Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng mangiferin trong cây tri mẫu bằng phương pháp hplc

có cĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN HOÀNG MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN TRONG CÂY TRI MẪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: TRẦN HOÀNG MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN TRONG CÂY TRI MẪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2017.Y Người hướng dẫn : TS. Hoàng Lê Sơn ThS. Nguyễn Xuân Bách Hà Nội - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hoàng Lê Sơn – Cán bộ Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu và ThS. Nguyễn Xuân Bách – Giảng viên Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hướng, tận tâm chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành đề tài Khóa luận của mình. Các thầy không chỉ truyền đạt kiến thức học thuật cho em mà còn cung cấp, trang bị thêm cho em thêm rất nhiều kĩ năng quan trọng khác trong cuộc sống. Em xin cảm ơn tới chị Ngô Thị Lan Hương và các Quý thầy, cô, các anh chị trong Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn của Viện Dược liệu đã tạo điều kiện và chỉ dẫn cho em rất nhiều trong quá trình thực hiện Khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Quý thầy cô trong Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cũng như các cán bộ, giảng viên trực thuộc Trường Đại học Y Dược đã tận tình chỉ dạy, giúp đỡ cho em trong suốt 5 năm học tập và nghiên cứu chuyên ngành Dược học tại nơi đây. Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, các anh, chị và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng như nghiên cứu, thực hiện Khóa luận của mình. Trong thời gian thực hiện Khóa luận, dưới sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô, em luôn nỗ lực học tập, nghiên cứ để hoàn thành Khóa luận này. Tuy nhiên do kiến thức còn hạn hẹp, thời gian nghiên cứu chưa được nhiều cũng như do ảnh hưởng của tình hình dịch bệnh nên Khóa luận của em không thể tránh khỏi được những thiết sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của Quý thầy cô để Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ của em được hoàn thiện hơn. Lời cuối, em xin phép kính chúc các Quý thầy, cô và mọi người luôn hạnh phúc, khỏe mạnh và thành công hơn nữa trong cuộc sống! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Trần Hoàng Minh Đức DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Aβ AChE AGEs BC BP (GO) CC CC (GO) COX-2 DC DN ERK1/2 GO HĐC HIF HPLC IC50 KEGG LOD LOQ MAPK MF (GO) NF-κB PPI RAGE Nghĩa tiếng anh Amyloid beta-peptide Acetylcholinesterase Advanced glycation end products Betweenness Centrality Biological Process Closeness Centrality Cellular Component Cyclooxygenase-2 Degree Centrality Diabetic Neuropathy extracellular signal‑regulated protein kinase Gene Ontology Hypoxia-inducible factor High performance Liquid Chromatographic Half-maximal inhibitory concentration Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Limit of Detection Limit of Quantitation Mitogen-activated protein kinase Molecular function Nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B Protein – Protein interacion network Receptor for advanced glycation end products Nghĩa tiếng việt Sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của quá trình glycation nâng cao Thông số Betweenness Quá trình sinh học Thông số Closeness Thành phần tế bào Thông số Degree Biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường Tín hiệu ngoại bào điều hòa protein kinase Bản thể học gene Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa Yếu tố cảm ứng khi thiếu oxy Sắc ký lỏng hiệu năng cao Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Bách khoa toàn thư về gene và bộ gene của Kyoto Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Protein kinase hoạt hóa mitogen Chức năng phân tử Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa của các tế bào B hoạt động Mạng tương tác protein – protein Thụ thể của các sản phẩm cuối trong quá trình glycation nâng cao Từ viết tắt ROS VEGF TNF-α Nghĩa tiếng anh reactive oxygen species Vascular endothelial growth factor Tumor Necrosis Factor Alpha Nghĩa tiếng việt Các loại oxy phản ứng Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu Yếu tố hoại tử khối u alpha DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Vị trí của Tri mẫu trong hệ thống phân loại thực vật. ................................2 Bảng 1.2. Các thể lâm sàng của DN và các đặc điểm của chúng. ............................15 Bảng 2.1. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. .................................................24 Bảng 2.2. Dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu. .......................................24 Bảng 2.3. Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu. ...............................................25 Bảng 2.4. Chương trình rửa giải hệ thống HPLC. ....................................................29 Bảng 3.1. Các thông số đánh giá với chất chuẩn Mangiferin trên HPLC. ...............41 Bảng 3.2. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của Mangiferin. .......43 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống. ...............................................44 Bảng 3.4. Bảng kết quả độ lặp lại. ............................................................................44 Bảng 3.5. Kết quả độ thu hồi đối với Mangiferin. ....................................................45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình vẽ mô tả cây Tri mẫu bao gồm thân rễ (1); cành hoa (2); hoa (3); thân cây (4); nhị hoa và tràng hoa (5); búp hoa (6). ...........................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các saponin steroid trong cây Tri mẫu. ....................5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong cây Tri mẫu. .............................6 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các alkaloid trong cây Tri mẫu. ...............................7 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các phenylpropanoid trong cây Tri mẫu. .................8 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các acid hữu cơ có trong cây Tri mẫu......................8 Hình 3.1. Mạng PPI Tri mẫu – DN bao gồm Mạng (A) được xây dựng từ các gene tiềm năng thu được từ cơ sở dữ liệu STRING-db gồm 49 nốt và 212 cạnh. Trong đó, các cạnh đều được tô màu theo loại tương tác đã được xác minh (biểu diện trong hình). Mạng (B) được đưa từ cơ sở dữ liệu STRING-db vào phần mềm Cytoscape 3.8.2 gồm 45 nốt và 212 cạnh. Mạng (C) được lọc từ mạng (B) dựa trên các nốt có giá trị DC, BC, CC lớn hơn trung bình, mạng gồm 15 cạnh và 85 cạnh. Nốt có giá trị DC càng lớn thì càng có màu đỏ hơn và kích thước lớn hơn....................................34 Hình 3.2. Biểu đồ phân tích chức năng GO các gene tiềm năng của Tri mẫu trong điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường. Theo thứ tự hình (A) là biểu đồ của các chức năng GO-BP, hình (B) là biểu đồ của các chức năng GOCC và hình (C) là biểu đồ của các chức năng GO-MF. Mỗi biểu đồ bao gồm 20 chức năng quan trọng nhất dựa trên số gene tiềm năng.....................................................35 Hình 3.3. Biểu đồ cột thể hiện 46 con đường sinh hóa có giá trị DC, BC và CC lớn hơn giá trị trung bình trong mạng HĐC. Trục x thể hiện số gene tham gia và các con đường sinh hóa này. Các con đường sinh hóa có giá trị p-value càng nhỏ cho màu sắc đậm hơn. ....................................................................................................................36 Hình 3.4. Sơ đồ con đường tín hiệu AGE-RAGE trong các biến chứng đái tháo đường (AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, hsa04933), các nốt được bôi đỏ là các gene đích của thành phần hoạt chất Tri mẫu trong điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường. ...........................................................37 Hình 3.5. Mạng Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa (HĐC) gồm 168 nút và 3321 cạnh. Trong đó, nút kim cương màu xanh lá đại diện cho cây Tri mẫu, 73 nút tròn tím đại diện cho 73 hoạt chất, 48 nút tròn đỏ đại diện cho 48 đích tiềm năng và 46 nút