Tài liệu Kỹ thuật lên men công nghiệp 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP (Bản thảo) TS. HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2016 MỤC LỤC 1. Khái niệm lên men ............................................................................................3 2. Ứng dụng của các quá trình lên men ................................................................4 2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật ........................................................................4 2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật ..........................................................................4 2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật ............................................................4 2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ..................................................................5 2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp .......................................................................8 3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men .................................................8 CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT QUÁ TRÌNH LÊN MEN TRONG 10 1. Phân loại phương pháp lên men ........................................................................ 10 2. Phương pháp lên men mẻ .................................................................................. 10 3. Phương pháp lên men liên tục ........................................................................... 14 4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)................................................. 16 5. Lên men mật độ cao ........................................................................................... 19 CHƯƠNG 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ...................... 20 1. Giới thiệu ............................................................................................................ 20 2. Các công đoạn của qui trình lên men ................................................................. 21 3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men ............................................ 29 CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ....... 34 1. Giới thiệu ............................................................................................................ 34 2. Thiết kế môi trường lên men ............................................................................. 35 3. Các thành phần của môi trường lên men........................................................... 38 4. Đánh giá môi trường .......................................................................................... 52 5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột ............................. 52 6. Xử lý mật rỉ mía đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men ................. 54 CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ........................... 56 1. Mục đích khử trùng trong lên men .................................................................... 56 2. Yêu cầu khi khử trùng ........................................................................................ 57 3. Phương pháp khử trùng..................................................................................... 57 4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt ........................................................ 59 5. Khử trùng môi trường........................................................................................ 62 5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục .......................................................... 63 5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ ................................................................. 66 6. Khử trùng nồi lên men ....................................................................................... 66 7. Lọc không khí ..................................................................................................... 68 CHƯƠNG 6. KIỂM SOÁT NUÔI CẤY ................................................................... 70 1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào ............................................................................ 70 2. Kiểm soát pH ...................................................................................................... 74 3. Kiểm soát nhiệt độ ............................................................................................. 75 4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men .................... 78 5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men .... 82 6. Phá bọt trong quá trình lên men ........................................................................ 85 6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt.............................................................. 85 6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt ................................................................... 86 6.3. Kiểm soát bọt ................................................................................................ 86 7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men .............................................................. 