Tài liệu Luận án nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 9720202 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Vũ Bình Dương 2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Hồng Sơn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi luôn được sự quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các nhà khoa học, cùng với sự động viên của bạn bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Vũ Bình Dương PGS.TS. Hồ Anh Sơn Những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng và sản xuất thuốc, Viện Đào tạo Dược, Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Trân trọng cảm ơn các thầy cô Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, phòng Sau đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Học viện Quân y Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Y học cổ truyền Quân đội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể yên tâm học tập, nghiên cứu. Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 Nguyễn Hồng Sơn MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA ..................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố......................................................... 3 1.1.2. Thành phần hóa học ........................................................................ 4 1.1.3. Tác dụng sinh học và dược lý ....................................................... 13 1.2. TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN DƯỢC LIỆU ...................................... 16 1.2.1. Đặc điểm ....................................................................................... 16 1.2.2. Phân loại ........................................................................................ 18 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men dược liệu ................. 19 1.2.4. Thay đổi về thành phần hóa học và tác dụng sinh học sau quá trình lên men dược liệu chi Allium .................................................................. 22 1.3. CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ CAO KHÔ DƯỢC LIỆU ................... 27 1.3.1. Chuẩn bị dung môi, dược liệu ....................................................... 27 1.3.2. Chiết xuất dược liệu ...................................................................... 27 1.3.3. Loại bớt tạp chất............................................................................ 28 1.3.4. Cô đặc, sấy khô ............................................................................. 30 1.4. MỘT SỐ MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC .............. 31 1.4.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo ................................................. 31 1.4.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro ................................................ 34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 37 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu .................................................................... 37 2.1.2. Động vật thí nghiệm...................................................................... 37 2.1.3. Các dòng tế bào và chủng vi sinh vật kiểm định cho nghiên cứu in vitro ......................................................................................................... 37 2.1.4. Thuốc thử, hóa chất và dung môi.................................................. 38 2.1.5. Thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 40 2.1.6. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ..................................................... 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 41 2.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men tạo hành đen và tiêu chuẩn chất lượng hành đen ..................................................................... 41 2.2.2. Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn cao khô hành đen ... 48 2.2.3. Nghiên cứu đánh giá độc tính và tác dụng sinh học của cao khô hành đen .................................................................................................. 53 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 59 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 61 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN ..... 61 3.1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin trong hành đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................ 61 3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu hành ta làm nguyên liệu bào chế hành đen .............................................................................. 65 3.1.3. Kết quả xây dựng quy trình lên men tạo hành đen ....................... 69 3.1.4. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của hành đen................. 78 3.1.5. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hành đen ..................................... 83 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN ............................................................. 