Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của dịch chiết thân lá loài gừng orlow (distichochlamys orlowii)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ---------- LÊ THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT THÂN LÁ LOÀI GỪNG ORLOW (Distichochlamys Orlowii) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ---------- LÊ THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT THÂN LÁ LOÀI GỪNG ORLOW (Distichochlamys Orlowii) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khoá: QH.2017.Y Người hướng dẫn: TS. LÊ HỒNG LUYẾN ThS. NGUYỄN XUÂN TÙNG HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS. Lê Hồng Luyến, trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu, thầy cô Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và Bộ môn Khoa học cơ sở Dược nói riêng đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại đây trong suốt 5 năm học vừa qua cũng như trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, anh chị em, bạn bè đã luôn ủng hộ, đồng hành, quan tâm, sát cánh cùng em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã có nhiều sự cố gắng, nỗ lực, song với kiến thức, kỹ năng và thời gian còn hạn chế, khóa luận của em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2022 Sinh viên Lê Thị Hồng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) DCM Dichloromethane DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAc Ethylacetate EtOH Ethanol GC-MS Sắc ký khí khối phổ IC50 Nồng độ ức chế 50% (μg/mL) (50% Inhibitory Concentration) MeOH Methanol RNS Reactive Nitrogen Species ROS Reactive Oxygen Species TFC Tổng hàm lượng flavonoid (Total Flavonoid Content) TPC Tổng hàm lượng phenolic (Total Phenolic Content) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân bố họ Gừng (Zingibeaceae) ở các Quốc gia Châu Á .............. 4 Bảng 1.2. Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính ................................... 11 Bảng 3.1. Hiệu suất chiết (%) của quá trình chiết thân lá Distichochlamys orlowii ............................................................................................................. 25 Bảng 3.2. Khả năng quét gốc tự do DPPH (IC50, μg/mL) .............................. 26 Bảng 3.3. Khả năng quét gốc tự do ABTS (IC50, μg/mL) .............................. 29 Bảng 3.4. Hàm lượng phenolic toàn phần, flavonoid toàn phần .................... 32 Bảng 3.5. Các thành phần hợp chất được xác định trong dịch chiết n-Hexan của thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) qua GC-MS................... 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) ................................... 6 Hình 1.2. Cấu tạo gốc tự do ............................................................................ 11 Hình 2.1. Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) ................................. 15 Hình 2.2. Máy đo quang spectramax ID5 ...................................................... 17 Hình 2.3. Hệ thống máy GC-MS .................................................................... 17 Hình 2.4. Hệ thống Soxhlet ............................................................................ 18 Hình 3.1. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trung hòa gốc tự do DPPH ............................................................................................................... 27 Hình 3.2. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng quét gốc tự do ABTS+ của cao chiết thân lá loài Distichochlamys orlowii ............................ 30 Hình 3.3. Đường chuẩn Acid Galic ................................................................ 31 Hình 3.4. Đường chuẩn Quercertin ................................................................ 32 Hình 3.5. Ảnh hưởng của các phương pháp chiết tới tổng hàm lượng phenolic ......................................................................................................................... 34 Hình 3.6. Ảnh hưởng của các phương pháp chiết tới tổng hàm lượng flavonoid ......................................................................................................................... 36 Hình 3.7. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-Hexan thân lá loài D.Orlowii 37 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1 Tổng quan về cây ........................................................................................ 3 1.1.1 Tổng quan về họ gừng (Zingibeaceae) ............................................ 3 1.1.2 Tổng quan về Chi Distichochlamys ................................................. 5 1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Distichochlamys orlowii ... 5 1.2 Tổng quan về chiết xuất .............................................................................. 7 1.2.1 Khái niệm chiết xuất ........................................................................ 7 1.2.2 Các kỹ thuật chiết xuất ..................................................................... 8 1.3 Tổng quan về oxy hóa ............................................................................... 10 1.3.1 Gốc tự do ........................................................................................ 10 1.3.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể ............................................ 