Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu xây dựng mô hình tổn thương cắt da trên chuột cống trắng bị đái tháo đường và rối loạn lipid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH TỔN THƯƠNG CẮT DA TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG BỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ RỐI LOẠN LIPID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH TỔN THƯƠNG CẮT DA TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG BỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ RỐI LOẠN LIPID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2017.Y Người hướng dẫn: 1. ThS.BSNT Hồ Mỹ Dung 2. ThS.BS Đỗ Thị Quỳnh Hà Nội - 2022 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS.BSNT Hồ Mỹ Dung, ThS.BS Đỗ Thị Quỳnh, giảng viên bộ môn Y Dược học cơ sở - Đại học Y Dược, ĐHQGHN. Các cô đã hướng dẫn tôi ngay từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài, luôn sẵn sàng giúp đỡ tôi mỗi khi gặp khó khăn, giúp tôi trau dồi thêm những kiến thức, kỹ năng cần thiết và truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giảng viên Bộ môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy, cô giảng viên Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường. Đồng thời xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu xây dựng mô hình tổn thương da trên chuột cống trắng gây đái tháo đường và rối loạn lipid”, mã số nhiệm vụ CS.21.06 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, chăm sóc, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Hạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. Đại cương bệnh đái tháo đường và biến chứng loét chi mạn tính ........... 3 1.1.1. Định nghĩa và dịch tễ học bệnh đái tháo đường ................................. 3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường ........................................................ 4 1.1.3. Biến chứng loét chi mạn tính ở bệnh nhân đái tháo đường ................ 4 1.2. Đại cương về tình trạng rối loạn lipid ...................................................... 6 1.3. Các phương pháp gây đái tháo đường và rối loạn lipid trên động vật thực nghiệm .................................................................................................... 6 1.3.1. Gây đái tháo đường trên động vật bằng hóa chất ............................... 7 1.3.2. Gây đái tháo đường và rối loạn lipid trên động vật bằng chế độ ăn giàu chất béo ............................................................................................... 8 1.3.3. Gây đái tháo đường bằng cách kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và streptozotocin liều thấp ............................................................................... 9 1.3.4. Các phương pháp gây đái tháo đường trên thực nghiệm khác ........... 9 1.4. Các phương pháp gây mô hình vết thương ngoài da trên động vật ....... 10 1.4.1. Quá trình liền thương sinh lý ............................................................ 10 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình liền thương .............................. 11 1.4.3. Các mô hình gây tổn thương da trên động vật thực nghiệm ............. 11 1.5. Các nghiên cứu gây tổn thương da trên động vật đái tháo đường tại Việt Nam .............................................................................................................. 14 Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16 2.1. Động vật nghiên cứu .............................................................................. 16 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ............................................... 16 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ............................................................. 16 2.2.2. Hóa chất ............................................................................................ 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 17 2.3.1. Gây mô hình chuột cống trắng bị đái tháo đường/rối loạn lipid....... 