Sacchoromyces cerevisiae, thermotolerance yeast, wine. iii iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... i TÓM TẮT ......................................................................................................... ii ABSTRACT ..................................................................................................... iii LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iv MỤC LỤC ........................................................................................................ v DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... viii DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ x CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... xii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ............................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài ............................................................................................. 2 1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 2 1.4 Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 3 1.5 Những điểm mới của luận án ....................................................................... 3 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 4 2.1 Rượu vang ................................................................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu về rượu vang ............................................................................ 4 2.1.2 Nguyên liệu làm rượu vang.......................................................................5 2.1.3 Hệ vi sinh vật trong lên men rượu vang ................................................... 6 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ........................................... 8 2.1.5 Rượu vang đối với sức khoe con người .................................................. 11 2.2 Nấm men .................................................................................................... 11 2.2.1 Đặc điểm của nấm men ........................................................................... 12 2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy .................................................................................. 13 2.2.3 Đặc tính lên men .................................................................................... 15 2.2.4 Nấm men chịu nhiệt ................................................................................ 15 2.3 Cây giác (Cayratia trifolia (L.) Domin) ................................................... 21 2.3.1 Phân loại khoa học .................................................................................. 21 2.3.2 Đặc tính và điều kiện tự nhiên ............................................................... 21 2.3.3 Thành phần hóa học ............................................................................... 22 2.3.4 Hoạt tính sinh học .................................................................................. 23 v 2.3.5 Công dụng của cây giác ......................................................................... 34 2.4 Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước............................................. 34 2.4.1 Thế giới ................................................................................................... 34 2.4.2 Trong nước ............................................................................................. 37 2.5 Một số khảo sát thực tế trong phạm vi nghiên cứu của luận án ............... 38 2.5.1 Sản lượng trái giác ở ĐBSCL ................................................................ 38 2.5.2 Thực tế sản xuất nấm men thương mại tại Công ty Saf - Viet .............. 40 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 42 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 42 3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 42 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ...................................................................... 44 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 45 3.2.1 Thu thập, đánh giá đặc điểm của trái giác .............................................. 46 3.2.2 Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ..................................................................... 50 3.2.3 Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt. ............. 56 3.2.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác ................................................................................................................... 59 3.3 Xử lý số liệu ............................................................................................... 61 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 62 4.1 Nội dung 1: Đặc điểm của trái giác ở ĐBSCL .......................................... 