89 1 1. Nồng độ sản phẩm........................................................................................... 89 2. Sản lượng ........................................................................................................ 89 3. Hiệu suất ......................................................................................................... 90 CHƯƠNG 7. TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN ............................................... 95 1. Cải tiến giống ...................................................................................................... 95 2. Cải tiến thiết bị ................................................................................................... 96 3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy ......................... 96 4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho lên men .............................................................................................................................. 102 CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG CHỐNG TẠP NHIỄM TRONG LÊN MEN .................................................................................. 103 1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn .................................................................... 103 2. Phát hiện tạp nhiễm ......................................................................................... 103 3. Nguyên nhân tạp nhiễm ................................................................................... 104 4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men ............................................... 105 5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm .............................................. 106 6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm ........................ 108 CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN ........................... 109 1. Giới thiệu ....................................................................................................... 109 2. Các phương pháp tách tế bào........................................................................... 113 2.1. Phương pháp lắng tủa ............................................................................... 113 2.2. Phương pháp ly tâm .................................................................................. 113 2.3. Phương pháp lọc........................................................................................ 114 2.4. Phương pháp tạo bọt ................................................................................. 118 3. Phương pháp phá màng tế bào ........................................................................ 119 3.1. Phương pháp vật lý ................................................................................... 119 3.2. Phương pháp hóa học................................................................................ 123 - Dùng dung môi........................................................................................... 126 3.3. Phương pháp sinh học-Enzyme ................................................................ 126 4. Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm .................................................. 127 4.1. Phương pháp chiết lỏng - lỏng .................................................................. 127 4.2. Phương pháp thẩm tích ............................................................................. 128 4.3. Phương pháp kết tủa ................................................................................. 130 5. Phương pháp sắc ký tinh sạch sản phẩm lên men ........................................... 134 5.1. Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion Chromatography)............................................................................................. 135 5.2. Sắc kí ái lực (Affinity Chromatography) ................................................... 137 5.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion .............................................................. 138 CHƯƠNG 10. XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN ...................... 141 1. Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý................................... 141 1.1. Giới thiệu ................................................................................................... 141 1.2. Các phương pháp xử lý chất thải............................................................... 143 2. Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp............................ 147 3. Triết lý “không phát thải”................................................................................. 148 CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG ................................................................... 149 1. Bài tập............................................................................................................... 149 2. Bài giải .............................................................................................................. 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 157 PHẦN PHỤC LỤC ................................................................................................ 