18 2.3.2. Gây mô hình vết thương cắt da trên chuột bị đái tháo đường/rối loạn lipid ........................................................................................................... 19 2.3.3. Theo dõi, đánh giá sau khi gây vết thương ....................................... 20 2.3.4. Xử lý số liệu ...................................................................................... 22 Chương 3 – KẾT QUẢ ................................................................................. 23 3.1. Xây dựng mô hình chuột đái tháo đường và rối loạn lipid .................... 23 3.2. Theo dõi mô hình vết thương ngoài da trên chuột cống trắng đái tháo đường/rối loạn lipid...................................................................................... 26 Chương 4 – BÀN LUẬN ............................................................................... 32 4.1. Về mô hình gây đái tháo đường và rối loạn lipid trên chuột cống trắng32 4.2. Về mô hình vết thương ngoài da trên chuột cống trắng mắc đái tháo đường và rối loạn lipid ................................................................................. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 38 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) CHO Cholesterol toàn phần CRP Protein phản ứng C (C – reactive protein) ĐTĐ Đái tháo đường ENU N- Ethyl Nitrosourea GLUT2 Chất vận chuyển glucose 2 (Glucose transporter 2) HDL-C Cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein Cholesterol) HE Hematoxylin & Eosin IDF Liên đoàn Đái tháo đường thế giới (International Diabetes Federation Diabetes Atlas) IL - 1β Interleukin 1β IL – 6 Interleukin 6 LDL-C Cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein Cholesterol) RLLP Rối loạn lipid STZ Streptozotocin TNF – α Yếu tố hoại tử khối u α (Tumor Necrosis Factors) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các tiêu chí đánh giá vết thương trên da chuột trong thời gian gây mô hình………………………………………………………………………21 Bảng 3.1: Thay đổi cân nặng chuột trong quá trình làm thí nghiệm………...23 Bảng 3.2: Nồng độ các chỉ số lipid máu sau khi gây béo phì bằng chế độ ăn giàu chất béo…………………………………………………………………23 Bảng 3.3: Các chỉ số công thức máu và protein phản ứng C sau khi gây mô hình vết thương ngoài da..........................................................................................27 Bảng 3.4: Sự thay đổi diện tích vết thương trong quá trình gây mô hình.......28 Bảng 3.5: Điểm tổn thương trong quá trình theo dõi vết thương da………...30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Streptozotocin………………………………8 Hình 1.2: Quy trình gây vết thương…………………………………………..13 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu mô hình vết thương ngoài da trên chuột cống trắng đái tháo đường/rối loạn lipid…………………………………………………18 Hình 2.2: Vết thương được gắn vòng silicon và băng phẫu thuật...........……20 Hình 3.1: Sự thay đổi nồng độ glucose máu trước và sau khi tiêm STZ……...24 Hình 3.2: Hình ảnh vi thể mô gan chuột sau khi ăn chế độ giàu chất béo, độ phóng đại 10X và 40X.....................................................................................25 Hình 3.3: Hình ảnh vi thể mô tụy chuột sau khi tiêm STZ ở độ phóng đại 4X và 10X………………………………………………………………………..26 Hình 3.4: Hình ảnh tiến triển vết thương trên da của 2 nhóm chuột (A: nhóm chứng sinh lý; B: nhóm mô hình) ……………………………………………27 Hình 3.5: Tỷ lệ co hồi vết thương của 2 nhóm thử nghiệm trong nghiên cứu…………………………………………………………………………...29 Hình 3.6: Thời gian liền thương hoàn toàn của 2 nhóm thử nghiệm...............29 Hình 3.7: Hình ảnh vi thể mô da của nhóm chứng sinh lý (A) và nhóm đái tháo đường (B), độ phóng đại 10X………………………………………………..31 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê của Liên đoàn Đái tháo đường thế giới (International Diabetes Federation Diabetes Atlas – IDF), tính đến năm 2019 trên thế giới có đến 463 triệu người mắc đái tháo đường (ĐTĐ), chiếm 9,3% tổng số người trưởng thành. Con số này được dự báo sẽ tăng lên nhanh chóng và đạt mức 700 triệu người mắc vào năm 2045 [20]. Đái tháo đường không chỉ ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh mà còn tác động xấu tới kinh tế và sự phát triển của xã hội. Bệnh đái tháo đường gây nhiều biến chứng nguy hiểm trên nhiều cơ quan trong cơ thể như tim mạch, thần kinh, mắt, thận và làm tăng nguy cơ tử vong. Trong đó loét bàn chân do đái tháo đường là một biến chứng khá phổ biến và khó điều trị. Các nghiên cứu đã cho thấy có đến 6,3% bệnh nhân ĐTĐ mắc các biến chứng loét da mạn tính [31]. Loét chi mạn tính gây viêm mãn tính và kéo theo nhiều biến chứng khác như hoại tử, viêm xương khớp, nhiễm trùng huyết,… Loét chi mạn tính và các vấn đề về chậm liền vết thương không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, khả năng vận động của người bệnh mà còn là gánh nặng về kinh tế cho toàn xã hội. Tại Mỹ, chi phí điều trị loét chi mạn tính ở bệnh nhân ĐTĐ hàng năm lên đến 9 tới 13 tỷ đô la, tuy nhiên vẫn còn chưa đạt kỳ vọng hiệu quả điều trị [22]. Do đó, việc thử nghiệm các phương pháp điều trị vết thương mạn tính trên động vật đái tháo đường đang rất được quan tâm, tạo tiền đề cho việc áp dụng vào điều trị trên người. Trên thế giới mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về các mô hình vết thương da mạn tính khác nhau trên động vật như vết bỏng, vết cắt da, loét do tì đè,… nhưng kết quả chưa đồng nhất. Hiện tại, ở Việt Nam, các mô hình gây tổn thương da trên động vật có rối loạn chuyển hóa còn nhiều hạn chế như kích thước vết thương nhỏ, chưa mô phỏng được quá trình liền thương trên bệnh nhân đái tháo đường. Vì vậy, với mong muốn cung cấp thêm những thông tin về cơ chế bệnh sinh của loét chi mạn tính ở bệnh nhân đái tháo đường cũng như tạo tiền đề trước khi thử nghiệm tiền lâm sàng cho các phác đồ điều trị tổn thương da mạn tính tiềm năng trong tương lai, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng mô hình tổn thương cắt da trên chuột cống trắng bị đái tháo đường và rối loạn lipid” với 2 mục tiêu chính: 1 - Xây dựng quy trình gây vết thương cắt da trên chuột cống trắng bị đái tháo đường và rối loạn lipid. - Theo dõi quá trình liền thương trên vết thương cắt da ở chuột cống trắng bị đái tháo đường và rối loạn lipid. 2 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Đại cương bệnh đái tháo đường và biến chứng loét chi mạn tính 1.1.1. Định nghĩa và dịch tễ học bệnh đái tháo đường Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association – ADA) năm 2014, “Đái tháo đường thuộc nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa, được đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết do suy giảm bài tiết insulin và/hoặc suy giảm hoạt tính của insulin. Tình trạng tăng đường huyết mạn tính của bệnh đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm, rối loạn và suy giảm chức năng của các cơ quan khác nhau, đặc biệt là trên mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu” [2]. Đái tháo đường hiện là một trong những bệnh lý không lây nhiễm gây tử vong hàng đầu trên thế giới, với tỷ lệ mắc ngày càng gia tăng và các biến chứng phức tạp [23]. Theo báo cáo thống kê của Liên đoàn Đái tháo đường thế giới (IDF), đái tháo đường đã gây ra 4 triệu ca tử vong trên toàn thế giới vào năm 2017 [23]. Các báo cáo thống kê này cũng cho thấy vào năm 2019, trên thế giới có tới 463 triệu người mắc đái tháo đường, chiếm 9,3% tổng dân số trưởng thành (trong khoảng 20 – 79 tuổi). Con số này được dự báo sẽ tăng lên nhanh chóng và đạt mức 700 triệu người mắc vào năm 2045. Trong đó, độ tuổi có tỷ lệ mắc đái tháo đường cao nhất là từ 65 – 79 tuổi, chiếm 19,9% tổng số ca bệnh. Đáng chú ý, cứ 2 người trưởng thành thì có 1 người mắc bệnh đái tháo đường nhưng không được chẩn đoán (khoảng 232 triệu người) [22]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc đái tháo đường cũng có sự khác nhau giữa các khu vực, tập trung nhiều nhất ở các nước đang phát triển, có mức thu nhập thấp và trung bình, trong đó có Việt Nam (79%) [23]. Tại Việt Nam, báo cáo của IDF cho thấy năm 2015, có đến 68,9% các bệnh nhân đái tháo đường chưa được phát hiện và điều trị kịp thời; 8,2% người trưởng thành trong độ tuổi từ 20 – 79 tuổi bị rối loạn dung nạp glucose, có nguy cơ phát triển thành đái tháo đường. Dự báo đến năm 2045, số ca mắc đái tháo đường đạt ngưỡng 6,3 triệu bệnh nhân, tăng 78,5% so với năm 2015 [20]. 