62 4.1.1 Đặc điểm hình dạng, kích thước ............................................................. 62 4.1.2 Đặc điểm các chỉ tiêu hóa lý của dịch trái giác ...................................... 63 4.1.3 Hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của trái giác……. 67 4.2 Nội dung 2: Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ........................................................ 72 4.2.1 Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên ................................. 72 4.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men .............. 74 4.2.3 Đặc điểm nảy chồi của các chủng nấm men phân lập ............................ 79 4.2.4 Đặc điểm hình thành bào tử của các chủng nấm men phân lập .............. 81 4.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập ............... 81 4.3 Nội dung 3: Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn, có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt ..86 vi 4.3.1 Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men ........................................ 86 4.3.2 Khả năng chịu ethanol của những chủng nấm men chịu nhiệt ......................................................................................................................... 88 4.3.3 Tuyển chọn những chủng nấm có khả năng lên men rượu vang ............ 90 4.3.4 Lên men rượu vang trái giác ................................................................... 97 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác .................................................................................................. 109 4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men và pH ................................. 109 4.4.2 Ảnh hưởng của mật số giống chủng, độ Brix và thời gian lên men đến quá trình lên men rượu vang trái giác ............................................................ 112 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................. 121 5.1 Kết luận .................................................................................................... 121 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................................ 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 126 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Phân loại khoa học của dây giác ....................................................... 4 Bảng 2.2. Một số vi sinh vật làm hỏng và giảm chất lượng rượu .................... 7 Bảng 2.3. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm, thức uống có cồn và sản phẩm lên men ........................................................... 15 Bảng 2.4. Những chủng nấm men được khảo sát có khả năng phát triển và sản sinh ethanol ở nhiệt độ 37ºC đến 45ºC ............................................................ 18 Bảng 2.5. Phân loại khoa học của cây giác ..................................................... 21 Bảng 2.6. Đặc điểm sản phẩm nấm men của công ty Saf - Viet .................... 40 Bảng 3.1. Địa điểm thu mẫu trái giác sử dụng trong phân lập nấm men ........ 42 Bảng 3.2. Thành phần môi trường YPD ......................................................... 45 Bảng 3.3. Thành phần môi trường YPD agar .................................................. 45 Bảng 3.4. Thành phần môi trường Chistensen urea broth ............................... 46 Bảng 3.5. Thành phần môi trường Gelatin ...................................................... 46 Bảng 4.1. Đặc điểm của 2 dạng trái giác ở vùng ĐBSCL ............................... 62 Bảng 4.2. pH, ºBrix, hàm lượng đường tổng, đường khử của dịch trái giác ... 63 Bảng 4.3. Hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của trái giác .. 67 Bảng 4.4. Khả năng khử gốc tự do của Vitamin C ở nồng độ 2-12 µg/mL .... 71 Bảng 4.5. Các chủng nấm men phân lập ở đợt 1 ............................................. 72 Bảng 4.6. Các chủng nấm men phân lập ở đợt 2 ............................................. 73 Bảng 4.7.Các chủng nấm men phân lập ở đợt 3 .............................................. 73 Bảng 4.8. Đặc điểm, hình thái của các chủng nấm men đại diện ở 7 nhóm .... 76 Bảng 4.9. Sự phân bố của hình thái của các chủng nấm men ......................... 78 Bảng 4.10. Kết quả phân loại sơ bộ 151 chủng nấm men dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................................... 82 Bảng 4.11. Tổng hợp số lượng các chủng nấm men phát triển ở các mức nhiệt độ...................................................................................................................... 87 Bảng 4.12. Tổng hợp khả năng phát triển của 141 chủng nấm men trong môi trường có nồng độ ethanol khác nhau .............................................................. 