Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu bào chế nano rutin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ BẢO NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO RUTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRONG DUNG MÔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ BẢO NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO RUTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRONG DUNG MÔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH2017.Y Người hướng dẫn : ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 5 năm học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã tạo điều kiện để tôi được thực hiện đề tài nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Huyền, cô là người trực tiếp giao đề tài, luôn nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Nguyễn Văn Khanh – thầy luôn giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong thời gian làm khóa luận và bạn Vũ Thị Diệu Linh – sinh viên lớp Dược học khóa QH2017.Y đã hỗ trợ tôi rất nhiều. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận khó tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Ngọc DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 HPMC Hydroxypropylmethylcellulose 2 KTTP Kích thước tiểu phân 3 NaLS Natri laurylsulfat 4 PDI Polydispercity Index (chỉ số đa phân tán) 5 PVP Polyvinylpyrrolidon 6 TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số sản phẩm chứa rutin trên thị trường ...............................................5 Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong thực nghiệm ...................................14 Bảng 3.1. Biểu diễn độ hấp thụ quang theo nồng độ ................................................22 Bảng 3.2. KTTP, PDI của nano rutin khi bào chế với các dung môi khác nhau (n=3) ...................................................................................................................................23 Bảng 3.3. KTTP, PDI của nano rutin khi bào chế với các polyme khác nhau (n=3)25 Bảng 3.4. KTTP và PDI của mẫu bào chế nano Rutin với nồng độ HPMC E15 khác nhau (n=3) .................................................................................................................26 Bảng 3.5. KTTP và PDI, thế zeta của mẫu bào chế với nồng độ rutin khác nhau (n=3) ..........................................................................................................................28 Bảng 3.6. KTTP và PDI, thế zeta của mẫu bào chế với tỉ lệ dung môi và dung môi kết tủa thay đổi (n=3) ................................................................................................29 Bảng 3.7. KTTP và PDI, thế zeta của nano rutin với chất diện hoạt khác nhau (n=3) ...................................................................................................................................31 Bảng 3.8. KTTP, PDI, thế zeta của nano rutin với các thiết bị trộn khác nhau (n=3) ...................................................................................................................................32 Bảng 3.9. KTTP, PDI, thế zeta của nano rutin với thời gian siêu âm khác nhau (n=3) ...................................................................................................................................33 Bảng 3.10. Một số đặc tính của bột nano rutin khi loại dung môi bằng phương pháp phun sấy (n=3)...........................................................................................................35 Bảng 3.11. Độ hòa tan của rutin nguyên liệu và bột nano rutin ...............................36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1. Đồ thị biễu diễn mối tương quan giữa nồng độ rutin và độ hấp thụ quang đo được tại bước sóng 256,5 nm ...............................................................................22 Hình 3.2. KTTP và PDI của nano rutin khi bào chế với dung môi khác nhau .........24 Hình 3.3. KTTP và PDI của nano rutin khi bào chế với polyme khác nhau ............25 Hình 3.4. KTTP và PDI của