158 2 CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG 1. Khái niệm lên men Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có nghĩa là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch. Hiện tượng sôi bọt này là do CO2 sinh ra bởi sự phân giải hiếu khí của các loại đường có trong dịch chiết. Tuy nhiên, đối với các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn có ý nghĩa khác. Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự sinh năng lượng bởi quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về phương diện vi sinh vật học trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn. Sự phân giải đường là một quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các phân tử pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị oxy hoá cho các quá trình tiếp theo. Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa các phân tử pyridine nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống cytochrome mà trong đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy nhiên, trong điều kiện kỵ khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn ra cùng với sự khử của một hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian của một quá trình phân giải. Đối với trường hợp về sự hoạt động của nấm men trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự khử của acid pyruvic thành ethanol. Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau và rất đa dạng. Do vậy, thuật ngữ lên men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là một quá trình sinh năng lượng trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho vừa là chất nhận điện tử. Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết đại mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và đã trở thành chất trao đổi của vi sinh vật được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Do vậy, các nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả bất kỳ qui trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật. Việc sản xuất bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men theo cả nghĩa về sinh hoá học và vi sinh vật học. Trong tài liệu này, thuật ngữ lên men được sử dụng theo nghĩa rộng bao hàm cả hai. Cần phân biệt các khái niệm: Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùng Lên men (sinh hoá) Chất hữu cơ Hô hấp hiếu khí Chất hữu cơ Hô hấp kỵ khí Chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ Oxygen Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate) Thuật ngữ lên men mở rộng bao gồm cả ba khái niệm trên. 3 2. Ứng dụng của các quá trình lên men 2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình chính. (1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào vi sinh vật dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn bào). Nấm men bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm 1900 và nấm men được sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong Đại thế chiến thứ I. Tuy nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi sinh vật mới được khai thác mạnh mẽ. Và do vậy từ những năm 1970, các qui trình sản xuất liên tục theo qui mô lớn đã được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh khối vi sinh vật phục vụ cho chăn nuôi và thực phẩm cho con người. 2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội hơn do có thể sản xuất với lượng rất lớn bằng kỹ thuật lên men. Bên cạnh đó, nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật DNA tái tổ hợp nên có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động vật bằng các chủng vi sinh vật. Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1. 1). Quá trình nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ. Ngày nay, người ta sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của các chủng như tăng cường chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp gene. 2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong các phase khác nhau của đường cong tăng trưởng. Ở log phase, sản phẩm được sinh ra chủ yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids, nucleotides, lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm sơ cấp của sự biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase. Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất bằng phương pháp lên men (Bảng 1. 2). Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ đủ cho nhu cầu trong tế bào của chúng. Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật học công nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện nuôi cấy cần thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này. Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng không tổng hợp được trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối 4 với quá trình biến dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp, và phase này gọi là idiophase. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên ở tốc độ thấp, điều này khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase chiếm ưu thế hơn trophophase. Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng thứ cấp, ví dụ như đối với trường hợp của vi khuẩn Enterobacteriaceae thì không tìm thấy có sản phẩm thứ cấp. Đôi khi rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp của những hợp chất nhất định có thể thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy. Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được tranh luận nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các chất trao đổi trung gian nhiều hơn. Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, là các enzyme ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều chất có dược tính. Do vậy, sản phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ sở của nhiều qui trình lên men khác nhau. Cũng giống như trường hợp đối với các chất trao đổi sơ cấp, các chủng vi sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp với nồng độ thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và hệ thống phản hồi. 2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứng dụng của công nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc sống của con người. Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế bào vi sinh vật và các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại. Có nhiều chủng vi sinh vật khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống biểu hiện bao gồm E.coli, Sac. cerevisiae và các nấm sợi. Các sản phẩm được sinh ra từ các chủng được biến đổi di truyền gồm: interferon, insulin, albumin của huyết thanh người, các nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và somatostatin của bò. Khi thiết kế các hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp cần chú ý đến một số vấn đề: sự tiết của sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp trong toàn bộ tiến trình lên men, cũng như tối ưu hóa biểu hiện của gene ngoại. 5 Bảng 1. 1. Các ứng dụng của enzyme trong thương mại. Công nghiệp Ứng dụng Công nghiệp bánh mì Giảm độ nhớt trong quá trình nhào bột, tăng cường độ mềm và xay bột mại, và duy trì độ tươi của bột Cải thiện cấu trúc, giảm thời gian trộn, tăng thể tích của ổ Công nghiệp bia bánh mì Tăng cường độ nghiền nhừ Chống lại ảnh hưởng của khí lạnh Cải thiện độ lọc tinh Công nghiệp ngũ cốc Xử lý các thực phẩm ăn nhanh Trong chế biến socola Sản xuất các dịch si-rô Coffee Lên men hạt cà-fé Trong xay café Làm chế phẩm cà-fé cô đặc Sản xuất các lọai bánh kẹo Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao Siro bắp Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp Sản xuất glucose từ siro bắp Sản xuất siro fructose Sản xuất dịch thủy phân protein Chế biến sữa On định sửa bay hơi Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng động lạnh Sản xuất sữa thô Tách lọai glucose Trong chiên-xào Làm trong các loại dịch Nước ép trái cây Loại oxygen Sử dụng làm chất tẩy Giặt ủi Thuộc da Chống mọc lông Thịt Làm mềm mại Amylase Enzyme Protease Amylase Protease b-glucanase Amylase Pectinase Pectinase Pectinase, hemicellulase Invertase, pectinase Amylase Amylase Amyloglycosidase Glucoseisomerase Protease Protease Lactase Protease Glucose oxidase Pectinase Glucose oxidase Protease, lipase Protease Protease Nguồn gốc Nấm Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm Nấm/vi khuẩn Nấm Nấm Nấm/vi khuẩn Nấm Vi khuẩn Nấm Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm Nấm men Nấm/vi khuẩn Nấm Nấm Nấm Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm 6 Trong y dược Hổ trợ tiêu hóa Chống đông máu Trong các thử nghiệm lâm sàng Tráng ảnh Thu hồi bạc từ film đã sử dụng Dịch thủy phân protein Trong sản xuất dịch thủy phân Tạo sự ổn định Chế biến thức uống Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi Công nghiệp dệt Rau quả Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ Amylase, protease Steptokinase Numerous Protease Proteases Glucose oxidase, catalase Amylase Pectinase, amylase, cellulase Nấm Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm Vi khuẩn Nấm Bảng 1. 2. Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại Chất trao đổi sơ cấp Ethanol Citric acid Glutamic acid Lysine Nucleotides Phenylalanine Polysaccharides Vitamins Ý nghĩa thương mại Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu. Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Chất tăng vị Chất hổ trợ thực phẩm Chất tăng vị Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo Chất hổ trợ thực phẩm 7 2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một cấu trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính đặc trưng vị trí và lập thể cao. Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình hóa học và cho phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở những vị trí đặc trưng nhất định trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến các hoá chất. Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử hydrogen, phản ứng oxy hoá, phản ứng hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng khử carboxyl, amin hoá, khử amin, phản ứng chuyển vị. Các quá trình chuyển hóa nhờ vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa là thực hiện ở nhiệt độ và áp suất phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như các kim loại nặng. 3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô tả trong Bảng 1. 3. Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn 1900 được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới hạn ở dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn. Bảng 1. 3. Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men. 8 9 Dấm Alcohol Sản phẩm chính - Bằng gỗ, đạt đến 1500 barrels - Bằng đồng thau Bằng các thùng phuy, khay hay trong các lớp lọc chảy dòng Loại bồn Phương pháp nuôi cấy Dạng mẻ, fed-batch, hoặc Rất quan trọng liên tục. Phát triển nuôi cấy liên tục dạng chảy tràn để nuôi cấy tế bào động vật Rất quan Sử dụng kỹ trọng thuật tái tổ hợp Rất quan Sử dụng kỹ trọng thuật di truyền Sử dụng giống thuần nhất Chọn lọc chủng lên men dấm tốt Nuôi cấy liên tục với việc hồi lưu môi trường nuôi Rất quan trọng cấy Hầu như không có Không có Các thiết Chọn lọc giống bị pilot Nấm men thuần Không có nhất sử dụng ở Carlberg (1886) Sử dụng các Trở nên chương trìnhđột thông biến và chọn lọc dụng cơ bản Hầu như không kiểm soát Hầu như không kiểm soát Hầu như không kiểm soát Kiểm soát chất lượng - Thông thường là dạng mẻ và fed-batch. - Phát triển nuôi cấy liên Rất quan trọng tục cho lên men bia và một vài chất trao đổi sơ cấp Dạng mẻ và hệ thống fed- batch Dạng mẻ Sử dụng thiết bị đo nhiệt độ, báo mực, Dạng mẻ trao đổi nhiệt Kiểm soát quá trình Bồn bằng kim loại 200m3 cho sản xuất acetone/butanol Nấm men bánh mì, Sử dụng đầu dò pH, Sử dụng hệ thống phân phối 2. 1900-1940 glycerol, citric acid, lactic đầu dò kiểm soát Khuấy trộn được sử dụng nhiệt độ acid, acetone/butanol trong trường hợp bồn lên men có kích thước nhỏ. Pennicillin, Streptomicin Sử dụng đầu dò pH, các kháng sinh khác DO có thể thanh Các bồn lên men có trang bị hệ gibberelin, trùng được. Sử dụng thống sục khí, vận hành trong 3. 1940 đến nay amino acid, các thiết bị kiểm điều kiện vô trùng- đúng nghĩa soát mà sau này có nucleotides, bồn lên men các chất chuyển hoá, thể kiểm soát trên enzyme máy tính Sử dụng máy tính Sinh khối đơn bào, Các bồn lên men chịu áp lực, kiểm 4. 1964- nay protein, hydrocarbon, các được thiết kế để giải quyết vấn soát các thông số chất phục vụ chăn nuôi đề trao đổi khí, nhiệt độ vận hành Sản xuất các protein khác Sử dụng nồi lên men được phát Phát triển các điều dòng (heterologous) bởi vi triển trong giai đoạn 3, 4. Và kiện kiểm soát và sinh vật và tế bào động vật, phát triển thêm nồi nuôi cấy tế đầu dò như trong 5. 1979- nay Sản xuất kháng thể đơn giai đoạn 3, 4 bào động vật dòng bởi tế bào động vật 1. Trước 1900 Giai đoạn ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHƯƠNG 2. 1. Phân loại phương pháp lên men Tuỳ theo đặc điểm mà việc phân loại lên men có khác nhau 1. Theo tính chất môi trường: lỏng; rắn; bán rắn 2. Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí; lên men kỵ khí 3. Theo trạng thái: trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); trạng thái động (có khuấy trộn/sục khí) 4. Theo mức độ kiểm soát của qui trình: có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất, pH,…); không kiểm soát (tự nhiên) 5. Theo qui trình lên men: lên men theo mẻ (batch); lên men theo dạng liên tục (continuous); lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ sung) Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên men theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh giá đối với các phương pháp lên men còn lại. 2. Phương pháp lên men mẻ Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ chất dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn phase khác nhau. Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong môi trường mới. Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn thời gian của phase này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm quan tâm. Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích nghi, tăng trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b). Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình toán học sau: dx/dt = µx (2.1) Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng (hr-1), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong chu kỳ tăng trưởng. 10 Xo, So Moâi tröôøng X, Sr Hình 2. 1. Hệ thống lên men theo phương pháp mẻ. Từ phương trình trên ta có: dx/x = µdt  t t to to ∫ dx / x = µ ∫ dt Ln(noàng ñoä teá baøo) (2.2)  (ln xt - ln x0) = µ (t - t0) x0: lượng sinh khối ban đầu, xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ). 0.8 0.6 (a) (b) (d) (c) 0.4 0.2 Thôøi gian nuoâi caáy (giôø) 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 Hình 1. 1. Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi nuôi cấy dạng mẻ. (a) lagphase, (b) log- phase, (c) phase ổn định, (d) phase suy vong. Trong log- phase, giàu dinh dưỡng, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong những điều kiện tối thích nhất định sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn vào nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy và thành phần các sản phẩm do chính hoạt động của vi sinh vật tạo ra trong môi trường. Nếu duy trì việc bổ 11 sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy thì tăng trưởng sẽ vẫn đạt được ở tốc độ cao. Bảng 2. 1. Một số giá trị µmax của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy đặc trưng. Chủng vi sinh vật µmax (giờ-1) Nguồn tham khảo Vibrio natriegents Methylomonas methanolytica Aspergillus nidulans Penicilium chrysogenum Fusarium graminearum Schwabe Nuôi cấy tế bào thực vật 4,24 0,53 0,36 0,12 0,28 0,01-0,046 Eagon (1961) Dostalek et al (1972) Trinci (1969) Trinci (1969) Trinci (1992) Petersen & Alfermann (1993) Nuôi cấy tế bào động vật 0,01-0,05 Lavery (1990) Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2 theo phương trình: N = N0 × 2n (2.3) trong đó, N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ.  