89 Bảng 4.13. Chiều cao cột khí trung bình (mm) trong chuông Durham khi lên men dịch glucose 2% ....................................................................................... 91 viii Bảng 4.14. Chiều cao cột khí trung bình (mm) trong chuông Durham khi lên men dịch trái giác ............................................................................................. 94 Bảng 4.15. Khả năng lên men rượu vang trái giác của các chủng nấm men ... 97 Bảng 4.16. Đặc điểm của 30 chủng nấm men ở 37°C ................................... 102 Bảng 4.17. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và kết quả giải tình tự ......104 Bảng 4.18. Kết quả xác định tên loài 30 chủng nấm men được tuyển chọn . 106 Bảng 4.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến quá trình lên men ............... 110 Bảng 4.20. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, oBrix và thời gian lên men 112 Bảng 4.21. Hàm lượng polyphenol và khả năng oxy hóa trước và sau khi lên men rượu vang trái giác ................................................................................. 117 Bảng 4.22. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu hóa học rượu trái giác .................. 118 Bảng 4.23. Đánh giá cảm quan rượu vang trái giác ......................................119 ix DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Các bào quan của tế bào nấm men Candida boidiniicell ................ 12 Hình 2.2: Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường ............ 14 Hình 2.3: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men .................... 35 Hình 2.4: Kluyveromyces marxianus ............................................................... 19 Hình 2.5: Saccharomyces cerevisiae ............................................................... 20 Hình 2.6: Candida albicans ............................................................................. 20 Hình 2.7: Trái, dây và hoa Cayratia trifolia .................................................... 21 Hình 2.8: Một số hợp chất hóa học trong dây giác: -sitosterol (1) ................ 24 Hình 2.9: Sự hình thành các gốc tự do ............................................................26 Hình 2.10: Tác dụng bảo vệ tế bào của polyphenol dưới tác dụng của gốc tự do...................................................................................................................... 27 Hình 2.11: Các hợp chất acid phenolic điển hình trong thực phẩm ................ 29 Hình 2.12: Các cấu trúc cơ bản của các flavonoid .......................................... 30 Hình 2.13: Các nhóm anthocyanidin chính ..................................................... 31 Hình 2.14: Cấu trúc hóa học kháng oxy hóa của terpenoid ............................. 32 Hình 2.15: Một số polyphenol quan trọng khác .............................................. 33 Hình 2.16: Thu gom trái giác chín ở ấp 4 xã Khánh Thuận ........................... 39 Hình 2.17: Trái giác được trồng ở huyện U Minh Thượng tỉnh Kiên Giang .. 39 Hình 2.18: Đoàn đến làm việc tại Công ty Saf-Viet ........................................ 40 Hình 3.1: Trái giác chín ................................................................................... 42 Hình 3.2: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng đường tổng số .............. 47 Hình 3.3: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng đường khử .................... 48 Hình 3.4: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số ...... 49 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình nuôi tăng sinh nấm men từ trái giác....................... 51 Hình 3.6: Sơ đồ quy trình cấy trãi mẫu nấm men ............................................ 52 Hình 3.7: Bố trí thí nghiệm khả năng lên men đường saccharose ................... 53 Hình 3.8: Khả năng phân giải urea của các chủng nấm men........................... 54 x Hình 3.9: Khả năng phân giải gelatine của những chủng nấm men ................ 55 Hình 3.10: Chu kỳ nhiệt PCR ......................................................................... 58 Hình 4.1: Hình dạng tế bào của 7 nhóm nấm men .......................................... 75 Hình 4.2: Hình thức nảy chồi của 7 nhóm nấm men ....................................... 80 Hình 4.3: Sự phát triển của các chủng nấm men ở các nhiệt độ khác nhau .... 87 Hình 4.4: Sự phát triển của một số chủng nấm men trong môi trường ........... 89 có nồng độ ethanol khác nhau ......................................................................... 89 Hình 4.5: Mối quan hệ phát sinh loài của 30 chủng nấm men ...................... 108 Hình 4.6: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa nồng độ đường và thời gian lên men đến quá trình lên men ................................................... 115 Hình 4.7: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa ngày và mật số giống chủng đến quá trình lên men dịch trái giác .......................................... 