3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường 1.1.2.1. Đái tháo đường typ 1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là do tế bào β của đảo tụy bị phá hủy, dẫn tới thiếu hụt insulin trong cơ thể. Các tế bào β bị phá hủy bởi chính các chất trung gian miễn dịch có trong cơ thể, khởi phát do chế độ ăn nhiều chất béo, do nhiễm virus,... dẫn tới viêm các tế bào β tiết insulin của đảo tụy. Sau đó kéo theo tình trạng chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào β, khiến lượng insulin sụt giảm nghiêm trọng, gây ra tăng đường huyết và dẫn đến đái tháo đường. Trong một số trường hợp, bệnh nhân mắc ĐTĐ typ 1 vô căn, tức là không tìm thấy nguyên nhân tự miễn, thiếu hụt insulin liên tục và có thể nhiễm toan ceton, thường gặp ở người châu Á và châu Phi [7]. 1.1.2.2. Đái tháo đường typ 2 Đối với các bệnh nhân ĐTĐ typ 2, cơ thể vẫn sản sinh insulin nhưng insulin không gắn được trên tế bào đích và không vào được trong tế bào, dẫn đến mức đường huyết tăng cao liên tục, gọi là tình trạng kháng insulin. Di truyền và béo phì là một trong những yếu tố nguy cơ gây nên tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2. Khi cơ thể xuất hiện tình trạng kháng insulin, tế bào β đảo tụy sẽ tăng cường tiết insulin để duy trì mức đường huyết ổn định, sau một thời gian sẽ dẫn tới suy giảm bài tiết insulin. Ngoài ra, sự tăng mạn tính các acid béo tự do ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2 cũng gây hiện tượng apoptosis ở các tế bào đảo tụy, bao gồm tình trạng tích tụ amyloid và giảm các tế bào sản xuất insulin ở tiểu đảo Langerhans [7]. 1.1.3. Biến chứng loét chi mạn tính ở bệnh nhân đái tháo đường Bệnh ĐTĐ nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị tích cực có thể dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm cho người bệnh trên nhiều cơ quan khác nhau. Đầu tiên phải kể đến biến chứng trên mạch máu ngoại vi, bao gồm xơ vữa động mạch, thuyên tắc tĩnh mạch chi dưới. Bệnh nhân đái tháo đường có nguy cơ mắc các bệnh lý mạch máu ngoại vi cao gấp 4 lần so với người không bị tiểu đường [3]. Kháng insulin ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2 làm giảm tổng hợp nitric oxit, dẫn đến tăng tổng hợp các chất đông máu trên thành mạch, tăng tính thấm của thành mạch. Điều này làm thay đổi cấu trúc thành mạch, 4 thúc đẩy sự hình thành và tăng sinh các mảng xơ vữa ở động mạch, từ đó gây xơ vữa động mạch. Đái tháo đường cũng có thể gây biến chứng trên hệ thần kinh như: Rối loạn thị giác, rối loạn tiêu hóa, liệt dương và bệnh thần kinh ngoại vi. Nguyên nhân là do tình trạng xơ vữa động mạch ở các bệnh nhân đái tháo đường làm chèn ép các dây thần kinh và giảm cung cấp máu cho các sợi thần kinh. Từ đó làm tổn thương các sợi trục và bao myelin của sợi thần kinh [3]. Biến chứng võng mạc tiểu đường là nguyên nhân gây mù lòa hàng đầu ở đối tượng dưới 75 tuổi tại Hoa Kỳ, thường gặp ở hầu hết các bệnh nhân mắc đái tháo đường trên 20 năm [3]. Các bệnh nhân mắc ĐTĐ xuất hiện các triệu chứng tăng tính thấm mao mạch võng mạc, thủy tinh thể co lại, từ đó gây phù hoàng điểm kèm theo tiết dịch, gây suy giảm thị lực, tổn thương võng mạc và mù lòa. Đái tháo đường cũng có thể gây biến chứng trên thận bao gồm: Tăng albumin niệu, tăng huyết áp và suy giảm chức năng thận. Cơ chế là do tăng đường huyết làm tăng tiết hormon angiotensin, làm tăng lọc cầu thận, kích thích phì đại tế bào và tích tụ chất nền ngoại bào, dẫn đến suy giảm chức năng lọc của thận [3]. Các biến chứng trên