86 3.2.1. Kết quả xây dựng quy trình bào chế cao khô hành đen ................ 86 3.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cao khô hành đen ......... 101 3.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen ................... 102 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN .................................................................................... 103 3.3.1. Kết quả đánh giá độc tính của cao khô hành đen ....................... 103 3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen ......................................................................................................... 108 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................ 116 4.1. VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN ......................................... 116 4.1.1. Về việc lựa chọn cycloalliin làm chất đánh dấu ......................... 116 4.1.2. Về tiêu chuẩn cơ sở hành ta ........................................................ 117 4.1.3. Về xây dựng quy trình lên men tạo hành đen ............................. 117 4.1.4. Về nghiên cứu thành phần hóa học của hành đen....................... 123 4.1.5. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hành đen............................... 128 4.2. VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN .................................................................................... 128 4.2.1. Về điều chế dịch chiết hành đen ................................................. 128 4.2.2. Bào chế cao khô hành đen bằng phương pháp phun sấy ............ 132 4.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô hành đen ...................... 138 4.2.4. Đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen ................................ 138 4.3. VỀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN .................................................................................... 139 4.3.1. Đánh giá độc tính của cao khô hành đen .................................... 139 4.3.2. Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen ......... 141 KẾT LUẬN ................................................................................................... 146 KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết tắt 1 2 3 4 5 6 AAS ABTS ACSO AE ALP ALT 7 AOAC 8 ASEAN 9 10 11 AST ATCC BP 12 13 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 CI CR/DP CYC DĐVN DM/DL DMSO DMEM DPPH ĐTĐ GLUT GSPC GS1PC 25 1 C-NMR H-NMR Phần viết đầy đủ Atomic Absorption Spectrophotometric 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) S-alky(en)yl-cystein sulfoxyd Aerosil Alkalin phosphatase Aspartate Amino Transferase Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức) Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á) Aspartate Transaminase American Type Culture Collection British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) Carbon-13 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) Chất rắn/dịch phun Cycloalliin Dược điển Việt Nam Dung môi/dược liệu Dimethyl sulfoxyd Dulbecco's Modified Eagle's Medium 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Đái tháo đường Glucose-transporter γ-glutamyl peptit γ-glutamyl-S-1-propenyl-L-cystein Hydro-1 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ proton) STT Viết tắt 26 HDL-C 27 HMBC 28 HPLC 29 30 HPMC E6 HSPS 31 IC50 32 33 34 35 36 KLRbk LD50 LDH LDL-C Mal 37 MIC 38 MTT 39 PVP K30 40 RSD 41 42 43 44 45 46 47 48 49 SD SAC SSHL STT STZ TCCS TD/CR USP WHO Phần viết đầy đủ High Density Lipoprotein Cholesterol Heteronuclear multiple bond correlationspectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Hydroxypropyl methylcellulose E6 Hiệu suất phun sấy Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối đa một nửa) Khối lượng riêng biểu kiến Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử) Lactat Dehydrogenase Low Density Lipoprotein Cholesterol Maltodextrin Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid Polyvinyl pyrrolidon K30 Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Standard deviation (Độ lệch chuẩn) S-allyl-L-cystein So sánh hàm lượng Số thứ tự Streptozocin Tiêu chuẩn cơ sở Tá dược/Chất rắn United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các hợp chất flavonoid trong hành ta 5 1.2. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hành ta 11 1.3. Các hợp chất saponin trong hành ta 12 1.4. Kết quả thử hoạt tính chống ung thư của hành đen và hành ta 26 2.1. Danh mục thuốc thử, hóa chất và dung môi sử dụng 38 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 40 2.3. Chế độ ăn bình thường và giàu chất béo tính trên 100 g thức ăn 57 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 61 3.2. Diện tích pic của dãy dung dịch cycloalliin chuẩn 63 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 64 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc ký 65 3.5. Kết quả xác định hàm lượng nước của các mẫu hành ta 66 3.6. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của hành ta 66 3.7. Kết quả định lượng CYC trong các mẫu hành ta 68 3.8. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng của hành ta 69 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men 70 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm lên men 72 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 73 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại, nồng độ enzym và thời gian ngâm ủ 75 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym protease nồng độ 0,03%, ngâm ủ trong 3 ngày đến hàm lượng CYC theo thời gian lên men 76 3.14. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần 78 3.15. Kết quả định lượng polyphenol toàn phần 78 3.16. Kết quả định lượng cycloalliin 79 3.17. Kết quả định lượng đường khử 79 3.18. Kết quả định lượng acid amin 80 3.19. Kết quả xác định độ ẩm hành đen 84 3.20. Kết quả định lượng CYC trong các mẫu hành đen 85 3.21. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong TCCS của hành đen 86 Bảng Tên bảng Trang 3.22. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến chiết xuất cycloalliin 87 3.23. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất cycloalliin 88 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu đến chiết xuất cycloalliin 88 3.25. Ảnh hưởng của số lần chiết đến chiết xuất cycloalliin 89 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến chiết xuất cycloalliin 90 3.27. Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất cycloalliin 90 3.28. Kết quả chiết xuất hành đen quy mô 2 kg/mẻ 92 3.29. Kết quả cô đặc và loại tạp cao lỏng hành đen 1:1 92 3.30. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tá dược đến quá trình phun sấy 93 3.31. Ảnh hưởng của loại tá dược đến hiệu suất phun sấy 94 3.32. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn 96 3.33. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao hành đen 96 3.34. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch 97 3.35. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến quá trình phun sấy 98 3.36. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun 99 3.37. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun đến phun sấy cao hành đen 99 3.38. Thông số quy trình bào chế cao khô hành đen 101 3.39. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong TCCS của cao khô hành đen 101 3.40. Hàm lượng cycloalliin còn lại của các mẫu cao khô được bảo quản ở điều kiện dài hạn 102 3.41. Hàm lượng cycloalliin còn lại của các mẫu cao khô được bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc 102 3.42. Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống cao khô hành đen 103 3.43. Ảnh hưởng của cao khô hành đen đối với khối lượng cơ thể thỏ 104 3.44. Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, tiểu cầu ở các lô thỏ nghiên cứu 105 3.45. Nồng độ AST, ALT, creatinin và ure của các lô thỏ 106 3.46. Nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 107 3.47. Tỉ lệ % ức chế các dòng tế bào ung thư của các mẫu thử 108 3.48. IC50 của các mẫu nghiên cứu trên bốn dòng tế bào ung thư 108 3.49. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 109 Bảng Tên bảng Trang 3.50. So sánh một số chỉ số sinh hóa lipid máu giữa chuột ở nhóm chứng và mô hình 109 3.51. Chỉ số sinh hóa lipid máu của chuột sau 21 ngày điều trị 110 3.52. Chỉ số lipoprotein cholesterol máu của chuột sau 21 ngày điều trị 111 3.53. Kết quả hoạt tính ức chế α-glucosidase 112 3.54. Chỉ số glucose máu của chuột ở các lô trong đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao khô hành đen 113 3.55. Chỉ số sinh hóa lipid của chuột ở các lô trong đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao khô hành đen 114 3.56. Chỉ số lipoprotein cholesterol máu của chuột ở các lô trong đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao khô hành đen 115 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Hình ảnh hành ta 3 1.2. Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ hành ta 5 1.3. Công thức hóa học của cycloalliin 6 1.4. Quá trình sinh tổng hợp isoalliin 9 1.5. Cơ chế chuyển hóa isoalliin thành cycloalliin 10 1.6. Các hợp chất chính trong tinh dầu hành ta 11 1.7. Cấu trúc của các saponin phân lập từ hành ta 12 1.8. Sơ đồ cấu tạo thiết bị và quy trình phun sấy 31 2.1. Chuồng nuôi và cho chuột uống thuốc 53 3.1. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và dung môi pha mẫu 62 3.2. Đồ thị mối quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ cycloalliin trong khoảng khảo sát 63 3.3. Thân hành ta (Allium ascalonicum L.) 66 3.4. Sắc ký đồ định tính CYC trong hành ta 67 3.5. Sự biến đổi hàm lượng CYC theo thời gian lên men 71 3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm tới hàm lượng CYC trong hành đen 72 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng CYC 74 3.8. Thân hành ta trước và sau khi lên men 77 3.9. Cấu trúc hóa học của các chất 1 - 9 83 3.10. Sắc ký đồ định tính CYC trong hành đen 84 3.11. Sơ đồ quy trình điều chế dịch chiết hành đen 91 3.12. Sơ đồ bào chế cao khô hành đen bằng phương pháp phun sấy 100 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, đây là điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng hết sức thuận lợi cho việc phát triển các vùng chuyên canh trồng hành ta. Cây hành ta (Allium ascalonicum L.) là loại cây quen thuộc chủ yếu được sử dụng phổ biến làm gia vị và thực phẩm. Ngoài ra, còn được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian để điều trị nhiều loại bệnh liên quan đến tim mạch, đau đầu, hen suyễn, côn trùng cắn, giun sán [1]. Ngày nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh hành ta có nhiều tác dụng sinh học như tăng cường miễn dịch, ức chế tế bào ung thư, hạ lipid máu, hạ glucose máu, điều trị rối loạn trào ngược dạ dày [2]. Ngoài ra, những năm gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển công nghệ lên men các loại thực vật họ Hành (Liliaceae) nhằm tìm kiếm và tối ưu hóa các hoạt chất cũng như tác dụng sinh học mới trong đó có các dược liệu điển hình như tỏi và hành. Lên men dược liệu là một quá trình chuyển hóa sinh học dưới tác động của vi sinh vật, enzym hoặc là tự chuyển hóa diễn ra ngay bên trong dược liệu dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm và thời gian. Lên men giúp cho chuyển hóa các chất cao phân tử thành các chất có khối lượng phân tử thấp hơn làm cho chúng trở thành một phân tử mới, không độc, dễ hấp thu hoặc hoạt tính mạnh hơn, thậm chí có hoạt tính hoàn toàn khác với chất ban đầu [3]. Nhiều nghiên cứu đã áp dụng lên men với các dược liệu như lên men trà xanh (Camellia sinensis L.), tỏi (Allium sativum L.) … các sản phẩm sau khi lên men đều tăng hàm lượng hoạt chất và tác dụng sinh học. Đồng thời khắc phục được một số nhược điểm về mùi vị khi sử dụng ở dạng tươi (như các dược liệu họ hành), nhờ đó tạo thêm một nguyên liệu tốt cho sản xuất dược phẩm, thực phẩm, góp phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Hiện nay, các nghiên cứu về lên men hành đen từ hành ta còn ít và chưa 2 toàn diện, từ nghiên cứu về các điều kiện lên men để tối ưu hóa thành phần hoạt chất cũng như cải thiện tác dụng sinh học hay tìm kiếm tác dụng mới; nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa học; nghiên cứu chiết xuất bào chế cao khô dược liệu bằng các công nghệ mới để tiện sử dụng, tăng tính ổn định của các sản phẩm, đến các nghiên cứu về đánh giá tác dụng sinh học của dạng cao khô [4]. Vì vậy, chưa khai thác hết được tiềm năng và giá trị của hành ta là loại cây trồng khá phổ biến tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình lên men tạo hành đen từ hành ta (Allium ascalonicum L.) quy mô phòng thí nghiệm. 2. Xây dựng được quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và bước đầu đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen. 3. Đánh giá được độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen trên thực nghiệm. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA Hành ta có tên khoa học là Allium ascalonicum L., thuộc họ Hành (Liliaceae) [1]. 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, sống 1 - 2 năm, cao 15 - 50 cm. Bản chất hình thái thân hành ta phình to nên thường gọi là củ hành, có kích thước thay đổi, có cạnh, gồm nhiều vẩy thịt mỏng như giấy, có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hành ta có hình dạng trong hơi dẹt, hình bầu dục hoặc hình bầu dục dài, thường có màu đỏ, tím hay màu trắng. Lá dài, hình trụ, nhọn, rỗng, tròn, màu xanh mốc. Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao 20 - 50 cm, rộng, tán hoa hình cầu. Hoa có 6 phiến hoa rời, màu trắng, hồng hay tím nhạt, cuống hoa dài 1 - 1,5 cm [1]. Hình 1.1. Hình ảnh hành ta * Nguồn: Ảnh chụp tại huyện đảo Lý Sơn tháng 8 năm 2017 Phân bố: Cây trồng làm rau ăn từ lâu đời, đầu tiên được trồng ở Tadzhikistan, Afghanistan, Iran sau đó du nhập khắp thế giới. Ở nước ta cây hành ta được trồng ở nhiều nơi như huyện Kinh Môn (tỉnh Hải Dương), huyện đảo Lý Sơn (tỉnh Quảng Ngãi), huyện Ninh Hải (tỉnh Ninh Thuận), thị xã Vĩnh Châu (tỉnh Sóc Trăng), huyện Gò Công Đông (tỉnh Tiền Giang) nhưng 4 nổi tiếng nhất là ở thị xã Vĩnh Châu và huyện đảo Lý Sơn. Thường trồng ở rẫy và vùng đồng bằng. Cây chịu được lạnh vào mùa đông. Vào tháng 7 - 8, lúc lá khô, đào lấy củ đem phơi khô, rồi để trong bóng mát [5]. Bộ phận dùng: Thân hành hay còn gọi là củ hành. 1.1.2. Thành phần hóa học Theo các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của hành ta chủ yếu là các flavonoid, các hợp chất lưu huỳnh và các saponin. 