115 Hình 4.8: Biểu đồ cảm quan rượu trái giác, sản phẩm rượu trái giác ............ 120 xi CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine Diphosphate ATP Adenosine Triphosphate DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long QCVN Quy chuẩn Việt Nam RNA Acid ribonucleic QCVN Quy chuẩn Việt Nam YPD Yeast extract – Pepton – D-glucose GAE Acid gallic equivalent TPC Total pholyphenol content MIC nồng độ ức chế tối thiểu Glu Glucose Sac Saccharose Mal Maltose KG Kiên Giang AG An Giang ĐT Đồng Tháp BT Bến Tre TV Trà Vinh BL Bạc Liêu TG Tiền Giang LA Long An CM Cà Mau CT Cần Thơ VL Vĩnh Long HG Hậu Giang ST Sóc Trăng xii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Dây giác (Cayratia trifolia) là một loại dây leo thân gỗ mọc hoang dại trong trảng cỏ và rừng thưa ở các nước như Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanma, Indonesia, Malaysia. Ở Việt Nam dây giác mọc hoang dại dọc các hàng rào, bụi từ các tỉnh miền Trung đến các tỉnh miền Nam. Vùng ĐBSCL, dây giác có hầu hết ở tất cả các tỉnh, thành phố, đặc biệt dây giác là loài thực vật rất phong phú trên đất U Minh (Phạm Hoàng Hộ, 2000 và Võ Văn Chi, 2004) với sản lượng trái giác thu hoạch khoảng 70 đến 80 tấn mỗi mùa. Trái giác được dùng phổ biến như gia vị trong các món ăn vì hương vị đặc biệt và những tác dụng dược học của trái giác đối với cơ thể con người. Trên thế giới, những nghiên cứu cho thấy trong thành phần dây giác có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như phenolic acids, flavonoid, stilbenes, anthocyanidin,… (Tsao, 2010). Theo Gupta, 2007, các bộ phận dây giác có chứa dầu sáp màu vàng, steroids, terpenoids, flavonoid, tannins, stilbenes, acid hidrocyanic. Rượu vang có lịch sử hàng ngàn năm, được sản xuất đầu tiên ở các nước Châu Âu. Ngày nay, các sản phẩm rượu vang đã và đang được nghiên cứu để đa dạng hóa về chủng loại, cải tiến về chất lượng, năng suất lẫn quy mô nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Theo truyền thống, rượu vang được sản xuất từ nho chín, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để nâng cao hiệu quả lên men (Bùi Ái, 2005). Trong quá trình lên men rượu vang, một trong những yếu tố quan trọng nhất chính là nguồn nấm men. Đối với nấm men, nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình chuyển hóa đường thành ethanol (Lương Đức Phẩm, 2006). Hiện nay, nhiệt độ trái đất đang ấm dần lên do hiện tượng biến đổi khí hậu. Nhiệt độ tăng cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang cũng như cần phải tiêu tốn một phần năng lượng để giữ ổn định nhiệt độ cho các hệ thống lên men (Limtong et al., 2007; Yuangsaard et al., 2013). Vì vậy, việc lựa chọn nấm men chịu nhiệt để lên men rượu là một giải pháp hữu hiệu mang lại nhiều lợi ích đáng kể như tận dụng được nhiệt độ cao để lên men và giảm chi phí đầu tư cho thiết bị làm mát, từ đó tạo ra nhiều lợi ích kinh tế trong sản xuất (Roehr, 2001; Limtong et al., 2007). Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng nấm men cũng góp phần làm phong phú thêm sự hiểu biết về đa dạng sinh học vi sinh vật. Đồng thời, có thể 1 tiến tới việc sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất rượu vang. Như vậy, trái giác chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có hương vị và màu sắc đặc trưng nên có thể được sử dụng như nguồn nguyên liệu trong lên men rượu vang. Đồng thời, việc ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt mang lại hiệu quả cho quá trình lên men trong điều kiện trái đất đang ấm dần lên. Từ đó cho thấy đề tài phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở ĐBSCL được thực hiện như một yêu cầu cần thiết. 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung Cung cấp các dữ liệu về trái giác và đề xuất một giải pháp cho quá trình lên men rượu vang trái giác giúp giải quyết vấn đề ấm dần lên của trái đất do sự gia tăng nhiệt độ. Qua đó, người dân ở khu vực có thể vận dụng để thích nghi nhanh với sự biến đổi khí hậu của khu vực và khai thác giá trị nguồn trái giác có trong thiên nhiên để tăng thêm thu nhập. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Xác định đặc điểm và giá trị của nguyên liệu trái giác ở ĐBSCL; phân lập, tuyển chọn và xác định mối quan hệ di truyền của các chủng nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt được tuyển chọn từ trái giác. Khảo sát điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt, tạo ra sản phẩm rượu vang trái giác có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị, đạt các chỉ tiêu chất lượng theo quy định, đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa. 