chữ V vàng đại diện cho 46 con đường sinh hóa. Mỗi nhóm nút có sự thay đổi kích thước theo số cạnh liên kết, mỗi cạnh đại diện cho tương tác giữa 2 nút. ................39 Hình 3.6. Kết quả biểu diễn cơ chế liên kết docking 3D (trên) và 2D (dưới) của các hợp chất A12 (3,5,7-Trihydroxy-4'-methoxyl-8-prenylflavone-3-O- rhamnopyranoside) với protein 2H44 (Hình A, gene PDE5A, docking score=-13,44) và protein 5KCV (Hình B, gene AKT1, docking score=-13,07); A44 (Mangiferin) với protein 6V63 (Hình C, gene ACTB, docking score=-13,70) và protein 2H44 (Hình D, gene PDE5A, docking score=-13,56); A51 (Neomangiferin) với protein 6V63 (Hình E, gene ACTB, docking score=-14,45) và protein 3O96 (Hình F, gene AKT1, docking score=-14,28). Mô hình tương tác 2D biểu diễn các liên kết trực tiếp giữa phối tử và protein (liên kết hydro, liên kết ion) thông qua các đường nét đứt, tương tác kỵ nước được biểu diễn qua các nét màu xanh lá. ....................................40 Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Mangiferin (A), mẫu trắng (B) và mẫu dịch chiết Tri mẫu (C) tại bước sóng λ 257 nm. ........................................................................42 Hình 3.8. Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic của Mangiferin phân tích bằng HPLC. ............................................................................43 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về cây Tri mẫu (A. asphodeloides Bunge) .....................................2 1.1.1. Tên khoa học .............................................................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật, bộ phận sử dụng và công dụng ..................................2 1.1.3. Thành phần hóa học ..................................................................................4 1.1.4. Tác dụng sinh học .....................................................................................9 1.2. Tổng quan về biến chứng trên thần kinh trung ương gây ra do đái tháo đường ...............................................................................................................................13 1.2.1. Khái quát về biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường .13 1.2.2. Dịch tễ học và hậu quả ............................................................................13 1.2.3. Sinh lý bệnh biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường .13 1.2.4. Đặc điểm và các thể lâm sàng của biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường ..............................................................................................14 1.2.5. Các thuốc điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường ...........................................................................................................................16 1.3. Tổng quan một số phương pháp định lượng hoạt chất trong dược liệu Tri mẫu ...............................................................................................................................19 1.3.1. Định lượng Mangiferin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo dược điển Trung Quốc (2020) ...........................................................................19 1.3.2. Định lượng hoạt chất trong Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng theo dược điển Anh (2018) .......................................................................................19 1.3.3. Định lượng hoạt chất trong Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng theo dược điển Hong Kong (2005) ...........................................................................20 1.4. Khái quát một số khái niệm được sử dụng.....................................................20 1.4.1. Phương pháp network pharmacology .....................................................20 1.4.2. Phương pháp Docking .............................................................................21 1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...................................22 1.4.4. Thẩm định quy trình phân tích ................................................................22 Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................24 2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất, phần mềm ..............................................24 2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................24 2.2.2. Dung môi, hoá chất .................................................................................24 2.2.3. Các phần mềm .........................................................................................25 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................25 2.3.1. Dự đoán cơ chế và hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị DN 25 2.3.2. Định lượng hợp chất Mangiferin trong Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..............................................................................28 Chương 3 – KẾT QUẢ .......................................................................................... 32 3.1. Dự đoán cơ chế và hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị DN .......32 3.1.1. Sàng lọc các thành phần hoạt chất của cây Tri mẫu và các protein đích liên quan đến biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường .................32 3.1.2. Sử dụng phương pháp docking trong xác định các protein tiềm năng có liên quan đến DN ..............................................................................................32 3.1.3. Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein-protein (PPI, Proteinprotein interaction network) ..............................................................................32 3.1.4. Phân tích chức năng GO và con đường sinh hóa KEGG của các đích tiềm năng ...................................................................................................................34 3.1.5. Xây dựng và phân tích mạng Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa (HĐC) ................................................................................................................37 3.2. Định lượng hợp chất Mangiferin trong Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .............................................................................................41 3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ........................................................41 3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng .......................................................42 Chương 4 – BÀN LUẬN........................................................................................ 46 4.1. Về phương pháp network pharmacology .......................................................46 4.2. Về quy trình định lượng Mangiferin bằng HPLC ..........................................49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 50 Kết luận .................................................................................................................50 Đề xuất ..................................................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Bệnh đái tháo đường là một vấn đề sức khỏe toàn cầu gây ra nhiều biến chứng tại các cơ quan khác nhau của cơ thể. Trong đó, biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường (DN, Diabetic neuropathy) là một trong những biến chứng phổ biến nhất gặp trên khoảng 50% người mắc.1 Biến chứng này ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân do gây ra tình trạng đau đớn kéo dài, loét bàn chân, suy nhược, mất khả năng điều hòa và phối hợp vận động, dễ bị ngã, và hàng loạt các vấn đề nghiêm trọng khác. Hiện nay, các liệu pháp điều trị và kiểm soát dành cho người mắc DN vẫn còn rất hạn chế và chưa được đẩy mạnh. Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) thuộc họ Măng tây (Asparagaceae) được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một thuốc hỗ trợ điều trị đái tháo đường, chống viêm, chống kết tụ tiểu cầu và chống trầm cảm. Tri mẫu chứa nhiều thành phần hoạt chất khác nhau bao gồm các saponin steroid, alkaloid, flavonoid và phenylpropanoid. Gần đây nhiều nghiên cứu trên dịch chiết Tri mẫu được chứng minh có tác dụng đối với các bệnh liên quan đến thần kinh, đái tháo đường, chống viêm… Trong đó, khả năng bảo vệ và điều trị các bệnh trên thần kinh cùng tác dụng hạ đường huyết có thể xem như một gợi ý về khả năng điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do đái tháo đường. Tuy nhiên bằng chứng về cơ chế trong điều trị biến chứng này còn chưa rõ ràng. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Mangiferin trong cây Tri mẫu bằng phương pháp HPLC” được tiến hành với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do bệnh đái tháo đường bằng phương pháp network pharmacology; 2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Mangiferin (thành phần hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị DN, thu được từ mục tiêu 1) trong cây Tri mẫu bằng phương pháp HPLC. 1 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Tri mẫu (A. asphodeloides Bunge) 1.1.1. Tên khoa học Tri mẫu có tên khoa học là Anemarrhena asphodeloides Bunge. Tên khác: Zhimu (Trung Quốc), anémarrhène (Pháp), common anemarrhena (Anh).2 Bảng 1.1. Vị trí của Tri mẫu trong hệ thống phân loại thực vật. 3,4 Phân loại khoa học Viridiplantae Giới: Ngành: Streptophyta Magnoliopsida Lớp: Asparagales Bộ: Họ: Chi: Loài: Asparagaceae Anemarrhena Anemarrhena asphodeloides 1.1.2. Đặc điểm thực vật, bộ phận sử dụng và công dụng a) Đặc điểm thực vật Tri mẫu là loại cây thân thảo mọc thẳng lâu năm với thân rễ mọc ngang và dày, chiều cao khoảng 1 m, chiều rộng 0,5 cm - 1,5 cm và được bao phủ bởi các bẹ. Các lá có dạng cỏ, có thể dài tới 60 cm và rộng 2 cm, thu hẹp dần thành dạng afiliform ở phần xa. Thân cây mọc thẳng và dài hơn lá, lá bắc có đầu nhọn, thuôn dài, hình trứng, nhỏ và có hoa lưỡng tính. Các hoa thường không có hoặc có cuống ngắn, thường mọc đơn độc hoặc thành cụm 2, cụm 3. Bao hoa hẹp hình phễu dài tới 5 – 10 mm. Hoa có 3 nhị, bao phấn đa năng và bầu nhụy có 3 ô. Hoa thường có màu hồng, tím hoặc trắng. Quả nang hình elip hẹp với mỏ ngắn ở đỉnh.5 Hình vẽ mô tả và hình ảnh của cây Tri mẫu được biểu diễn ở hình hình 1.1. b) Bộ phận dùng Thân rễ được loại bỏ rễ con, có thể phơi hay sấy khô.2 c) Thu hái, chế biến Tri mẫu thường sử dụng thân rễ. Người ta thường đào lấy thân rễ vào tháng 34, rửa sạch phơi hay sấy khô.6 2 Hình 1.1. Hình vẽ mô tả cây Tri mẫu bao gồm thân rễ (1); cành hoa (2); hoa (3); thân cây (4); nhị hoa và tràng hoa (5); búp hoa (6). d) Công dụng Theo y học cổ truyền, Tri mẫu có tính lạnh, vị ngọt, đắng, quy vào các kinh phế, thận, vị. Tri mẫu có tác dụng thanh nhiệt, tả hỏa, trừ phiền chỉ khát, nhuận tảo. Chủ tri: Nhiệt bệnh có sốt cao khát nước, phế thận âm hư có cốt chưng, trào nhiệt, nội nhiệt tiêu khát, ruột ráo táo bón. Một số đơn thuốc kinh nghiệm có Tri mẫu: Chữa bụng chướng to, cứng rắn, chân tay nhỏ, ăn uống không được: Uống bài thuốc ngũ linh tâm gồm các vị Tri mẫu, đan sâm, độc hoạt, hải tảo, qui vũ tiến, tần bông (hai vị sau chưa xác định) thì thấy lợi tiểu tiện, ăn uống được bệnh dần dần khỏi (theo sách thiên kim ngoại đài). Chữa bệnh viêm phổi: Tri mẫu 5 g, tang bạch bì 10 g, mạch môn đông 8 g, nước 600 ml, sắc còn 200 ml, chia 3 lần uống trong ngày. Dương vật cường luôn: Tri mẫu, hoàng bá, xa tiền, mộc thông, thiên môn đông, sinh thảo (cam thảo sống) các vị bằng nhau, mỗi vị 4 g sắc uống. Có mang động thai: Tri mẫu 80 g, tán nhỏ, viên với mật bằng hạt ngô, mỗi ngày uống 20 viên, chiêu với nước cháo. 3 Hắc lào: Tri mẫu mài với dấm bôi lên.6 1.1.3. Thành phần hóa học Dựa trên nhiều nghiên cứu khác nhau, người ta đã chỉ ra rằng Tri mẫu (A. asphodeloides Bunge) có chứa nhiều thành phần hóa học khác nhau. Trong đó, chủ yếu là các hợp chất như saponin (steroid saponin), flavonoid, alkaloid, Phenylpropanoid, các acid hữu cơ và một số các hợp chất khác. a) Saponin steroid: Saponin steroid là một trong các thành phần hợp chất chính trong cây Tri mẫu chiếm hơn 6% tổng hàm lượng chất được chiết từ thân rễ của cây, có thể chia thành 6 loại khác nhau dựa trên cấu trúc aglycone.7,8 Các saponin steroid được chia thành 2 nhóm lớn là saponin furostanol và spirostanol. Sau đó, hai nhóm này được chia nhỏ dựa trên các nhóm