12 1.3.3 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa ................ 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 15 2.1.1 Nguyên liệu .................................................................................... 15 2.1.2 Hóa chất sử dụng............................................................................ 15 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .................................. 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 18 2.2.1 Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết soxhlet ...................................................................... 18 2.2.2 Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết lắc. ............................................................................ 19 2.2.3 Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết siêu âm ..................................................................... 19 2.2.4 Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH ................. 19 2.2.5 Xác định khả năng quét gốc tự do ABTS ...................................... 20 2.2.6 Xác định hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng có trong cao chiết thân lá loài D. orlowii..................................................................... 21 2.2.7 Sắc ký khí - Khối phổ (GC-MS) .................................................... 23 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu.............................................................. 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................... 25 3.1. Hiệu suất chiết .......................................................................................... 25 3.2 Khả năng chống oxy hóa in vitro của các cao chiết thân lá Distichochlamys orlowii.26 3.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH ..................................................... 26 3.2.2 Khả năng quét gốc tự do ABTS ..................................................... 28 3.3 Thành phần hóa học của dịch chiết thân lá loài Distichochlamys orlowii 31 3.3.1 Hàm lượng phenolic toàn phần, flavonoid toàn phần của thân lá Distichochlamys orlowii. ........................................................................ 31 3.3.2 Xác định thành phần tinh dầu trong cao chiết thân lá D. orlowii .. 37 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 40 4.1 Về hiệu suất chiết ...................................................................................... 40 4.2 Về khả năng chống oxy hóa ...................................................................... 40 4.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH ..................................................... 40 4.2.2 Khả năng quét gốc tự do ABTS ..................................................... 41 4.3 Về thành phần hóa học .............................................................................. 41 4.3.1 Tổng hàm lượng henolic và tổng hàm lượng Flavonoid................ 41 4.3.2 Đánh giá các thành phần tinh dầu trong dịch chiết thân lá loài D. orlowii. .................................................................................................... 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cơ thể con người luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis). Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo chiều hướng gia tăng các dạng oxy hóa hoạt động, hình thành nhiều gốc tự do. Có nhiều bằng chứng cho thấy gốc tự do là nguyên nhân quan trọng gây nên một số bệnh mạn tính và thoái hóa như xơ vữa động mạch, bệnh tim thiếu máu cục bộ, ung thư, tiểu đường, bệnh thoái hóa thần kinh và lão hóa [1]. Các chất chống oxy hóa tự nhiên cũng như tổng hợp có vai trò làm giảm hoặc ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, góp phần vào việc chống lại sự hình thành bệnh tật trong cơ thể con người [2]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy các chất chống oxy hóa tự nhiên thể hiện nhiều tác dụng ưu việt hơn so với các chất tổng hợp. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng chống oxy hóa đã trở nên quan trọng và cấp thiết. Các hợp chất phenolic, flavonoid, tanin rất phổ biến trong tự nhiên và đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa cao thông qua khả năng quét gốc tự do. Một trong những nguồn thực phẩm chứa nồng độ cao các chất chống oxy hóa đó là rau, củ, quả [3]. Trong tài nguyên thực vật Việt Nam, gừng là một loại cây rất quen thuộc. Nó được xem là nguồn nguyên liệu có giá trị để làm gia vị trong chế biến thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh [4]. Trong họ Gừng (Zingiberaceae) có rất nhiều loại đã được mô tả và nghiên cứu. Tuy nhiên, đối với loài Distichochlamys orlowii có khá ít nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học của chúng. Do đó, để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng của Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii), góp phần sử dụng hiệu quả tài nguyên cây thuốc, em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của dịch chiết thân lá loài Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii)” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết thân lá loài Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii). 1 2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của dịch chiết thân lá loài Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii). 