Tài liệu Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cây ngón hoa trắng (nhài bắc) và cây trúc đào ở việt nam phục vụ cho giám định hóa pháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 1 BỘ QUỐC PHÕNG VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ --------------------------------------- LÊ ANH HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, ĐỘC TÍNH CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC) VÀ CÂY TRÚC ĐÀO Ở VIỆT NAM PHỤC VỤ CHO GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG 2 VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ --------------------------------------- LÊ ANH HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, ĐỘC TÍNH CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC) VÀ CÂY TRÚC ĐÀO Ở VIỆT NAM PHỤC VỤ CHO GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 62 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN TIẾN VỮNG 2. TS. ĐÀO CÔNG MINH Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Ngƣời cam đoan Lê Anh Hào LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững TS. Đào Công Minh những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Thủ trƣởng, phòng Đào tạo, Viện Hóa học - Vật liệu - Viện Khoa học và Công nghệ quân sự - Bộ Quốc phòng, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS. Nguyễn Việt Bắc, Viện Hóa học - Vật liệu, đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo, các đồng nghiệp Khoa Hóa pháp Viện Pháp y Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên để tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng, Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học - Vật liệu, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt thời gian qua. Một lần nữa, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tất cả sự giúp đỡ quí báu trên. Hà Nội, 9/2015 LÊ ANH HÀO MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 3 1.1. SƠ LƢỢC VỀ GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP 3 1.1.1. Tình hình giám định hóa pháp trên thế giới 4 1.1.2. Tình hình giám định hóa pháp tại Việt Nam 4 1.2. VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 5 1.3. CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC) 6 1.3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học chi Jasminum 6 1.3.2. Đặc điểm thực vật cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) 9 1.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) 10 1.4. CÂY TRÖC ĐÀO 10 1.4.1. Đặc điểm thực vật 10 1.4.2. Công dụng của cây trúc đào 11 1.4.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học 11 1.4.4. Độc tính của cây trúc đào 24 1.4.5. Các thuốc thử, định tính và định lƣợng glycosid 25 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU 30 2.2. HÓA CHẤT, THUỐC THỬ 30 2.2.1. Hệ dung môi chạy bản mỏng, thuốc thử và pha động chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật 30 30 31 31 2.3.2. Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc 36 2.3.3. Định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào bằng phƣơng pháp cân 42 2.3.4. Thử độc tính cấp 43 2.3.5. Ứng dụng trong giám định hóa pháp 45 Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 47 3.1.1. Định danh mẫu vật 47 3.1.2. Cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) 47 3.1.3. Đặc điểm thực vật cây trúc đào 56 3.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐÃ SỬ DỤNG 58 3.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế 58 3.2.2. Các phƣơng phƣơng pháp nhận dạng 60 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC) 3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY TRÖC ĐÀO 60 67 3.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY TRÖC ĐÀO 113 3.6. NHẬN XÉT VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 123 3.7. ĐỊNH LƢỢNG GLYCOSID TIM TRONG LÁ TRÖC ĐÀO 129 3.8. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP 130 3.8.1. Thử độc tính cấp mẫu lá trúc đào 130 3.8.2. Thử độc tính cấp mẫu ngón hoa trắng (Nhài bắc) 133 3.9. ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP 3.9.1. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lớp mỏng 136 136 3.9.2. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 138 KẾT LUẬN 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 147 TÀI LIỆU THAM KHẢO i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Liều gây chết a % động vật thí nghiệm chết sát dƣới 50% b % động vật thí nghiệm chết sát trên 50% br s Singlet tù 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon C13, (MHz, C NMR(125 MHz, CHCl3)δC dung môi đo) CC Sắc kí cột (Columm chromatography) CHCl3 Chloroform δ (ppm) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm d doublet D Khoảng cách giữa các liều dd doublet của doublet dq doublet của quartet dt doublet của triplet DMSO Dimethylsulfoxit đ.n.c Điểm nóng chảy ĐVTN Động vật thí nghiệm EI-MS (70eV) Phổ khối va chạm electron ở 70eV, (Electron ImpactMass Spectroscopy) ESI - MS Phổ khối bụi electron, (Electron Spray Ionisation Mass Spectroscopy) EtOAc Ethyl Acetat h.c Hợp chất 1 Phổ tƣơng tác proton, (1H - H 1H COSY 1 H - Correlation Spectroscopy) 1 H NMR(500 MHz, Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton,(MHz, dung môi CHCl3)δH đo) h.l Hàm lƣợng ii HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao J(Hz) Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz k Hệ số Behrens LD50 Liều gây chết 50% số con vật thử (Lethal Dose) LOD Limit of detection m multiplet MeOH Methanol NOESY Phổ tƣơng tác qua không gian (hiệu ứng Overhaus hạt nhân), (Nuclear Overhaus Effect Spectroscopy) pđ Phân đoạn q quartet s Singlet S Phân phối chuẩn (standard distribution) SELD50 Sai số chuẩn của LD50 (standard error of LD50) SKC Sắc ký cột SKLMĐC Sắc kí lớp mỏng điểu chế SKLM Sắc kí lớp mỏng t triplet td triplet của doublet TMS Tetramethylsilan X Hàm lƣợng phần trăm của glycosid 𝑥 Khối lƣợng cặn 𝑦 Khối lƣợng nguyên liệu (g) z Độ ẩm mẫu thử iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các hợp chất đặc trƣng của chi Jasminum Bảng 3.1: Bảng so sánh sự giống và khác nhau giữa ngón hoa trắng (Nhài 7 bắc) với ngón hoa vàng 48 Bảng 3.2: Danh sách 12 mẫu lấy trên GenBank đƣợc dùng để so sánh 55 Bảng 3.3: Danh sách 6 mẫu lấy trên GenBank đƣợc dùng để so sánh 55 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 1H NMR(500 MHz, CHCl3)δH và 13C NMR(125 64 MHz, CHCl3)δC của chất HC2 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, CHCl3)δH và 13C NMR (125 66 MHz, CHCl3)δC của chất HC3 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO13 và chất so sánh 70 Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO14 và chất so sánh 72 Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO15 78 Bảng 3.9: Số liệu phổ NMR của chất NO16 và chất so sánh 81 Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO17 và chất so sánh 89 Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO18 93 Bảng 3.12: Số liệu phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO1 và chất so sánh Bảng 3.13: 95 Số liệu phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO2 và chất so sánh 98 Bảng 3.14: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO3 và chất so sánh 101 Bảng 3.15: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO8 và chất so sánh 107 Bảng 3.16: Số liệu phổ NMR của hợp chất NO10 và chất so sánh 111 Bảng 3.17: Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) 123 Bảng 3.18: Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá, hoa cây trúc đào 125 Bảng 3.19: Bảng kết quả định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào khô 129 Bảng 3.20: Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột 130 Bảng 3.21: Kết quả thử nghiệm cao trúc đào 131 Bảng 3.22: Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột 134 Bảng 3.23 Kết quả thử nghiệm cao ngón hoa trắng (Nhài bắc) 134 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Ảnh cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) chụp tại Cao Bằng 9 Hình 1.2: Ảnh cành mang hoa trúc đào chụp tại Hà Nội 11 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây ngón hoa trắng 37 Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng 38 Hình 2.3: Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây trúc đào 39 Hình 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng CHCl3 chiết lá trúc đào Hình 2.