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập và đánh giá một số đặc điểm hóa lý và đặc tính kháng oxy hóa của nguyên liệu trái giác vùng ĐBSCL. Nội dung 2: Phân lập nấm men từ trái giác tự nhiên ở 13 tỉnh, thành phố vùng ĐBSCL và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập được. Nội dung 3: Tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt, định danh và xác định mối quan hệ di truyền các chủng nấm men được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử. 2 Nội dung 4: Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng và điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt tốt nhất được tuyển chọn; phân tích, kiểm nghiệm chất lượng của sản phẩm. 1.4 Ý nghĩa của luận án Luận án đã khẳng định được giá trị của nguồn nguyên liệu trái giác vùng ĐBSCL, cung cấp dữ liệu tin cậy về hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa. Dữ liệu này có thể dùng làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm khai thác giá trị của nguồn trái giác tồn tại trong thiên nhiên, góp phần làm tăng thêm thu nhập của người dân trong khu vực. Luận án đã cung cấp bộ giống nấm men được phân lập từ trái giác tự nhiên, góp phần làm phong phú sự hiểu biết về đa dạng sinh học vi sinh vật. Nghiên cứu này có thể làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính sinh học và khả năng ứng dụng của bộ giống nấm men. Luận án cũng đã tuyển chọn được các chủng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men rượu tốt và đã ứng dụng vào quy trình lên men rượu vang trái giác ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu này mở ra triển vọng sản xuất rượu vang ổn định trong điều kiện nhiệt độ trái đất ngày càng tăng cao. Đề tài này có ý nghĩa ứng dụng thực tế tốt, đã đề xuất giải pháp lên men trái giác ở nhiệt độ cao. 1.5 Những điểm mới của luận án - Xác định trái giác có chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mg GAE/mL và có khả năng kháng oxy hóa từ 16,60 đến 82,86%. - Phân lập được 151 chủng nấm men từ trái giác tự nhiên vùng ĐBSCL thuộc giống Saccharomyces, Candida, Clavispora, Pichia và Hanseniaspora. - Xác định có 30 chủng nấm men tự nhiên trên trái giác có khả năng chịu nhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol từ 9 - 12% và lên men dịch trái giác sinh hàm lượng ethanol từ 6% (v/v) trở lên. - Tuyển chọn được chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae HG1.3 có khả năng chịu nhiệt đến 43ºC, lên men rượu trái giác ở nhiệt độ 35ºC với pH thích hợp là 4,5, 20 ºBrix, mật số giống chủng 105 tế bào/mL. Sau 6 ngày lên men hàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v). Sản phẩm rượu vang trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả năng kháng oxy hóa là 57,3% và có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị. 3 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Rượu vang 2.1.1 Giới thiệu về rượu vang Rượu vang là loại đồ uống có độ cồn nhẹ, có giá trị dinh dưỡng cao, được lên men từ trái cây không qua quá trình chưng cất. Rượu vang được tàng trữ hàng chục năm, thậm chí hàng trăm năm nên rượu có hương vị đặc trưng và hấp dẫn người tiêu dùng (Lê Văn Nhượng và Nguyễn Văn Cách, 2009). Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine” (Lương Đức Phẩm, 2009). Việc sản xuất rượu vang đã được con người biết từ thời Ai Cập cổ đại, ban đầu được tiến hành bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá và sau một thời gian thì thu được loại đồ uống có độ cồn thấp, có hương vị thơm ngon rất quyến rũ. Thành phần hóa học của rượu vang rất phức tạp, có những chất hiện diện với lượng tương đối lớn có thể xác định được, nhưng cũng có những chất chiếm một tỷ lệ rất thấp như chất thơm, acid bay hơi,… Thông thường rượu vang có chứa 85 - 89% nước, khoảng 10 - 14% ethanol, dưới 1% acid và hàng trăm loại chất tạo hương khác nhau ở nồng độ rất thấp. Nồng độ ethanol có trong rượu vang ở mức có thể tiêu diệt đa số các loại vi sinh vật gây bệnh (Phạm Văn Ty, 2007). Thành phần hóa học của rượu vang được trình bày trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rượu vang trái cây Thành phần Khối lượng (g/L) Nước 818-890 Rượu etylic 80-144 Đường tổng số 62-132 Chất hòa tan không phải đường 18-30 Acid (tính ra acid malic) 5-7 Acid bay hơi 0,65- 1,1 Tro 1,8- 2,9 (Nguồn: Vũ Công Hậu, 2004) Nhìn chung, thành phần rượu vang gồm nước, cồn, đường, acid tổng số, acid bay hơi, vitamin, chất tạo mùi thơm, polyphenol, tro và các muối khoáng,… (Bruce, 1999). Ethanol là thành phần quan trọng trong rượu vang. Ethanol có 4 được do lên men từ dịch trái cây nên là loại rượu tinh khiết, có mùi thơm, vị ngọt giống như đường. Đường trong rượu vang chủ yếu là fructose, glucose, galactose, có thể bổ sung thêm đường saccharose. Sau khi lên men, toàn bộ đường bị thủy phân thành đường khử. Rượu vang còn nhiều đường khử, đặc biệt khi hàm lượng ethanol thấp dễ bị vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí phân giải đường, chuyển thành acid lactic, giấm