nano rutin với nồng độ HPMC E15 khác nhau ...........27 Hình 3.5. KTTP và PDI của nano rutin của nano rutin với nồng độ rutin khác nhau ...................................................................................................................................28 Hình 3.6. KTTP và PDI của nano rutin với tỉ lệ dung môi hòa tan và dung môi kết tủa thay đổi ................................................................................................................30 Hình 3.7. KTTP và PDI của nano rutin với chất diện hoạt khác nhau .....................31 Hình 3.8. KTTP và PDI của nano rutin với các thiết bị trộn khác nhau ...................32 Hình 3.9. KTTP và PDI của nano rutin với thời gian siêu âm khác nhau ................34 Hình 3.10. Đồ thị độ hòa tan của rutin nguyên liệu và nano rutin ở pH 6,8 .............37 Hình 3.11. Phổ DSC của rutin nguyên liệu và nano rutin phun sấy .........................38 Hình 3.12. Hình ảnh phổ hồng ngoại của rutin nguyên liệu, tá dược và nano rutin .38 Hình 3.13. Hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X của rutin nguyên liệu và nano rutin ..........39 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ --------------------------------------------------------------------------------- 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ----------------------------------------------------------------- 2 1.1. Tổng quan về rutin ---------------------------------------------------------------------2 1.1.1. Vài nét về rutin -------------------------------------------------------------------- 2 1.1.2. Công thức hóa học và tính chất vật lý ------------------------------------------ 2 1.1.3. Dược động học -------------------------------------------------------------------- 3 1.1.4. Tác dụng dược lý ------------------------------------------------------------------ 3 1.1.5. Một số dạng bào chế -------------------------------------------------------------- 5 1.2. Tổng quan về hệ nano -----------------------------------------------------------------5 1.2.1. Khái niệm -------------------------------------------------------------------------- 5 1.2.2. Ưu nhược điểm -------------------------------------------------------------------- 5 1.2.3. Ứng dụng --------------------------------------------------------------------------- 7 1.2.4. Các phương pháp bào chế tiểu phân nano ------------------------------------- 7 1.3. Phương pháp kết tủa trong dung môi---------------------------------------------- 10 1.3.1. Phương pháp trộn đơn giản ---------------------------------------------------- 10 1.3.2. Phương pháp trộn khác --------------------------------------------------------- 10 1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa trong dung môi ------------------ 11 1.4. Một số nghiên cứu về nano rutin -------------------------------------------------- 12 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------------- 14 2.1. Nguyên liệu --------------------------------------------------------------------------- 14 2.2. Thiết bị, dụng cụ --------------------------------------------------------------------- 14 2.2.1. Thiết bị --------------------------------------------------------------------------- 14 2.2.2. Dụng cụ --------------------------------------------------------------------------- 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu------------------------------------------------------------ 15 2.3.1. Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang ------------------------------ 15 2.3.2. Bào chế nano rutin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi ----------- 16 2.3.3. Đánh giá một số đặc tính của hỗn dịch nano rutin -------------------------- 18 2.3.4. Đánh giá một số đặc tính của bột nano rutin -------------------------------- 18 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ----------------------------------------------------- 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ -------------------------------------------------------------------- 22 3.1. Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang ---------------------------------- 22 3.1.1. Xác định điểm hấp thụ cực đại ------------------------------------------------ 22 3.1.2. Xây dựng đường chuẩn --------------------------------------------------------- 22 3.2. Bào chế nano rutin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi. --------------- 23 3.2.1. Khảo sát loại dung môi --------------------------------------------------------- 23 3.2.2. Khảo sát loại polyme ----------------------------------------------------------- 24 3.2.3. Khảo sát nồng độ polyme ------------------------------------------------------ 26 3.2.4. Khảo sát nồng độ dược chất --------------------------------------------------- 27 3.2.5. Khảo sát tỉ lệ dung môi hòa tan và dung môi kết tủa----------------------- 29 3.2.6. Khảo sát chất diện hoạt --------------------------------------------------------- 30 3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của thiết bị trộn ----------------------------------------- 32 3.2.8. Khảo sát thời gian siêu âm ----------------------------------------------------- 33 3.3. Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano rutin ------------------------------ 35 3.3.1. KTTP, PDI, thế zeta của bột nano rutin -------------------------------------- 35 3.3.2. Độ tan bão hòa của nano rutin ------------------------------------------------- 36 3.3.3. Độ hòa tan của rutin nguyên liệu và nano rutin ----------------------------- 36 3.3.4. Phân tích nhiệt vi sai (DSC) --------------------------------------------------- 37 3.3.5. Phổ hồng ngoại ------------------------------------------------------------------ 38 3.3.6. Phổ nhiễu xạ tia X--------------------------------------------------------------- 39 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ----------------------------------------------------------------- 41 4.1. Phương pháp bào chế nano rutin --------------------------------------------------- 41 4.2. Kết quả khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới KTTP------------------------------------ 41 4.3. Về phương pháp đưa hỗn dịch bào chế về dạng bột ---------------------------- 42 4.4. Đặc tính của tiểu phân nano rutin bào chế được --------------------------------- 43 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ -------------------------------------------- 44 5.1. Kết luận ------------------------------------------------------------------------------- 44 5.2. Kiến nghị ------------------------------------------------------------------------------ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO --------------------------------------------------------------------PHỤ LỤC --------------------------------------------------------------------------------------- 5 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, dược liệu và các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâm do có nhiều tiềm năng trong điều trị và ít tác dụng phụ hơn so với các thuốc hoá dược. Rutin hay còn được gọi là Vitamin P, là một flavonoid tự nhiên, phân bố rộng rãi trong các loài thực vật với những hàm lượng khác nhau. Rutin có hàm lượng lớn trong cây hòe, đặc biệt cây hòe được trồng tại Việt Nam cho hàm lượng rutin lên đến 20% trong nụ hoa, cao hơn nhiều lần so với các nước khác. Rutin mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, ví dụ như: là chất chống oxy hóa, tăng độ bền thành mạch, chống viêm, hạ huyết áp, giảm mỡ máu, .....