mạch máu ngoại vi và biến chứng thần kinh cũng có thể dẫn đến chứng loét chi mạn tính ở bệnh nhân tiểu đường. Theo thống kê, có khoảng 20% bệnh nhân ĐTĐ nhập viện do các biến chứng ở bàn chân bao gồm: Loét chi mạn tính, nhiễm trùng, bệnh xương khớp,... [3]. Cơ chế là do các biến chứng trên thần kinh làm chân mất cảm giác, giảm tiết mồ hôi khiến da trở nên khô và nứt nẻ. Đồng thời, suy giảm chất béo, sợi elastin và collagen dưới da ở bệnh nhân tiểu đường cũng khiến vết thương lâu lành hơn, gây nhiễm trùng và xuất hiện các vết loét ở vùng chân của người bệnh. Loét chi mạn tính gây đau đớn dữ dội, mất khả năng vận động, nếu không được điều trị triệt để có thể gây hoại tử, viêm bao gân dẫn đến cắt cụt chi và nhiễm trùng huyết. Có thể thấy, loét chi mạn tính là một trong những biến chứng thường gặp và nghiêm trọng nhất ở bệnh nhân đái tháo đường nhưng chưa có phương pháp điều trị nào thực sự hiệu quả. Nó không chỉ gây đau đớn, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và khả năng vận động của người bệnh mà còn gây ra gánh nặng về mặt kinh tế. Chính vì thế, việc xây dựng mô hình tổn thương da mạn tính ở động vật bị đái tháo đường có vai trò rất quan trọng, tạo tiền đề cho việc triển 5 khai thử nghiệm các phương pháp mới điều trị loét chi mạn tính trước khi thử nghiệm trên người. 1.2. Đại cương về tình trạng rối loạn lipid Lipid trong cơ thể người gồm 3 nhóm chính là triglycerid, phospholipid và cholesterol. Cơ thể người có thể tự tổng hợp được lipid nhưng phần lớn lipid trong cơ thể được tổng hợp từ thức ăn, dưới sự phân hủy của enzyme lipase. Triglycerid được sử dụng chủ yếu là để cung cấp năng lượng, phospholipid và cholesterol có vai trò cấu tạo nên cấu trúc tế bào và tham gia tổng hợp một số hormon trong cơ thể. Rối loạn lipid sự thay đổi thành phần lipid trong huyết tương, có nhiều dạng khác nhau. Đầu tiên là tình trạng tăng lipid máu sau ăn, tăng lipid máu do rối loạn hoạt động của các hormon hoặc một số bệnh lý về gan gây tăng chuyển hóa và giảm sử dụng lipid. Tăng lipid máu kéo dài có thể gây béo phì, suy giảm chức năng gan, xơ vữa động mạch,… Một dạng khác của rối loạn lipid là rối loạn chuyển hóa cholesterol, thường là tăng cholesterol máu. Nguyên nhân là do chế độ ăn giàu cholesterol, giảm khả năng đào thải ở các bệnh nhân vàng da ứ mật hoặc do tăng sản xuất cholestrol ở các bệnh nhân đái tháo đường, hội chứng thận hư. Béo phì cũng là một dạng của tình trạng rối loạn lipid, đặc trưng là sự tích lũy mỡ quá mức khiến trọng lượng cơ thể tăng cao, tăng tổng hợp lipid trong cơ thể, làm tăng cholesterol và triglycerid máu. Rối loạn lipid kéo dài có thể dẫn đến mỡ hóa tế bào gan, khiến tế bào gan bị tích đọng một lượng lipid lớn và kéo dài, ảnh hưởng xấu tới chức năng của gan. Mỡ hóa tế bào gan được chia làm hai loại là thâm nhiễm mỡ, khi các lipid tích đọng tại gan trong thời gian ngắn và có thể hồi phục được; dạng thứ hai là thoái hóa mỡ, khi tình trạng rối loạn lipid kéo dài, làm thay đổi cấu trúc và chức năng của tế bào gan, dẫn đến xơ gan [15]. 1.3. Các phương pháp gây đái tháo đường và rối loạn lipid trên động vật thực nghiệm Việc xây dựng thành công mô hình gây đái tháo đường trên động vật thực nghiệm có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng. Các mô hình này sẽ tạo tiền đề cho việc nghiên cứu các thay đổi sinh lý trong quá trình mắc đái tháo đường 6 và thử nghiệm các phương pháp điều trị mới. Từ đó giúp tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả để thử nghiệm trên người. 