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc chiết lá trúc đào Hình 2.6: 40 41 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc chiết hoa trúc đào 42 Hình 3.1: Hình ảnh vi phẫu gân lá ngón hoa trắng (Nhài bắc) 49 Hình 3.2: Hình ảnh vi phẫu phiến lá ngón hoa trắng (Nhài bắc) 50 Hình 3.3: Hình ảnh vi phẫu cành lá ngón hoa trắng (Nhài bắc) 51 Hình 3.4: Hình ảnh vi phẫu gân lá ngón hoa vàng 52 Hình 3.5: Hình ảnh vi phẫu phiến lá ngón hoa vàng 52 Hình 3.6: Hình ảnh vi phẫu cành lá cây ngón hoa vàng 54 Hình 3.7: Hình ảnh vi phẫu của lá trúc đào 59 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC1 61 Hình 3.9: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC1 61 Hình 3.10: Cấu trúc của hợp chất HC1 62 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC2 62 13 Hình 3.12: Phổ C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC2 63 Hình 3.13: Phổ DEPT của hợp chất HC2 63 Hình 3.14: Cấu trúc dóa học của hợp chất β-sitosterol (HC2) 65 Hình 3.15: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC3 66 Hình 3.16: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC3 67 Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất tyrosol (HC3) 67 v Hình 3.18: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO13 68 Hình 3.19: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO13 69 Hình 3.20: Phổ DEPT của hợp chất NO13 69 Hình 3.21: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO13 70 Hình 3.22: Cấu trúc hóa học của hợp chất neriasid (NO13) 71 Hình 3.23: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO14 74 Hình 3.24: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO14 74 Hình 3.25: Phổ DEPT của hợp chất NO14 75 Hình 3.26: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO14 75 Hình 3.27: Cấu trúc hóa học của hợp chất adynerigenin 3-O--Ddiginosid (NO14) 76 Hình 3.28: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO15 77 Hình 3.29: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO15 77 Hình 3.30: Phổ DEPT của hợp chất NO15 78 Hình 3.31: Cấu trúc hóa học của hợp chất NO15 79 Hình 3.32: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO16 81 Hình 3.33: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO16 83 Hình 3.34: Phổ DEPT của hợp chất NO16 83 Hình 3.35: Phổ NOESY của chất NO16 84 Hình 3.36: Phổ HSQC của hợp chất NO16 84 Hình 3.37: Phổ HMBC của hợp chất NO16 85 Hình 3.38: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO16 85 Hình 3.39: Cấu trúc hóa học và một số tƣơng tác HMBC của hợp chất oleandrin (NO16) 86 Hình 3.40: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO17 87 Hình 3.41: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO17 88 Hình 3.42: Phổ DEPT của hợp chất NO17 88 Hình 3.43: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO17 89 Hình 3.44: Cấu trúc hóa học của hợp chất gitoxigenin-3-O--Loleandrosid (NO17) 90 vi Hình 3.45: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO18 91 Hình 3.46: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO18 92 Hình 3.47: Phổ DEPT của hợp chất NO18 92 Hình 3.48: Cấu trúc hóa học của hợp chất 16- adynerigenin 3-O--Ddiginosid (NO18) 94 Hình 3.49: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO1 96 Hình 3.50: Phổ 1C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO1 96 Hình 3.51: Phổ DEPT