[25] Tuy nhiên, do đặc tính kém tan trong nước nên sinh khả dụng đường uống của rutin thấp, chỉ khoảng 20%, dẫn đến không đáp ứng được hiệu quả lâm sàng như mong muốn [7]. Do đó, các nhà khoa học luôn nghiên cứu, phát triển các công thức bào chế rutin với mục đích làm tăng độ tan, tăng sinh khả dụng đường uống để tăng hiệu quả điều trị. Cùng với sự phát triển không ngừng của công nghệ bào chế, nhiều phương pháp khác nhau được nghiên cứu nhằm khắc phục nhược điểm và nâng cao hiệu quả sử dụng rutin. Các kỹ thuật bào chế nano như: đồng nhất áp suất cao [5, 37], nghiền bi [4, 35],…giúp tăng đáng kể độ tan của rutin. Trong đó phương pháp kết tủa trong dung môi là phương pháp đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế và đem lại hiệu quả cao. Phương pháp này được áp dụng không chỉ với dược chất tổng hợp hóa học mà còn cả những hợp chất từ tự nhiên [61]. Do đó đề tài: “Nghiên cứu bào chế nano rutin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi’’ được tiến hành với hai mục tiêu chính sau: 1. Bào chế được nano rutin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi. 2. Đánh giá được một số đặc tính của nano rutin đã bào chế. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rutin 1.1.1. Vài nét về rutin Rutin là một flavonoid thuộc nhóm flavon lần đầu tiên được phân lập vào năm 1984 từ cây Cửu lý hương (Ruta graveolen) bởi Veyss [6]. Công thức hóa học của Rutin được xác định bởi Schnidt vào năm 1904. Cho đến năm 1962, Rutin đã được tổng hợp toàn phần [3]. Rutin được tìm thấy trong nhiều cây dược liệu thuộc các họ thực vật với các hàm lượng khác nhau. Điển hình, rutin được tìm thấy có hàm lượng lớn trong các cây : Tam giác mạch ( Fagopyrum esculentum Moench) có hàm lượng rutin là 4% trong hoa và 6,83% trong thân cây, Cà chua (Lycopersicon esculentum Miller ) có khoảng 2,4% trong lá, Dâu tằm (Morus alba L.) trong lá có khoảng 6% [8] . Đặc biệt, ở Việt Nam, rutin có hàm lượng cao lên đến 20% trong nụ hoa hòe (Sophora japonica L). 1.1.2. Công thức hóa học và tính chất vật lý Hình 1.1. Công thức rutin Công thức hóa học: C27H30O16. Tên theo IUPAC: 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -5,7-dihydroxy-3 – [(2 S , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R ) -3,4,5-trihydroxy-6 – [[(2 R , 3 R , 4 R , 5 R , 6 S ) -3,4,5-trihydroxy6-metyloxan-2-yl] oxymetyl] oxan-2-yl] oxychromen-4-one [1]. Tên gọi khác: Quercetin-3-rutosid, rhamnoglucosid, Rutosid, Sclerutin, Sophorin. 2 Eldin, Oxerutin, Quercetin-3- Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu vàng hay màu lục, không mùi khi bay hơi có mùi đặc trưng. Để ra ánh sáng màu có thể sẫm lại. Tinh thể kết tinh ngậm 3 phân tử nước và chuyển sang dạng khan khi sấy ở 12 giờ ở 1100C và 10mmHg [2]. Rutin khan màu nâu, có tính hút ẩm. Nhiệt độ nóng chảy: 183-1940C. Tính tan: Độ tan của rutin trong nước là 0,13mg/mL, trong methanol là 55mg/mL, và trong ethanol là 5,5mg/mL [25]. 1.1.3. Dược động học Rutin được hấp thu tương đối kém ở ruột, sinh khả dụng đường uống của rutin khoảng 20% [7]. Hệ vi sinh của ruột thủy phân rutin thành aglycone, quercetin và cặn đường, sau đó được thành ruột non hấp thu [13, 48, 55]. Sự chuyển hóa của rutin đã được nghiên cứu khi dùng đường uống cho chuột và thỏ. Phân tích mẫu nước tiểu của chúng cho thấy ba chất chuyển hóa của rutin là acid 3,4-dihydroxyphenylcetic, 3metoxy-4-hydroxyphenylaceticacid, và acid m-hydroxyphenylacetic [32]. Các chất chuyển hóa này được hình thành sau lần đầu tiên đi qua gan. Một chất chuyển hóa khác là quercetin-3-omethyl ether được phát hiện trong mật khi cho chuột dùng rutin [23]. 1.1.4. Tác dụng dược lý ❖ Tác dụng chống oxy hóa Rutin là một chất chống oxy hóa phenolic, có khả năng lấy đi các gốc tự do superoxid và tạo phức chelat với các ion kim loại. Hoạt tính chống oxy hóa của rutin là do phần aglycol-quercetin (là một sản phẩm chuyển hóa của rutin trong quá trình tiêu hóa). Trước đây, rutin được sử dụng như một thuốc chống dị ứng, kháng khuẩn, chống viêm,… Tuy nhiên, ngày nay các nhà nghiên cứu khám phá ra rằng rutin có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh mãn tính như tiểu đường, ung thư, huyết áp cao và tăng cholesterol nhờ vào khả năng chống oxy hóa của nó [19, 30, 58]. ❖ Tác dụng trong điều trị đái tháo đường Rutin là một bioflavonoid có trong nhiều loài thực vật được các nhà khoa học chứng minh có tác dụng tốt đối với bệnh đái tháo đường bằng cách kiểm soát đường 3 huyết, và các biến chứng của bệnh. Các cơ chế cho hiệu quả cải thiện đường huyết bao gồm giảm hấp thu carbohydrate ở ruột bằng cách ức chế