1.3.1. Gây đái tháo đường trên động vật bằng hóa chất Alloxan và streptozotocin (STZ) là hai loại hóa chất phổ biến nhất dùng để gây đái tháo đường trên động vật thực nghiệm. Cả hai hợp chất này đều tác động theo cơ chế gây độc tế bào một cách chọn lọc trên tế bào β của đảo tụy, từ đó làm giảm khả năng tiết insulin của cơ thể, gây ra đái tháo đường. Alloxan và STZ được sử dụng bằng cách tiêm màng bụng hoặc tiêm tĩnh mạch. Khi đó, trong cơ thể sự thay đổi đường huyết diễn ra theo 4 pha (đối với alloxan) hoặc 3 pha (từ pha 2 đến pha 4 đối với STZ) [15]. - Pha thứ nhất xuất hiện hiện tượng hạ đường huyết thoáng qua kéo dài khoảng 30 phút ngay sau khi tiêm alloxan vào cơ thể do ức chế enzyme glucokinase. - Pha thứ 2 diễn ra sau khi tiêm alloxan/STZ 1h và có thể kéo dài 2 – 3h với đặc điểm tăng đường huyết trong cơ thể và tuyến tụy giảm tiết insulin. - Pha thứ 3 diễn ra sau khi tiêm 4 – 8h và kéo dài trong vòng vài giờ. Ở giai đoạn này, đường huyết tiếp tục hạ, có thể gây co giật, thậm chí là tử vong nếu nguồn dự trữ glucose cạn kiệt. - Pha thứ 4 đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết vĩnh viễn. Sự suy giảm các tế bào β có thể quan sát thấy sau khi tiêm 12 – 48h. Trong khi đó, các tế bào khác của tuyến tụy vẫn hoạt động bình thường. Có thể tìm thấy các mảnh vụn của tế bào β đảo tụy đang được loại bỏ bởi các tế bào đại thực bào [16]. STZ là một chất tương tự nitrosourea trong đó gốc N -methyl- N nitrosourea được liên kết với carbon-2 của hexose. 7 Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Streptozotocin [16] STZ có tác dụng chọn lọc trên tế bào β do được vận chuyển chọn lọc thông qua thụ thể GLUT2. Cơ chế gây đái tháo đường chính của STZ là do gốc methylnitrosourea có trong công thức cấu tạo. Khi vào trong tế bào β, methylnitrosourea gây ankyl hóa DNA, đặc biệt là ở vị trí O6 của guanin. Quá trình metyl hóa này khiến DNA bị tổn thương, dẫn đến sự phân mảnh DNA. Cơ chế tự sửa chữa của tế bào trong trường hợp này bị kích thích quá mức, gây cạn kiệt nguồn năng lượng trong tế bào, từ đó dẫn đến hoại tử các tế bào β. Sau khi các DNA trong tế bào β bị tổn thương, gây chết tế bào cũng dẫn đến sự thiếu hụt biểu hiện gen và sản xuất protein, dẫn đến suy giảm quá trình vận chuyển và chuyển hóa glucose, gây tăng đường huyết. Tóm lại, streptozotocin gây hoại tử có chọn lọc các tế bào β và làm tăng đường huyết, từ đó gây đái tháo đường [16]. 1.3.2. Gây đái tháo đường và rối loạn lipid trên động vật bằng chế độ ăn giàu chất béo Một phương pháp khác gây đái tháo đường trên động vật thực nghiệm là sử dụng chế độ ăn giàu chất béo, trong đó chất béo chiếm khoảng 40 – 60% kcal cung cấp hàng ngày, trong khi năng lượng từ chất béo trong chế độ ăn tiêu chuẩn chỉ chiếm khoảng 10% [19]. Tùy thuộc vào điều kiện nghiên cứu và trọng lượng của động vật có thể điều chỉnh hàm lượng chất béo phù hợp. Loại chất béo thường được sử dụng là mỡ lợn, do có tỷ lệ chất béo bão hòa và chất béo không bão hòa là tương đương, được chứng minh có khả năng gia tăng trọng lượng nhanh chóng, gây béo phì và kháng insulin [19]. Ngoài ra, để gây tăng cân và tăng đường huyết, chế độ ăn của động vật còn được bổ sung thêm carbohydrat như fructose hoặc saccharose, do có sự tương đồng so với chế độ 8 ăn của người. Đặc biệt fructose được nghiên cứu là gây tình trạng kháng lepthin, dẫn đến gia tăng nhanh chóng cân nặng và tình trạng béo phì, mỡ bụng, tăng đường huyết ở động vật gặm nhấm [19, 25]. 1.3.3. Gây đái tháo đường bằng cách kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và streptozotocin liều thấp Sử dụng kết hợp cả chế độ ăn giàu chất béo và STZ để gây đái tháo đường trên động vật thực nghiệm được đánh giá là một trong những phương pháp hiệu quả. Việc sử dụng mô hình này vừa giúp làm tăng đường huyết, rối loạn lipid do chế độ ăn nhiều chất béo, vừa gây phá hủy chọn lọc các tế bào β của đảo tụy. Đối với mô hình này, động vật thí nghiệm được duy trì chế độ ăn chứa 40 – 60% là chất béo liên tục sau đó được tiêm STZ với liều thấp để gây ra tình trạng kháng insulin và tăng đường huyết trên động vật. Mô hình này được đánh giá có thể gây ra tình trạng bệnh lý trên động vật tương tự với cơ chế bệnh sinh đái tháo đường typ 2 [9]. 