của hợp chất NO1 97 Hình 3.52: Cấu trúc hóa học của hợp chất acid oleanolic (NO1) 97 Hình 3.53: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO2 99 Hình 3.54: Phổ 1C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO2 99 Hình 3.55: Phổ DEPT của hợp chất NO2 100 Hình 3.56: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO2 100 Hình 3.57: Cấu trúc hóa học của hợp chất acid betulinic (NO2) 100 Hình 3.58: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO3 102 Hình 3.59: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO3 102 Hình 3.60: Phổ DEPT của hợp chất NO3 103 Hình 3.61: Cấu trúc hóa học của hợp chất betulin (NO3) 103 Hình 3.62: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO8 104 Hình 3.63: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO8 104 Hình 3.64: Phổ DEPT của hợp chất NO8 105 Hình 3.65: Phổ HSQC của hợp chất NO8 105 Hình 3.66: Phổ HMBC của hợp chất NO8 106 Hình 3.67: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO8 106 Hình 3.68: Cấu trúc hóa học của hợp chất acid 27-hydroxy-3βhydroxyurs-12-en-28-oic (NO8) Hình 3.69: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH giãn rộng của hợp chất NO10 Hình 3.70: 108 109 Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC giãn rộng của hợp chất NO10 109 vii Hình 3.71: Phổ DEPT của hợp chất NO10 110 Hình 3.72: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO10 110 Hình 3.73: Cấu trúc hóa học của hợp chất pinoresinol (NO10) 111 Hình 3.74: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO12 112 Hình 3.75: Cấu trúc hóa học của hợp chất syringaresinol (NO12) 112 Hình 3.76: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 2A 114 Hình 3.77: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 2A 114 Hình 3.78: Phổ DEPT của hợp chất HF 2A 115 Hình 3.79: Cấu trúc hóa học của hợp chất 16-dehydroadynerigenin 115 Hình 3.80: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 2.1 116 Hình 3.81: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 2.1 117 Hình 3.82: Phổ DEPT của hợp chất HF 2.1 117 Hình 3.83: Cấu trúc hóa học của hợp chất 16-digitoxigenin 118 Hình 3.84: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 5A 119 Hình 3.85: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 5A 119 Hình 3.86: Phổ khối hợp chất HF 5A 120 Hình 3.87: Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin 120 Hình 3.88: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 5.2.1 121 Hình 3.89: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 5.2.1 122 Hình 3.90: Cấu trúc hóa học của hợp chất kaempferol 122 Hình 3.91: Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.19 132 Hình 3.92: Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.21 134 Hình 3.93: Sắc kí lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02 soi dƣới đèn tử ngoại Hình 3.94: 137 Sắc kí lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02 phun thuốc thử Kedde 138 Hình 3.95: Sắc kí đồ của oleandrin 139 Hình 3.96: Sắc kí đồ của mẫu PT01 140 Hình 3.97: Sắc kí đồ của mẫu PT01 đã thêm oleandrin 140 viii Hình 3.98: Sắc ký đồ của mẫu PT01, mẫu PT01 đã thêm oleandrin và mẫu đối chiếu oleandrin 141 Hình 3.99: Sắc kí đồ của mẫu PT02 141 Hình 3.100: Sắc kí đồ của mẫu PT01 đã thêm oleandrin 142 Hình 3.101: Sắc ký đồ của mẫu PT02, mẫu PT01 đã thêm oleandrin và mẫu đối chiếu oleandrin 142 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm ở khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Nƣớc ta ƣớc tính có đến 12.000 loài thực vật, trong đó có khoảng gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc thuộc khoảng 300 họ, đại đa số là cây mọc tự nhiên và một số đƣợc nhập về trồng, hầu hết chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học và tác dụng sinh học [1]. Từ thực vật, nguồn tài nguyên thiên nhiên quan trọng, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đa dạng và có hoạt