hydroxyl và đường liên kết với C-2, C-15, C-22 và C-26. Hầu hết các saponin furostanol là saponin bidesmosidic được thay thế bằng chuỗi oligosaccharid ở C-3 và C-26. Các saponin spirostanol và furostanol còn lại là saponin monodesmosidic được thay thế bằng chuỗi oligosaccharid ở C-3. Các nhóm đường phổ biến nhất của chuỗi oligosaccharides là D-galactose, D-xylose, D-glucose và L-rhamnose.8,9 45 saponin steroid đã được xác định trong cây Tri mẫu và được chia thành 4 nhóm và được trình bày theo De Ji và cộng sự (hình 1.2).10 Nhóm 1: Gồm các hợp chất có cấu trúc Các vòng no: 3 vòng hidrocarbon 6 cạnh, 1 vòng hidrocarbon 5 cạnh, 1 dị vòng 5 cạnh chứa oxi và 1 dị vòng 6 cạnh chứa oxi. Vị trí C-26 gắn với O liên kết với dị vòng 6 cạnh chứa Oxy. Nhóm 2: Gồm các hợp chất có cấu trúc Các vòng: 3 vòng hidrocarbon 6 cạnh, 1 vòng hidrocarbon 5 cạnh, 1 dị vòng 5 cạnh chứa oxi và 1 dị vòng 6 cạnh chứa oxi. Vị trí C-26 gắn với O liên kết với dị vòng 6 cạnh chứa Oxy. Vị trí C-22 có liên kết đôi. Nhóm 3: Gồm các hợp chất có cấu trúc Các vòng no: 3 vòng hidrocarbon 6 cạnh, 1 vòng hidrocarbon 5 cạnh và 1 dị vòng 5 cạnh chứa oxi Vị trí C-22 gắn với OH Nhóm 4: Gồm các hợp chất có cấu trúc 4 Các vòng no: 3 vòng hidrocarbon 6 cạnh, 1 vòng hidrocarbon 5 cạnh, 1 dị vòng 5 cạnh chứa oxi và 1 dị vòng 6 cạnh chứa oxi. Vị trí C-22 liên kết với dị vòng 6 cạnh chứa Oxy. Các nhóm thế S1 trong cấu trúc các hợp chất Saponin steroid như sau: Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các saponin steroid trong cây Tri mẫu. b) Flavonoid: Flavonoid là một trong các nhóm hợp chất chiếm hàm lượng cao trong Tri mẫu. Trong đó, các xanthone được chỉ ra là các hoạt chất chính của cây trong một số nghiên cứu. Mangiferin và Neomangiferin là những xanthone chính trong Tri mẫu, trong đó hàm lượng Mangiferin là hơn 0,7%, và hàm lượng Neomangiferin tương 5 ứng được xác định cao hơn.11,12 17 thành phần flavonoid đã được xác định trong cây Tri mẫu được trình bày theo tác giả Wang và cộng sự (hình 1.3).12 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong cây Tri mẫu. c) Alkaloid: Trong cây Tri mẫu có chứa một số hợp chất alkaloid. Trong đó, 9 hợp chất alkaloid đã được nghiên cứu, phân lập và xác định (hình 1.4).12-16 d) Phenylpropanoid: là một nhóm các hợp chất có cấu trúc nguồn gốc từ phenylalanine. Các nghiên cứu đã phát hiện 8 hợp chất Phenylpropanoid được phân lập từ cây Tri mẫu. Trong đó bao gồm 6 hợp chất norlignan là (-)-(R)-4’-Omethylnyasol, nyasol, oxy-hinokiresinol,17 broussonin A,13 broussonin B,18 1,3-di-Phydroxyphenyl-4-penten-1-one;19 1 hợp chất lignan là (Z)-4’,4’’-(3-nethenyl-1propene-1,3-diyl) bisphenol,20 và 1 hợp chất coumarin là anemarcoumarin A (hình 1.5).12,21,22 6 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các alkaloid trong cây Tri mẫu. e) Các acid hữu cơ: hiện tại, có 6 acid hữu cơ đã được phân lập từ cây Tri mẫu bao gồm pantothenic acid, palmitic acid, stearic acid, 4-hydroxybenzoic acid, vanillic acid và benzoic acid (hình 1.6).12,16,23 7 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các phenylpropanoid trong cây Tri mẫu. Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các acid hữu cơ có trong cây Tri mẫu. 8 1.1.4. Tác dụng sinh học Cho đến nay, nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài Tri mẫu (A. asphodeloides Bunge) đã cho thấy các lợi ích khác nhau đối với sức khỏe con người. Các tác dụng này chủ yếu được nghiên cứu dựa trên định hướng theo tác dụng sinh học của 2 nhóm hợp chất chính là saponin steroid và flavonoid (đặc biệt là các hợp chất xanthone). a) Các tác dụng trên hệ thần kinh Tri mẫu (Anemarrhenae Rhizoma) là một trong các dược liệu được sử dụng phổ biến nhất với tác dụng bảo vệ thần kinh trên hệ thần kinh trung ương. Nó mang lại nhiều tác dụng hữu ích đối với nhiều bệnh khác nhau như Alzheimer, Parkinson hay chống trầm cảm.12 Tác dụng bảo vệ thần kinh: Dịch chiết và một số hợp chất từ cây Tri mẫu cho thấy khả năng bảo vệ thần kinh rõ ràng, giúp ngăn ngừa sự chết tế bào thần kinh. Chiết xuất methanol của cây Tri mẫu ở liều 50 và 100 μg/mL cho thấy hoạt động bảo vệ thần