lg(N/N0) = n.lg2  n = 3,32 × lg(N/N0) (2.4) Thời gian thế hệ tg (2.5) tg = t/n với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ. Đối với vi khuẩn tg thường khoảng 20-60 phút, đối với nấm men tg thường khoảng 1-3 giờ. Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy k = 1/g = n/t (2.6) Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có thể mô tả bằng phương trình: x = Y×(si - sr) (2.7) trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng lại khi sr = 0 hoặc khi mà trong môi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại cho chủng. Giá trị Y nhằm giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một cơ chất thành sinh 12 khối vi sinh vật. Do vậy có thể dùng Y để tính toán lượng cần thiết của một cơ chất khi muốn tổng hợp một lượng sinh khối nhất định. Hiệu suất Y không phải là một hằng số ổn định mà thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH, hàm lượng oxygen hoà tan, sự giới hạn của các cơ chất,... Sự suy giảm tăng trưởng phụ thuộc vào cơ chất giới hạn khi cạn kiệt trong môi trường có thể được mô tả theo phương trình (theo Monod, 1942): (2.8) µ = µmax× sr/(Ks + sr) Trong đó Ks là hằng số sử dụng cơ chất, Hình 2. 2. Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau (Bảng 2. 2). Khi sr = Ks thì µ = 1/2µmax. Khi µ = 0, bước vào giai đoạn phase ổn định. Đây là giai đoạn chính của việc sản xuất các chất trao đổi. Bảng 2. 2. Một số giá trị Ks của một số chủng vi sinh vật thông thường. Chủng vi sinh vật Cơ chất Ks (mg/dm3) E.coli Glucose Sac. cerevisiae Glucose Noàng ñoä cô chaát giôùi haïn Pseudomonas sp. Methanol 6,8.10 -2 25,0 0,7 Tham khảo Shehata and Marr (1971) Pirt and Kurowski (1970) Harison (1973) si Ks sr Thôøi gian nuoâi caáy Hình 2. 2. Sơ đồ biểu thị trị số Ks. Sự thay đổi hàm lượng các chất trao đổi có thể biểu diễn: dp/dt = ρx (2.9) trong đó, p là nồng độ sản phẩm, ρ là tốc độ sinh tổng hợp đặc trưng. Mặt khác, sự tạo thành sản phẩm tùy thuộc vào hoạt tính của chủng (hiệu suất trên một đơn vị tế bào): dp/dx = Yp/x (2.10) với Yp/x là hiệu suất tạo sản phẩm trên một đơn vị sinh khối (năng suất sản xuất). 13 Từ hai phương trình trên ta có: dx/dt = ρx/Yp/x mà dx/dt = µx Do vậy ta có: ρ = µ × Yp/x (2.11) Như vậy tốc độ sản xuất đặc trưng phụ thuộc vào µ, và đạt giá trị cao nhất khi µ = µmax. 3. Phương pháp lên men liên tục Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase, log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase được duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được lặp đi lặp lại cho đến khi nồi lên men đầy. Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt thêm hệ thống thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở mức độ ổn định cao nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu. Ta có: D = F/V (2.12) Trong đó, F: tốc độ nạp liệu (KL/hr), V là thể tích dịch lên men trong nồi (KL), D là độ pha loãng (giờ-1). Sự thay đổi mật độ tế bào trong dịch lên men có thể biểu diễn: dx/dt = growth – output dx/dt = µx – Dx (2.13) Trong điều kiện ổn định, nồng độ tế bào trong dịch không đổi, dx/dt = 0. Lúc đó: µ = D (2.14) Tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng và như vậy trong nuôi cấy liên tục thì µ ≤ µmax. Trong một số trường hợp, người ta dùng D để kiểm soát µ. Tăng trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy liên tục được điều khiển bởi các chất trong thành phần của môi trường nuôi cấy. Lên men theo cách này còn được gọi là chemostat. Theo Monod ta có: µ = µmax. s /(Ks + s ) (2.15) Ở trạng thái cân bằng, D = µ, nên D = µmax. s r/(Ks + s r), s r: nồng độ cơ chất ở trạng thái cân bằng.  (2.16) s = Ks × D/(µmax - D) Như vậy, nồng độ cơ chất còn lại phụ thuộc vào độ pha loãng. Trong thực tế, điều này xảy ra do sự tăng trưởng của tế bào làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng khi mà 14 nguồn cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha loãng. Nếu tốc độ sử dụng cơ chất của vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng trưởng tế bào thì một số đặc điểm sau sẽ xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha loãng, và do vậy tế bào sẽ bị chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng được sinh ra. Điều này gây nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men. Nồng độ cơ chất trong nồi lên men sẽ tăng dần vì trong nồi lên men còn ít tế bào hơn để sử dụng. Khi nồng độ cơ chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao hơn tốc độ pha loãng và khi đó, sinh khối tăng dần lên và trong trường hợp này thì trạng thái ổn định mới được thiết lập. x, So, F x, So, F Moâi tröôøng Moâi tröôøng x, Sr, F x, Sr, F Theå tích dòch, V (B) (A) S, F x, So, F Moâi tröôøng x, Sr, F Theå tích dòch, V (C) Hình 2. 3: Sơ đồ hệ thống lên men liên tục. (A): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, không hồi lưu sinh khối; 15 (B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối; (C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng. Do vậy, người ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới hạn dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ (sub- µmax). Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng ( x ) có thể được biểu diễn: x = Y × (si + sf - sr) (2.17) Phương trình tạo sản phẩm: Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);  dp/dt = ρ.x – D.p (2.18) Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0. Khi đó: (2.19)  p = ρ × x /D trong đó p là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định. Trong nuôi cấy liên tục, người ta còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau: 1. Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa ngay vào một hệ thống lên men khác. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men. 2. Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: Dịch chiết ra trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn. Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng cường được sản lượng của hệ thống. Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế bào rồi cho hồi lưu vào hệ thống. Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế bào theo dịch chiết và vấn đề chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là một trở ngại lớn. 4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch) Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá trình nuôi cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên men. Các cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn. Đối với cơ chất giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban đầu, hoặc (3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc. Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2) 16 gọi là mẻ-bổ sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ-bổ sung cố định thể tích. 4.1. Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem như hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất. Sinh khối tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình: xt = xo + Y(si - sr) (2.20) trong đó xo là nồng độ giống nạp vào hệ thống. Khi sr = 0 và xt = xmax; do x0 << xmax (2.21)  xmax = Y × si Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ môi trường vừa mới được bổ sung sẽ được sử dụng ngay (ds/dt = 0), và ta có: F.si = µ × (X/Y) (2.22) với X = x × V. F F xt, Sr Vfeed Vo, xo, So (A) (B) Hình 2. 4. Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung. (A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích (B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu như không tăng (dx/dt = 0), do vậy µ = D. Đây được xem như là trạng thái cân bằng. Khi thể tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy: D = F/(V0 + F × t) (2.23) 17 Theo phương trình Monod, Khi sr giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên. Tuy nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si >> Ks nên trong thực tế sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng ổn định thì D < µmax và Ks << si. Sự thay đổi nồng độ sản phẩm trong hệ thống này tương tự như trong nuôi cấy liên tục được biểu diễn theo cân bằng: dp/dt = ρx – D.p (2.24) Ở trạng thái cân bằng tức là lượng sản phẩm sinh ra cân bằng với độ pha loãng do nạp dịch bổ sung vào thì nồng độ sản phẩm trong hệ thống sẽ không thay đổi, dp/dt = 0, khi đó: p = ρ.x/D (2.25) 4.2. Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp nuôi cấy mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất giới hạn đạt đến một mức nhất định. Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ cao, không làm thay đổi đến thể tích dịch lên men. Động học trong hệ thống này được mô tả như sau: dx/dt = G.Y (2.26) trong đó G là tốc độ nạp cơ chất. Do dx/dt = µx, nên: G.Y = µx  µ = G.Y/x (2.27) Nếu GY/x < µmax thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc đó ds/dt = 0. Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên: (2.28) xt = x0 + G.Y.t Trong đó x0, xt là nồng độ tế bào khi bắt đầu và sau khi vận hành hệ thống mẻ-bổ sung được t giờ nuôi cấy. Khi x tăng lên, µ giảm dần. Nồng độ của cơ chất giới hạn hầu như không thay đổi, sinh khối tăng dần và nồng độ các chất không giới hạn trong môi trường giảm dần. Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau: dp/dt = ρ.xt (2.29) dp/dt = ρ.(x0 + G.Y.t) (2.30) 18 5. Lên men mật độ cao Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra trong quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn bị ban đầu. Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ tăng trưởng là tốt nhất. Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong trường hợp nuôi cấy mẻ-bổ sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để thể tích dịch lên men hoặc không thay đổi hoặc thay đổi ít. Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay ngoại bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ sản xuất đặc trưng (ρ) nhất định: ρ = (P/X)/t (2.31)  P = ρ.X.t (2.32) trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng sinh khối tham gia sản xuất. Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần phải tăng X. X = x.V (2.32) với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men. Do thể tích dịch lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng nồng độ tế bào x trong quá trình lên men. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có thể tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề sau. 19