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Vị trí phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa, chi Distichochlamys có vị trí phân loại như sau Giới: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Bộ: Zingiberales Họ: Zingiberaceae Chi: Distichochlamys 1.1.1 Tổng quan về họ gừng (Zingibeaceae) Họ Gừng (Zingibeaceae) có nhiều chi và nhiều loài khác nhau, gồm những cây thân thảo sống lâu năm, chủ yếu mọc ở những nơi râm mát ẩm ướt, dưới tán rừng hay vách đá ẩm, thân ngắn, kém phát triển, hầu hết bị dài ra do các bẹ lá ôm chặt lấy nhau tạo thành thân giả, không phân nhánh. Lá hình chùm, đôi khi có tua, ở phần dưới của chồi thường không có phiến, bẹ lá thường mở. Rễ nhỏ, hình sợi, đôi khi đầu rễ phình to thành dạng củ (Curcuma, Kaempfria, Stahlianthus...), ở một số loài, rễ thẳng, cứng, đâm sâu xuống đất, phần trên lộ trên mặt đất. Thân rễ (thường được gọi là củ) to, nạc, nằm ngang dưới mặt đất. Cây thường có chứa mùi thơm, đôi khi mùi hắc. Họ Gừng (Zingibeaceae) phân bố hầu hết ở vùng nhiệt đới và khu vực cận nhiệt đới. Tập trung phần lớn ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản... [5, 6]. Theo các tác giả Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến đã tổng kết, ở Việt Nam, họ Gừng có 12 chi và 61 loài được phân bố rải rác từ Bắc vào Nam [7, 8]. 3 Bảng 1.1. Phân bố họ Gừng (Zingibeaceae) ở các Quốc gia Châu Á [18] Quốc gia Họ Loài Thế giới 52 1500 Trung Quốc 21 200 Ấn Độ 18 120 Indonexia 14 120 Malaysia 25 650 Nêpan 11 35 Phillipines 15 103 Thái Lan 20 200 Công dụng của gừng: Trong chế biến thực phẩm sử dụng gừng tươi và các sản phẩm từ gừng (tinh dầu gừng, nhựa dầu gừng, gừng khô, gừng muối...) vừa tăng thêm mùi vị hấp dẫn, vừa kích thích hoạt động của các men phân giải protein. Ngoài ra, thân rễ của gừng cũng được sử dụng trong y học cổ truyền. Quan điểm dùng để tăng cường sức khỏe được cho là do gừng giàu chất phytochemical[4]. Trong y học dân tộc ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới gừng có tiềm năng điều trị một số bệnh bao gồm rối loạn thoái hóa (viêm khớp và thấp khớp), vấn đề về tiêu hóa (khó tiêu, táo bón và loét), rối loạn tim mạch (xơ vữa động mạch và tăng huyết áp), nôn mửa, đái tháo đường và ung thư. Nó cũng có đặc tính chống viêm và chống oxy hóa để kiểm soát quá trình lão hóa. Hơn nữa, nó có khả năng kháng khuẩn cũng như có thể giúp điều trị các bệnh truyền nhiễm. Việc tạo ra các gốc tự do hoặc các loại oxy phản ứng (ROS) trong quá trình trao đổi chất vượt quá khả năng chống oxy hóa của hệ thống sinh học dẫn đến stress oxy hóa, đóng một vai trò thiết yếu trong các bệnh tim, bệnh thoái hóa thần kinh, ung thư và trong quá trình lão hóa[4]. 4 1.1.2 Tổng quan về Chi Distichochlamys Đặc điểm thực vật: cây thảo nhỏ đến 35 cm. Các chồi lá gần nhau tạo thành một cụm dày đặc. Lá dài đến 42 cm, cuống lá dài 20 cm, cứng, có rãnh sâu ở mặt ngoài, có lông tơ rất thưa, bóng. Phiến lá rộng hình elip, gân giữa lệch tâm rõ rệt, gốc hình nón hoặc tròn, bằng hoặc không, đỉnh ngắn nhọn, phía trên nhẵn, hơi bóng. Phía dưới có lông thưa, đặc biệt ở gân giữa, bóng. Lá bắc hình nón, ôm về một phía, phủ một lớp lông tơ dính bên ngoài, bên trong bóng và sáng, màu hồng sẫm, thường có ba hoa đến khi trưởng thành và một hoặc hai hoa nữa không phát triển, đài hoa hình ống, dài 9 mm, có lông thưa, hai đầu nhọn hoặc chia thùy, màu trắng trong. Ống tràng hoa dài 30 mm. [9]. 1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Distichochlamys orlowii Đặc điểm thực vật Loài Distichochlamys orlowii K. Larsen & M. F. Newman hay còn được biết đến với tên gọi Gừng Orlow thuộc họ Gừng (Zingiberaceae). Đây là một loại gừng đặc hữu của Việt Nam[10]. Cây thảo, thân rễ mang lá có bẹ nhỏ, phiến lá dài 5 – 9 cm, có màng, màu đỏ, khi khô chuyển sang màu nâu. Lá mọc thẳng từ thân rễ, phẳng, mặt dưới lá màu tím than, mặt trên lá xanh, gân nổi rõ, bẹ lá dài 4 – 7 cm. Mép mỏng, ngọn lá nhọn, cuống lá dài 15 – 20 cm, màu xanh lục. Cụm hoa mọc từ các bẹ lá phía dưới. Lá bắc lớn, dày đặc, màu xanh lục với mép đỏ. Hoa có màu vàng. Quả và hạt không xác định [11]. 5 Hình 1.1. Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) [12] Môi trường sống Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii K. Larsen & M. F. Newman) sống ở ven suối, rừng thứ sinh, rừng nguyên sinh, trảng cây bụi [10]. Thành phần hóa học loài Distichochlamys orlowii Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii K. Larsen & M. F. Newman) với vai trò sử dụng là cây lấy tinh dầu [10]. Một số nghiên cứu về thành phần các hợp chất dễ bay hơi của thân rễ loài Distichochlamys orlowii đã chỉ ra rằng có một lượng đáng kể các 6 hydrocacbon monoterpen (23,9%), monoterpen chứa oxy (29,4%), hydrocacsbon sesquiterpen (33,7%), Sesquiterpen chứa oxy (11,2%) và chứa một lượng nhỏ diterpenes (0,3%). Trong đó, geranyl acetat (16,5%), β-elemene (9,2%), β-pinen (9,0%) và β-caryophellene (7,9%) là các thành phần chính còn các hợp chất khác có tầm quan trọng định tính bao gồm humulene, citral, linalool, limonene,…[13]. 