1.3.4. Các phương pháp gây đái tháo đường trên thực nghiệm khác 1.3.4.1. Cắt bỏ một phần tuyến tụy Ở mô hình gây đái tháo đường bằng phương pháp cắt bỏ tuyến tụy, động vật được gây mê và cắt bỏ 85 – 90 % tuyến tụy, chỉ để lại một phần mô tụy. Sau khi phẫu thuật, động vật được duy trì chế độ ăn tiêu chuẩn và theo dõi trong vòng 6 tuần. Kết quả cho thấy phần tuyến tụy còn lại phát triển độc lập giống như một tuyến tụy hoàn chỉnh và có sự tăng tiết insulin ở các tế bào β còn sót lại. Ở động vật bị cắt bỏ tuyến tụy cũng xuất hiện tình trạng tăng đường huyết ngay từ ngày thứ 4 sau phẫu thuật và duy trì ở mức ổn định [4]. Với phương pháp này, trên động vật thử nghiệm vẫn xảy ra tình trạng tăng đường huyết và giảm nồng độ insulin do cắt bỏ tuyến tụy. Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này không cao do phần tuyến tụy còn lại vẫn có sự tăng tiết insulin bù trừ cho phần mô tụy đã bị cắt bỏ. 1.3.4.2. Đột biến gen bằng N- Ethyl Nitrosourea (ENU) N-Ethyl Nitrosourea là tác nhân gây đột biến mạnh nhất trên chuột, bằng cách alkyl hóa DNA, gây đột biến điểm trên các tế bào gốc sinh tinh. Các con đực sau khi gây đột biến bằng N – Ethyl Nitrosourea được cho giao phối cận 9 huyết, tạo ra thế hệ sau mang gen đột biến ENU [1]. Sau khi lai tạo các thế hệ chuột mang gen đột biến ENU, kết quả thu được các con chuột có dấu hiệu tăng đường huyết rõ rệt, không dung nạp glucose và suy giảm hoạt động phosphoryl hóa glucose, liên quan đến đột biến gen Gck, MODY2 trong GENA 348, từ đó gây giảm giải phóng insulin từ tuyến tụy và kháng insulin, rối loạn dung nạp glucose [27]. 1.4. Các phương pháp gây mô hình vết thương ngoài da trên động vật 1.4.1. Quá trình liền thương sinh lý Vết thương ngoài da có thể do nhiều nguyên nhân như: Chấn thương, phẫu thuật hoặc các bệnh lý khác của cơ thể. Dựa vào đặc điểm, vết thương ngoài da được phân loại thành vết thương cấp tính và mạn tính. Ở người trưởng thành, quá trình liền thương diễn ra qua 4 giai đoạn. Đầu tiên là giai đoạn cầm máu, xảy ra ngay sau khi hình thành vết thương, bao gồm quá trình co mạch và kết tập tiểu cầu, hình thành cục máu đông. Cục máu đông và các mô xung quanh vết thương giải phóng cytokin gây viêm và các yếu tố tăng trưởng như: Yếu tố tăng trưởng biến đổi (Transforming Growth Factor beta – TGF – β), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (Fibroblast Growth Factor – FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor – EGF),… [12]. Khi tình trạng chảy máu được kiểm soát, quá trình liền thương chuyển sang giai đoạn thứ hai là giai đoạn viêm. Các đại thực bào, bạch cầu trung tính, tế bào lympho sẽ di chuyển vào vết thương và thúc đẩy quá trình viêm. Bạch cầu trung tính có chức năng loại bỏ các vi khuẩn và mảnh vụn tế bào trong vùng bị tổn thương. Tế bào đại thực bào kích hoạt các bạch cầu bổ sung, thúc đẩy quá trình viêm [12]. Theo sau và chồng lên giai đoạn viêm là giai đoạn tăng sinh, được đặc trưng bởi sự tăng sinh biểu mô và di chuyển chất nền bên trong vết thương. Các nguyên bào sợi và tế bào nội mô ở lớp hạ bì hỗ trợ tăng sinh mạch máu, hình thành sợi collagen và mô hạt tại vị trí tổn thương [12]. Cuối cùng của quá trình liền thương là giai đoạn tái tạo, có thể kéo dài nhiều năm sau khi liền thương. Trong giai đoạn này, các mao mạch tăng sinh dần thoái hóa, đưa mật độ mao mạch tại vị trí tổn thương về mức bình thường và ổn định. Các chất nền ngoại bào tại vị trí tổn thương cũng được sửa chữa và tái cấu trúc để giống với chất nền của mô bình thường [12]. 10 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình liền thương Có nhiều yếu tố khác nhau có thể ảnh hưởng tới quá trình liền thương của cơ thể. Đầu tiên phải kể đến yếu tố tuổi tác. Ở người cao tuổi, quá trình liền thương có sự thay đổi: Tăng cường kết tập tiểu cầu, tăng tiết chất trung gian gây viêm, suy giảm chức năng đại thực bào, chậm hình thành thành mạch, tái tạo collagen, tái tạo biểu mô,… từ đó làm chậm quá trình liền thương [12]. Tình trạng stress cũng làm giảm mức độ của các cytokin IL – 1β, IL – 6, TNF – α và ảnh hưởng đến hormon tuyến thượng thận – có chức năng như một chất chống viêm và điều hòa phản ứng miễn dịch qua trung gian Th1. Từ đó làm suy giảm