kinh đáng kể đối với độc tính thần kinh do glutamate trong tế bào vỏ não chuột 24. Saponin tổng số từ cây Tri mẫu có thể ngăn ngừa tổn thương tế bào thần kinh nhờ khả năng ức chế đáng kể sự gia tăng protein Aβ25–35 do phospho-ERK1/2 và phospho-p38 MAPK gây ra ở liều 30 và 100 μmol/L, trong khi nó có thể làm giảm mức TNF-α và NO trong dịch nổi của đại thực bào được nuôi cấy, và ức chế sự gia tăng biểu hiện protein iNOS do Aβ25–35 gây ra trong đại thực bào ở 10, 30 và 100 μmol/L.25 Ngoài ra, các hợp chất 7-hydroxy-3- (4-hydroxybenzyl) chroman, nyasol và broussonin B từ A. asphodeloides giúp neurite phát triển mạnh trong tế bào pheochromocytoma (PC-12) chuột ở 50 μg/mL.12,18 Tác dụng đối với bệnh Azheimer: Sự giảm mật độ thụ thể cholinergic M trong mô não có liên quan mật thiết đến bệnh Alzheimer. Saponin tổng số trong cây Tri mẫu có thể ngăn chặn sự suy giảm tiến triển của hệ thống cholinergic trong bệnh Alzheimer thông qua việc tăng mật độ thụ thể muscarinic của chuột mô hình sa sút trí tuệ gây ra bởi Aβ25–35,26 và axit L-glutamic.27 Bệnh Alzheimer cũng là do sự chết của các tế bào thần kinh. Quá trình apoptosis (chết rụng tế bào), stress oxy hóa và chứng viêm được cho rằng góp phần làm chết tế bào thần kinh. Lee và cộng sự đã phát hiện ra rằng timosaponin AIII và timosaponin BII có thể cải thiện trí nhớ và rối loạn chức năng học tập thông qua đặc tính chống viêm.28 Uống timosaponin BII hàng ngày đối với chứng sa sút trí tuệ ở chuột ở 100 và 200 mg/kg đã dẫn đến cải thiện 9 đáng kể tình trạng thiếu hụt trong việc học nhiệm vụ mê cung nước. Trong khi đó, sự biểu hiện của interleukin-10, một cytokine chống viêm và thụ thể của nó đã tăng lên đáng kể khi điều trị chuột sa sút trí tuệ bằng timosaponin BII.29 Timosaponin AIII có thể ức chế sự gia tăng các cytokine tiền viêm ở chuột được điều trị bằng scopolamine, trong khi sự hoạt hóa NF-κB trong scopolamine hoặc TNF-α kích thích tế bào BV-2 microglia và SKH-SH. Những kết quả này chỉ ra rằng timosaponin AIII có thể làm suy yếu tình trạng viêm ở chuột được kích thích bằng scopolamine bằng cách ức chế hoạt động của NF-κB.28 Mangiferin cũng có thể cải thiện tình trạng sa sút trí nhớ cholinergic lâu dài bằng cách ức chế AChE hoặc kích thích thụ thể cholinergic và ức chế kích hoạt NF-kappaB.12,30 Tác dụng đối với bệnh Parkinson: Các ảnh hưởng nghiêm trọng của neuropathol đối với bệnh Parkinson bao gồm giảm mạnh dopamine thể vân và giảm khả năng điều hòa chất vận chuyển dopamine thể vân trong con đường nigrostriatal. Xiong và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của saponin tổng số trong cây Tri mẫu trên hệ thống dopaminergic trong một mô hình bệnh Parkinson mãn tính. Họ phát hiện ra rằng các liều 10 mg/kg và 26 mg/kg saponin Tri mẫu có thể làm tăng mức dopamine thể vân ở chuột mô hình MPTP mãn tính, có liên quan chặt chẽ đến việc tăng chất vận chuyển dopamine thể vân, nhưng không liên quan đến dị hóa dopamine thể vân và hoạt động của MAO-B.12,31 Tác dụng đối với bệnh trầm cảm: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sarsasapogenin, saponin tổng, và timosaponin BII từ cây Tri mẫu có hoạt tính sinh học cải thiện chứng trầm cảm. Thử nghiệm sinh học cho thấy sarsasapogenin ở mức 50 mg/kg có thể làm tăng mạnh nồng độ noradrenaline và serotonin ở vùng dưới đồi và vùng hải mã 32,33. Các liều lượng khác nhau của saponin trong cây 0,05 mg/kg, 0,50 mg/kg và 5,00 mg/kg) có thể cải thiện mức morphol do corticosterone gây ra trong tế bào PC12, tăng tỷ lệ sống sót (P<0.01), và giảm hoạt động của LDH (P<0.01).12,34 b) Tác dụng hạ đường huyết và hỗ trợ điều trị đái tháo đường Dịch chiết ethanol của cây Tri mẫu cho thấy khả năng kích thích tiết insulin ở đảo tụy chuột Wistar.35 Tổng flavon từ cây Tri mẫu có thể được sử dụng như một loại thuốc tiềm năng để điều trị bệnh đái tháo đường loại II. Sau khi sử dụng flavon toàn phần, lượng đường trong máu và nồng độ insulin huyết thanh ở chuột mắc bệnh đái tháo đường giảm đáng kể và độ nhạy insulin tăng lên ở chuột được tiêm vắc xin BCG gây ra tình trạng kháng insulin.36 Mangiferin và Mangiferin-7-O-β-glucoside từ cây 10