1.2 Tổng quan về chiết xuất 1.2.1 Khái niệm chiết xuất Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của một quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất tan hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết [14]. Các quá trình Có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hòa tan của chất tan vào dung môi - Sự khuếch tán của chất tan vào dung môi - Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng tới ba quá trình này - Bản chất của chất tan - Dung môi - Nhiệt độ - Áp suất - Cấu tạo của vách tế bào - Kích thước tiểu phân bột dược liệu -… Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề thời vụ thu hái để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. 7 1.2.2 Các kỹ thuật chiết xuất Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng), chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa,…tùy yêu cầu, điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Các phương pháp chiết gồm có ngâm và ngấm kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong một lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm chiết được lặp lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hoà ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn. Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosid, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do,…) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên ra, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao…đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất [14]. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 kHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hoà tan của chất tan vào dung môi và 8 tăng quá trình khuếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể tăng quá trình khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết [14]. Ưu điểm: chiết xuất với sự trợ giúp của siêu âm thể hiện sự hiệu quả, đơn giản và ít tốn kém so với các kỹ thuật chiết xuất thông thường. Ưu điểm chính của phương pháp này là làm tăng khối lượng chiết xuất và động học của quá trình chiết xuất cũng nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chiết xuất. Siêu âm cũng có thể làm giảm nhiệt độ chiết xuất, cho phép chiết xuất các hợp chất kém bền với nhiệt. So với chiết xuất bằng vi sóng và siêu tới hạn thì thiết bị chiết siêu âm rẻ hơn và tiến hành dễ dàng hơn. Hơn nữa, trong chiết xuất siêu âm có thể sử dụng nhiều loại dung môi để chiết xuất một khoảng rộng các hoạt chất [15]. Nhược điểm: siêu âm trong chiết xuất có thể làm biến đổi các chất chiết do nhiệt độ tăng cao và sự hình thành hydroqeroxyl, nhất là dung môi có nước. Một số hoạt chất trong dược liệu khi sử dụng siêu âm dễ bị phân hủy. Vì vậy phải cẩn thận khi chọn điều kiện chiết xuất cũng như phương pháp phát hiện sản phẩm phân hủy [15]. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vùng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hoà tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá huỷ cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hoà tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết nhiều tạp chất hơn [14]. 9 Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá giới hạn hoặc chất lỏng siêu tới hạn (Super-critical fluid extraction, SFE) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Trong phòng thí nghiệm, SFE được dùng để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ độc hại trong môi trường,…[14] Chiết dưới áp suất cao Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết xuất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction, PLE). Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều và nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng sưới áp suất [14]. 1.3 Tổng quan về oxy hóa 1.3.1 Gốc tự do Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có 1 điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [16], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [17, 18]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình [18]. Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể 10 phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA. Những gốc tự do này tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào [16]. Hình 1.2. Cấu tạo gốc tự do [19] Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do). [20]. Bảng 1.2. Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [20] Gốc tự do Các dẫn xuất không phải là các gốc tự do O2.- Superoxide . OH Hydroxyl NO. Nitric Oxide NO2. Nitrogen dioxid H2O2 Hydrogen peroxid HOCl Hypochlorous acid ONOO- Peroxy nitrit 11 ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô. Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa. ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh …[21]. Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống. Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phản ứng với superoxid, peroxynitrit [20]. Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [20, 22]. Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ [22]: + Điều hòa phân ly tế bào + Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,...) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm. + Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên [22]: + Đột biến ở DNA + Biến tính protein + Oxy hóa lipid 1.3.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Chất chống oxy hóa là những phân tử ổn định đủ để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và trung hòa chúng, do đó làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của ROS [23]. Cơ chế quá trình chống oxy hóa trong tế bào: 12