tính sinh học phong phú, đóng vai trò quan trọng trong đời sống con ngƣời. Chúng đƣợc dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật . . . Ngày nay các loại thảo dƣợc vẫn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc sản xuất dƣợc phẩm nhƣ là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp chất dẫn đƣờng cho việc tìm kiếm các loại thuốc mới, có hoạt tính cao, chữa đƣợc nhiều bệnh, kể cả các bệnh hiểm nghèo [4], trong đó nhiều cây độc hiện đã và đang đƣợc ứng dụng vào làm thuốc (nhƣ Cà độc dƣợc, Mã tiền, Ô đầu, Trúc đào,...). Khi dùng đúng cách, đúng liều lƣợng thì các cây độc có tác dụng chữa bệnh, nhƣng nếu không dùng đúng thì chúng lại có thể gây ngộ độc. Hàng năm qua khảo sát, nƣớc ta có nhiều vụ ngộ độc do sử dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát có nguồn gốc từ cây ngón [11], cây trúc đào. Theo thống kê của trung tâm Y tế huyện Điện Biên Đông, một huyện có đa phần là ngƣời H’Mông sinh sống, trong năm 2012, trên địa bàn xảy ra khoảng 80 vụ ngộ độc liên quan đến cây ngón và khoảng gần 70 ngƣời chết trong đó đa số là ngƣời trẻ tuổi. Mặt khác trong giám định hóa pháp, chất chuẩn và chất đối chiếu là vô cùng quan trọng. Nó phục vụ quy trình giám định Hóa pháp, cấp cứu bệnh nhân ngộ độc một cách chính xác và nhanh chóng. Đặc biệt từ năm 2013, khi luật giám định tƣ pháp đi vào cuộc sống thì việc giám định cần phải có độ chính xác cao. Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính của các cây độc có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, nó giúp cho công tác giám định hoá pháp và phục vụ công tác cứu chữa nạn nhân ngộ độc một cách kịp thời, nhanh chóng. 2 Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cây Ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây Trúc đào ở Việt Nam phục vụ cho giám định hóa pháp”  Mục tiêu nghiên cứu: Bƣớc đầu hoàn thiện hồ sơ thực vật về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc). Đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính cấp, hàm lƣợng glycosid trong lá cây trúc đào. Ứng dụng oleandrin trong phân tích, giám định hóa pháp.  Đối tượng nghiên cứu của luận án: Cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây trúc đào.  Các nội dung chính luận án cần giải quyết: Xác định tên khoa học, đặc điểm thực vật, phân bố, vi phẫu, giám định DNA của cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và trúc đào. Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và lá, hoa cây trúc đào. Định lƣợng glycosid tim trong lá cây trúc đào. Thử độc tính cấp cao chiết từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cao chiết lá cây trúc đào. Ứng dụng oleandrin làm chất đối chiếu trong giám định Hóa pháp.  Những đóng góp mới của luận án: Xây dựng bộ hồ sơ thực vật về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) gồm: tên khoa học, phân bố, mô tả hình thái, vi phẫu, giám định DNA so sánh với cây ngón hoa vàng (Gelseminum elegans). Xác định độc tính cấp, thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây trúc đào. Ứng dụng chất đã phân lập đƣợc oleandrin làm chất đối chiếu trong giám định Hóa pháp. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. SƠ LƢỢC VỀ GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP Trong giám định pháp y, giám định hóa pháp là một khâu rất quan trọng góp phần kết luận các vụ án kịp thời, khoa học và chính xác. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, kỹ thuật. Các ngành hóa học, dƣợc học cũng phát triển không ngừng và đã cho ra đời nhiều sản phẩm hóa, dƣợc học đƣợc sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, trong nông nghiệp cũng nhƣ trong y học. Hiện nay, tình trạng ngộ độc ngày càng tăng, nguyên nhân gây ngộ độc rất đa dạng, có thể do nghề nghiệp, ô nhiễm môi trƣờng, ngộ độc thực phẩm, lạm dụng sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật, thuốc điều trị, đầu độc, tự tử. Kết quả giám định hóa pháp cung cấp bằng chứng để xác định nguyên nhân gây ra cái chết, phục vụ cấp cứu các nạn nhân tại các bệnh viện và những vấn đề liên quan đến pháp luật. Giám định hóa pháp liên quan đến việc phát hiện, xác định, định tính và định lƣợng các chất độc có liên quan đến con ngƣời, các mẫu vật. Để có đƣợc kết quả chính xác thì phải đƣợc áp dụng đúng tiêu chuẩn về quy trình giám định. Việc phân tích các thành phần hóa học hoặc các chất chuyển hóa của dƣợc phẩm, thuốc gây nghiện, cây độc và các chất độc khác có liên quan (nhƣ: rƣợu, kim loại nặng, thuốc trừ sâu, …), theo nghĩa rộng (chủ yếu là trong các mẫu sinh học, [con ngƣời] dịch cơ thể, mô … ), bao gồm: + Phân tích các loại dƣợc phẩm hoặc thuốc gây nghiện có tác động tiêu cực tới hành vi con ngƣời. + Lạm dụng các chất liên quan đến các hoạt động thể thao (doping). + Phân tích định tính hoặc định lƣợng các chất gây nghiện trong mẫu sinh học hoặc mẫu tang vật khác. + Phân tích ngộ độc từ thực vật (các loại cây độc). + Các phƣơng pháp phân tích hóa pháp thực hiện cho mục đích chẩn đoán và điều trị (ví dụ nhƣ trong độc chất lâm sàng, phẫu thuật cấy ghép, giám sát hoặc điều trị, phục hồi chức năng, ngƣời nghiện ma tuý). 4 Mỗi phƣơng pháp phân tích đƣợc sử dụng trong giám định hoá pháp cần đƣợc thực hiện theo một quy trình chuẩn để đảm bảo kết quả chính xác. Việc lựa chọn phƣơng pháp để giám định phụ thuộc rất lớn vào loại chất độc cần giám định và mẫu giám định. Phƣơng pháp sàng lọc bao gồm phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng và xét nghiệm miễn dịch. Để kết luận mẫu dƣơng tính thì phải áp dụng các phƣơng pháp khẳng định nhƣ sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký khí khối phổ... Khi áp dụng các phƣơng pháp hiện đại vào giám định hóa pháp thì cần phải có chất chuẩn, chất đối chiếu và đặc biệt các chất chuẩn, chất đối chiếu dùng trong giám định hóa pháp các nạn nhân ngộ độc thực vật (nhƣ: ngộ độc cây lá ngón, trúc đào, cà độc dƣợc, mã tiền...). Khi có chất chuẩn, chất đối chiếu thì việc giám định hóa pháp sẽ thuận lợi và có độ chính xác cao hơn. 1.1.1. Tình hình giám định hóa pháp trên thế giới Hiện nay hầu hết các nƣớc trên thế giới đều có cơ quan phân tích độc chất, hóa pháp và đã xây dựng các qui trình giám định hoá pháp phù hợp với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, trình độ, trang thiết bị, hay qui định về luật pháp của từng nƣớc. Ở các nƣớc việc giám định hóa pháp, độc chất hiện vẫn đang sử dụng các phƣơng pháp hóa học (phản ứng màu), sắc ký lớp mỏng, để sàng lọc sau đó sử dụng các phƣơng pháp hiện đại để khẳng định nhƣ sắc ký khí khối phổ, sắc ký lỏng khối phổ... Theo yêu cầu của Hội các nhà độc chất tƣ pháp quốc tế (TIAFT: The International Association of Forensic Toxicologists), một phòng tiêu chuẩn đủ điều kiện giám định độc chất thì phải đảm bảo về con ngƣời, kỹ thuật, thiết bị (bao gồm nhƣ: TLC - sắc ký lớp mỏng, GC - sắc ký khí, HPLC - sắc ký lỏng hiệu năng cao, khối phổ - MS, quang phổ tử ngoại khả kiến - UV/VIS) và các loại chất chuẩn. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Nhật, Hàn Quốc... các chất chuẩn đƣợc cung cấp thƣờng xuyên và dễ dàng ngay cả các chất chuẩn về ma túy. Còn ở các nƣớc đang phát triển thì việc mua đƣợc chất chuẩn cũng rất khó khăn. Mặt khác, các chất chuẩn liên quan đến cây độc thƣờng khó đƣợc cung cấp đầy đủ kể cả ở các nƣớc phát triển. 