làm rượu bị mất mùi vị. Acid là một thành phần quan trọng của rượu vang, hàm lượng acid tổng số 4-5 g/L, pH khoảng 2,9-3,9. Acid hữu cơ có tác dụng ngăn cản hoạt động của các vi khuẩn làm hỏng rượu như acid tatric, malic, citric, oxalic,… Mặt khác, một số acid nếu hiện diện với hàm lượng cao trong rượu sẽ làm thay đổi mùi vị của rượu như acid acetic, formic, propionic, butyric,…. Tro và các chất muối có nhiều trong rượu vang quả, phổ biến nhất là P, S, K, Na, Ca, Mg, Si, Fe, Mn, Fl2,Cl2, Br2, I2, Al,…. Mặc dù hiện diện với lượng rất thấp, nhưng có tác dụng làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh dưỡng. Chất tạo hương thơm trong nguyên liệu trái cây thường bị phân hủy, tuy nhiên, nấm men có khả năng sinh ra một số chất có mùi thơm đặc trưng cho từng loại trái cây. Rượu vang giàu vitamin nhờ vào quá trình lên men điều chỉnh lại thành phần vitamin của trái, một phần vitamin có được là do nấm men tổng hợp. Polyphenol là hợp chất phức tạp có trong trái, gồm nhiều chất khác nhau như acid benzoic, acid cyamic, flavol làm cho rượu có màu hồng, anthocyan tạo màu đỏ cho rượu, tạo vị chát và có khả năng ức chế các loại vi khuẩn có hại phát triển. 2.1.2 Nguyên liệu làm rượu vang Nguyên liệu để làm rượu vang đầu tiên là trái nho. Chất lượng rượu vang chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi chất lượng nho, nhiều giống nho quý đang được trồng và nhiều quốc gia đã sản xuất hàng nghìn loại rượu vang có hương, vị khác nhau mang những nét đặc trưng riêng của từng quốc gia, từng khu vực thậm chí từng hãng sản xuất. Với nhu cầu rượu vang tăng nhanh, nhiều nguyên liệu làm rượu vang ngày càng đã và đang được mở rộng. Một số loại quả có đường khác như dâu, mơ, điều, sherry, táo, lê, dứa, vải thiều, chuối, mận ... được nghiên cứu làm nguyên liệu để sản xuất rượu vang và được thị trường chấp nhận (Lê Văn Nhượng và Nguyễn Văn Cách, 2009). Theo Vũ Công Hậu (2004), nguyên liệu là một yếu tố rất quan trọng trong sản xuất rượu vang. Các tiêu chuẩn chọn trái cây dùng trong chế biến rượu vang cần có hàm lượng đường tổng số trong nước trái cao, độ Brix phải từ 20 - 22, đối với trái có độ Brix thấp cần điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm đường. Hàm lượng acid hữu cơ tương đối cao, pH thấp (2,8 - 3,8). Thành phần của nước quả 5 thích hợp với hoạt động của nấm men với một lượng tối thiểu các chất sau: acid amin, vitamin, muối khoáng thực hiện vai trò xúc tác với một lượng rất nhỏ, polyphenol - tanin làm cho rượu có màu sắc hấp dẫn và đóng góp vào việc ức chế hoạt động của vi khuẩn có hại. 2.1.3 Hệ vi sinh vật trong lên men rượu vang Hiện nay trên thế giới người ta sản xuất rượu vang theo hai phương pháp: lên men bằng vi sinh vật tự nhiên và lên men bằng vi sinh vật thuần chủng. 2.1.3.1 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhiên Ở những nước có nghề sản xuất rượu vang truyền thống sử dụng vi sinh vật tự nhiên có ở trái nho. Việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang có ưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần chủng, do đó không đòi hỏi kỹ thuật cao, không cần đầu tư quá nhiều cho quá trình sản xuất. Sản phẩm khá khác biệt vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm không chỉ lấy từ nguồn trái cây mà còn được tạo ra bởi nấm men vi sinh vật tự nhiên trên trái nho và theo vào quá trình lên men. Bên cạnh những ưu điểm thì việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên cũng có những bất lợi là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được chất lượng giống vi sinh vật ban đầu cho quá trình lên men. Trên thế giới, những cơ sở sản xuất rượu vang hay ở quy mô gia đình có truyền thống sản xuất rượu vang nổi tiếng vẫn sử dụng vi sinh vật tự nhiên để thực hiện quá trình lên men. Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm của phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm khi lựa chọn nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu. Những nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, hệ vi sinh vật tự nhiên trong sản xuất theo phương pháp này có 76 - 90% là nấm sợi, 9 - 22% là nấm men, số còn lại là xạ khuẩn và ít vi khuẩn. Dịch nước nho có pH thấp từ 2,7 - 3,8 thường không thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Đây là điều rất thuận lợi cho việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên trong sản xuất (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.1.3.2 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật thuần chủng Công đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu vang là quá trình lên men. Quá trình lên men được chia làm hai giai đoạn là giai đoạn lên men chính và giai đoạn lên men phụ. Cả hai giai đoạn lên men này, vi sinh vật đóng vai trò quan trọng nhất là nấm men. Nấm men tham gia chủ yếu vào quá trình lên men trước 6