1.1.2.1. Các hợp chất flavonoid Flavonoid trong hành ta chủ yếu thuộc nhóm flavonol như kaempferol, isorhamnetin, dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin monoglucosid, quercetin diglucosid và quercetin tự do. Theo nghiên cứu của Fattorusso E. và cộng sự, sau khi thu nhận cao methanol từ hành ta và phân lập bằng các hỗn hợp dung môi như n-butanol và nước, methanol và nước, thông qua nhiều loại cột khác nhau đã xác định được một số flavonoid và glycosid của chúng như quercetin, quercetin-4'-glucosid (spiraeosid), quercetin-7-glucosid, quercetin-3-4'-diglucosid, isorhamnetin và isorhamnetin-3-4'-diglucosid [2]. Năm 2008, Bonaccorsi P. và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonol glucosid trong một số loài hành, bằng phương pháp HPLC-DAD-ESI-MS-MS. Kết quả cho thấy hành ta có chứa các hợp chất quercetin 3,7,4'-triglucosid, quercetin 7,4'-diglucosid, quercetin 3,4'- diglucosid, isorhamnetin 3,4'-diglucosid, quercetin 3-glucosid, quercetin 4'glucosid và isorhamnetin 4'-glucosid, trong đó quercetin 3,4'-diglucosid và quercetin 4'-glucosid có hàm lượng cao nhất, tương ứng là 516-605 mg/kg và 392-509 mg/kg [6]. Ngoài ra trong hành ta còn có một số glucosid khác của quercetin và isorhamnetin như quercetin-3-rhamnosid (quercitrin) và isorhamnetin-3glucosid [7]. 5 Theo kết quả của các nghiên cứu đã được thực hiện, các hợp chất flavonoid phân lập được từ hành ta được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid trong hành ta STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tên hợp chất TLTK [2], [7] [7] [7] [7] [6] [6] [6] [6] [2] [7] [6] [7] [7] [7] Quercetin (1) Quercetin 4'-O-glucosid (2) Quercetin 3-O-rhamnosid (3) Quercetin 3,4'-O-diglucosid (4) Quercetin 7-glucosid (5) Quercetin 3-glucosid (6) Quercetin 7,4'-diglucosid (7) Quercetin 3,7,4'-triglucosid (8) Isorhamnetin (9) Isorhamnetin 3,4'-O-diglucosid (10) Isorhamnetin 4'-glucosid (11) Isorhamnetin 3-O-glucosid (12) Kaemferol 3-O-glucosid (13) Kaemferol 3,4'-O-glucosid (14) (1) (2) (3) (4) R1 H H Rha Glc R2 H H H H R3 H H H H R4 H Glc H Glc (5) H Glc H (6) Glc H H (13) (14) R1 Glc Glc (7) (8) (9) (10) R1 H Glc H Glc R2 Glc Glc H H R3 H H CH3 CH3 R4 Glc Glc H Glc H (11) H H CH3 Glc H (12) Glc H CH3 H R2 H Glc Hình 1.2. Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ hành ta * Nguồn: Theo Fatturuso E. (2002) [2] 6 1.1.2.2. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hành ta tồn tại dưới 3 dạng chính là cystein sulfoxyd, γ-glutamylcystein và các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi khác [8]. Hợp chất γ-glutamylcystein dễ bị oxy hóa và thủy phân thành thiosulfinat như là S-alky(en)yl-cystein sulfoxyd (ACSO) đại diện là các chất như alliin, isoalliin, methiin và propiin [8], [9], [10]. ACSO và các thiosulfinat khác có thể chuyển đổi thành các hợp chất có chứa lưu huỳnh dễ bay hơi như dithiin, allicin, vinyldithiin, bởi enzym allinase [8], [11]. Tuy nhiên, cycloalliin (CYC) không bị chuyển đổi thành thiosulfinat bởi enzym allinase và vẫn ổn định trong quá trình cắt hoặc nghiền hành ta [12], [13]. * Cycloalliin a) Nguồn gốc - CYC là một sulfoxyd mạch vòng bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm organosulfur, có màu trắng. - CYC có nhiều trong hành ta, hành tây, hẹ và tỏi tây ... - CYC sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng cycloalliin hydroclorid monohydrat [8], [12], [13]. b) Công thức hóa học Hình 1.3. Công thức hóa học của cycloalliin * Nguồn: Theo Ichikawa M. (2006) [12] - Tên IUPAC: (1S, 3R, 5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1oxyd. - Công thức phân tử: C6H11NO3S 7 - Khối lượng mol phân tử: 177,22 đvC [14]. c) Tính chất vật lý - Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng. - Nhiệt độ sôi: 462,55°C. - Điểm chảy: 233,5°C. - Độ tan: Trong môi trường nước là 52,3 g/l. - Khối lượng riêng: 1,4 g/cm3 [14]. - Một đặc điểm quan trọng của cycloalliin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại, có cực đại hấp thụ tại bước sóng 210 nm [15], [16]. d) Độ ổn định - CYC ổn định trong các dung dịch acid, dung dịch kiềm và các dịch sinh học như máu toàn phần, huyết tương ... - CYC ổn định trong dung dịch HCl 0,1M và NaOH 0,1M ở 70°C trong 3 giờ, hầu như không chuyển hóa thành chất khác, lượng thu hồi là hơn 98%. Khi thêm CYC vào máu và huyết tương chuột thì hơn 96% CYC được thu hồi. Trong các thí nghiệm với các chất đồng nhất của gan chuột, hơn 97% CYC không bị phân hủy sau khi ủ ở 37°C, thời gian là 7 giờ và không có chất chuyển hóa nào của CYC được phát hiện [15]. e) Các phương pháp định lượng - Ichikawa M. và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng CYC. Pha động là hỗn hợp acetonitril/nước với tỷ lệ 84:16 (thể tích/ thể tích) và 0,2% acid phosphoric. Điều kiện sắc ký: Cột Shodex Asahipak NH2P-50 2D (150 mm x 2 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25°C, tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 1 µl và detector UV với bước sóng 210 nm [16]. - Lee H. J. và cộng sự cũng định lượng CYC theo phương pháp được mô tả bởi Ichikawa M. và cộng sự với một số thay đổi như cột sắc ký là cột Shodex Asahipak NH2P-50 4E (250 mm x 4,6 mm), pha động là dung dịch A