khả năng miễn dịch của tế bào tại vị trí tổn thương, dẫn đến kéo dài quá trình liền thương [11]. Bên cạnh đó, tình trạng nhiễm trùng cũng có thể khiến các vi sinh vật trên bề mặt da dễ dàng xâm nhập vào các mô bên dưới, gây nhiễm trùng; dẫn đến tăng các cyctokin IL – 1, TNF – α, làm kéo dài phản ứng viêm và quá trình liền thương, gây viêm mãn tính [8]. Đặc biệt, sự tăng đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường làm tăng quá trình stress oxy hóa, tăng sản xuất cytokin viêm: PDGF, TGF – β, TNF – α, dẫn đến khuếch đại phản ứng viêm sớm [18]. Do đó càng làm tăng tình trạng thiếu oxy tại mô tổn thương, khiến vết lâu lành, dẫn đến viêm mạn tính. Quá trình này là nguyên nhân chính dẫn đến loét chi mạn tính ở bệnh nhân đái tháo đường. Ngoài ra, mô mỡ dưới da ở bệnh nhân béo phì cũng làm tăng áp lực tại mô bị tổn thương, giảm tưới máu và giảm cung cấp oxy tới vết thương, khiến vết thương lâu lành hơn. Tình trạng căng thẳng, stress, trầm cảm ở người béo phì cũng là tác nhân làm vết thương liền chậm hơn so với người bình thường [29]. 1.4.3. Các mô hình gây tổn thương da trên động vật thực nghiệm Đối với các bệnh nhân đái tháo đường, vấn đề cần quan tâm nhất là các biến chứng do tăng đường huyết mạn tính gây ra. Trong số đó, loét chi mạn tính là biến chứng khá phổ biến, dai dẳng và khó điều trị. Vì vậy, việc xây dựng thành công mô hình gây vết thương trên động vật đái tháo đường là khởi đầu quan trọng, giúp các nhà khoa học hiểu thêm về các cơ chế lành vết thương, thử nghiệm các phương pháp điều trị loét da mạn tính mới trước khi thử nghiệm trên người. 11 Có rất nhiều loại động vật có thể sử dụng trong mô hình gây đái tháo đường: Động vật gặm nhấm (chuột, thỏ), chó, lợn, khỉ,... Tùy từng loại động vật sẽ có những đặc điểm về quá trình sinh trưởng, phương pháp gây mô hình và những điểm khác biệt so với cơ thể người. Trong đó, động vật gặm nhấm được đánh giá có đặc điểm sinh lý giống với cơ thể người hơn so với các loài động vật có vú khác, sinh sản nhanh, có vòng đời ngắn, chi phí nuôi dưỡng thấp và kiểu gen dễ dàng thay đổi để có các kiểu hình như mong muốn. Vì vậy, động vật gặm nhấm, đặc biệt là chuột được sử dụng nhiều nhất trong các mô hình nghiên cứu trên động vật thực nghiệm [14]. Các đặc điểm da của chuột cống rất phù hợp cho việc nghiên cứu các biến chứng trên da ở động vật mắc đái tháo đường, rối loạn lipid. Khác biệt lớn nhất giữa da chuột cống và da người đó là da chuột có lớp cơ panniculus carnosus, giúp da có khả năng co lại, liên kết các vị trí tổn thương, từ đó vết thương trên da nhanh lành hơn [10]. Nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách sử dụng các vật cố định vị trí vết thương trên da (vòng silicon) hoặc lựa chọn nghiên cứu trên vùng da có khả năng co lại kém (cổ, tai, đuôi), để mô hình gần tương tự với cơ chế liền thương trên da của con người. Ngoài ra, da chuột có hệ thống nang lông dày đặc, chứa rất nhiều tế bào gốc. Tuy nhiên các tế bào gốc này không có khả năng tham gia vào việc chữa lành tổn thương giống tế bào gốc ở người nên không gây ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu [32]. Các nghiên cứu đã chỉ rõ sự tương đồng giữa da chuột cống và da người lên tới 30,2%, liên quan dến vùng mô biểu bì da, keratin và các mô liên quan đến tăng sinh tế bào và đặc biệt là các tác nhân chữa lành vết thương [32]. Do đó, mặc dù có các đặc điểm giải phẫu da khác da người nhưng chuột cống vẫn là loài phù hợp nhất trong việc xây dựng mô hình vết thương da trên động vật. Các đặc điểm khác biệt là căn cứ quan trọng để tối ưu mô hình và biện giải kết quả cho phù hợp. Một số mô hình gây tổn thương da trên động vật được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu như vết thương cắt da, rạch da, vết thương do bỏng, loét do tì đè,… 1.4.3.1. Mô hình gây vết thương do cắt/rạch da Mô hình gây vết thương do cắt/rạch da và dùng nẹp silicon sử dụng đối tượng là chuột cống trắng bị ĐTĐ/RLLP theo nghiên cứu của Galiano [10]. Sau 12