5 1.1.2. Tình hình giám định hóa pháp tại Việt Nam Tại Việt Nam hiện có 3 đơn vị giám định hóa pháp, độc chất là Viện Pháp y Quốc gia, Viện Pháp y Quân đội và Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Nhƣng giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc chủ yếu là Viện Pháp y Quốc gia và Viện Pháp y Quân đội, còn Viện Khoa học hình sự giám định không nhiều. Ngày nay khi luật pháp của nƣớc ta ngày càng hoàn thiện và nhà nƣớc cũng quan tâm đầu tƣ các thiết bị hiện đại để phục vụ giám định hóa pháp, thì việc giám định hóa pháp đòi hỏi ngày càng phải nâng cao chất lƣợng giám định. Hiện tại các phƣơng pháp giám định hóa pháp của Việt Nam cũng giống nhƣ các nƣớc trên thế giới là phân tích sàng lọc bằng các phƣơng pháp nhƣ sắc ký lớp mỏng, hóa học sau đó ứng dụng các phƣơng pháp nhƣ sắc ký khí khối phổ, sắc ký lỏng khối phổ…để khẳng định mẫu dƣơng tính hay âm tính. Ở nƣớc ta việc mua chất chuẩn của các chất độc là rất khó khăn, đặc biệt là chất chuẩn về ma túy và chuẩn liên quan đến cây độc. Hàng năm Viện Pháp y Quốc gia vẫn đặt mua các chất chuẩn của các chất độc nhƣng rất khó mua đƣợc do rào cản kỹ thuật của luật pháp Việt Nam. Do vậy, để có chất đối chiếu trong giám định hóa pháp tại Viện Pháp y Quốc gia thì việc khắc phục tạo ra các chất đối chiếu là hết sức quan trọng, đặc biệt là các chất đối chiếu của các cây độc. Từ đó góp phần nâng cao chất lƣợng giám định hóa pháp nói riêng và giám định tƣ pháp nói chung, mặt khác cũng góp phần cấp cứu các nạn nhân ngộ độc một cách kịp thời. 1.2. VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Cây ngón hoa trắng hiện trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam chƣa thấy tài liệu nào công bố về thành phần hóa học cũng nhƣ độc tính cấp của cây này, có thể nói đây là nghiên cứu đầu tiên về cây này. Do vậy qua nghiên cứu này bƣớc đầu muốn làm sáng tỏ một số thành phần hóa học, độc tính cấp và từ đó có thể xác định nạn nhân ngộ độc cây ngón hoa trắng hay ngón hoa vàng. - Cây trúc đào đƣợc lựa chọn nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính do qua tham khảo các tài liệu, thấy cây trúc đào ở trên thế giới cũng đã đƣợc nghiên cứu 6 nhiều, ở Việt Nam GS. Đỗ Tất Lợi đã nghiên cứu và có một số công bố về kết quả. Mặt khác trúc đào là một cây rất độc và hàng năm tại nƣớc ta vẫn xảy ra nạn nhân bị ngộ độc cây này. Việc giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc cây trúc đào cần phải nhanh chóng và có độ chính xác cao. Nhƣng hiện tại trong giám định nạn nhân ngộ độc trúc đào thì vẫn chƣa có chất đối chiếu. Vậy qua nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính cấp từ lá trúc đào tại Việt Nam sẽ tạo đƣợc chất đối chiếu để ứng dụng trong giám định hóa pháp và cho biết đƣợc độc tính cấp của lá trúc đào. - Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, việc lựa chọn đối tƣợng và nguyên liệu nghiên cứu nhƣ trên, kết quả nghiên cứu đạt đƣợc sẽ có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và có tính mới trong nghiên cứu. 1.3. CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC) Cây ngón hoa trắng đƣợc xác định là thuộc chi Jasminum, để tìm hiểu sâu hơn về cây ngón hoa trắng, trƣớc tiên cần tìm hiểu về chi Jasminum. 1.3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học Chi Jasminum Đặc điểm thực vật. Chi Jasminum thuộc họ Oleaceae. Tên thông thƣờng là Chi Nhài hay Lài. Là một chi của cây bụi và dây leo với khoảng 840 loài trên thế giới [106], có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và khu ôn đới ấm. Ở Việt Nam có khoảng 30 loài [72]. Cây gốc ở Ấn Độ, ở Việt Nam cây đƣợc trồng làm cảnh khắp nơi. Hoa thƣờng dùng để ƣớp trà hoặc để làm thơm thức ăn. Vào mùa thu đông, đào lấy rễ, rửa sạch, thái nhỏ, phơi hay sấy khô. Lá thu hái quanh năm. Hoa thu hái vào hè thu, khi mới nở (vì lúc đó hoa có nhiều hoạt chất), dùng tƣơi hay phơi khô. Phần lớn các loài phát triển bằng cách leo, bám trên cây khác leo trên các hàng rào. Cây cao khoảng 0.5 - 3m, có nhiều cành xòa mọc ra. Lá hình trái xoan bầu dục, bóng cả hai mặt, có lông ở dƣới, ở kẽ những gân phụ. Lá xanh quanh năm và rụng vào mùa thu. Cụm hoa ở ngọn, thƣa hoa. Lá bắc hình sợi. Hoa màu trắng, thơm ngát. Quả hình cầu, màu đen bao bởi đài tồn tại, có 2 ngăn. Thành phần hóa học Hợp chất đặc trƣng của chi Jasminum là chất iridoid. Các hợp chất chủ yếu