α-glucosidase và αamylase tham gia vào quá trình tiêu hóa carbohydrate, giảm gluconeogenesis, tăng hấp thu glucose ở mô, kích thích sản sinh insulin ở tuyến tụy, bảo vệ đảo Langerhans chống lại sự lão hóa [22]. Ngoài ra, rutin còn có tác dụng trong việc kiểm soát các biến chứng của bệnh đái tháo đường như rối loạn lipid máu, bệnh thận, tổn thương gan, tim mạch,…bằng các cơ chế giảm hình thành sorbitol và các cytokine gây viêm [22]. ❖ Tác dụng đối với hệ tim mạch Rutin được chứng minh rằng có tác dụng hạ huyết áp và ngăn ngừa tổn thương oxy hóa trong “tế bào nội mô động mạch chủ” bằng cách giảm hoạt tính miễn dịch nitrotyrosine. Với việc tăng sản xuất NO trong các tế bào nội mô của người thì rutin giúp cải thiện chức năng nội mô. Trong các nghiên cứu in vitro, rutin được chứng minh gây ra sự ức chế tập kết tiểu cầu, giảm tính thấm mao mạch và cải thiện lưu thông máu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng rutin có thể giúp ngăn ngừa cục máu đông, do đó có thể được sử dụng để điều trị cho các trường hợp có nguy cơ bị các cơn đau tim và đột quỵ [20]. ❖ Tác dụng chống viêm Rutin có thể dùng để điều trị các triệu chứng viêm thông qua sự ức chế của protein HMGB1, được tiết ra bởi các tế bào miễn dịch, có tác dụng như một cytokin trung gian làm giảm viêm. Rutin có khả năng phòng và chữa bệnh viêm kết ruột với cơ chế có thể giải thích là do làm tăng nồng độ glutathion liên kết, làm giảm các chuỗi oxy hóa gây viêm. Ngoài ra, rutin còn được sử dụng trong các trường hợp dị ứng, chống thấp khớp, da bị tổn thương, giúp chóng liền sẹo [24]. ❖ Tác dụng chống ung thư Nhiều nghiên cứu trên cả in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng rutin có tác dụng chống ung thư. Các cơ chế đã được xác định bao gồm khả năng bất hoạt các chất gây ung thư, chống sự lan truyền, ức chế sự hình thành hạch, chống oxy hóa, khả năng bắt giữ các tế bào…hoặc là kết hợp các cơ chế trên [17]. Trong một nghiên cứu in vivo, Alonso-Castro, Domínguez và García Carrancá (2013) đã quan sát thấy rằng rutin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư đại tràng (SW480) tuy nhiên không gây độc đối với các tế bào bình 4 thường [11]. Nasiri và cộng sự (2016) cũng đã chứng minh được rằng việc sử dụng rutin với 5-FU và / hoặc oxaliplatin hiệu quả hơn so với việc chỉ sử dụng riêng lẻ các thuốc trên để điều trị tế bào ung thư đại tràng [40]. 1.1.5. Một số dạng bào chế Bảng 1.1. Một số sản phẩm chứa rutin trên thị trường Tên thương mại Thành phần chính Hàm Dạng bào chế lượng Mevon Rutin 500 mg Viên bao phim Meflavon Rutin 500 mg Viên bao phim Rutin-Vitamin C Rutin, vitamin C 50 mg Viên bao đường Swanson Rutin Rutin 500 mg Viên nang mềm Antioxidants Bio-Rutin Rutin, bioflavonoids 500 mg Viên nén Siduol Tocopherol calcium succinat; Rutin 100 mg Viên nang Venrutine Rutin, vitamin C 500mg Viên nén bao phim complex 1.2. Tổng quan về hệ nano 1.2.1. Khái niệm Tiểu phân nano là tiểu phân phân tán hoặc tiểu phân rắn có kích thước 10 1000 nm. Dược chất được hòa tan, đóng gói hoặc gắn lên matrix tiểu phân nano. Tùy thuộc vào phương pháp bào chế mà có thể tạo thành các chế phẩm khác nhau như nang nano, nano cầu. Nang nano là hệ mà thuốc được giam giữ bên trong bởi lớp màng polyme đồng nhất xung quanh. Nano cầu là hệ matrix trong đó thuốc được phân tán đồng nhất [28, 39]. 1.2.2. Ưu nhược điểm 1.1.1.1. Ưu điểm Khi kích thước tiểu phân được giảm xuống mức nano dẫn đến làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của tiểu phân lên gấp nhiều lần, từ đó cải thiện độ tan và tốc độ hoà tan của dược chất, tiểu phân dễ dàng thấm qua màng, tăng sinh khả dụng, tương tác đặc hiệu với tế bào và mô [42]. Tiểu phân thuốc nano có thể thay đổi bề mặt để kéo dài thời gian tuần hoàn, tránh tác động của hệ thống thực bào trong cơ thể. Các tiểu phân nano tương hợp sinh 5 học cho thấy có nhiều ưu điểm hơn so với các dạng thuốc tương tự như tăng tác dụng, giảm độc tính, hấp thu vào tế bào thông qua màng, qua được hàng rào máu não và tới các tế bào đích [28]. Tiểu phân nano có thể giải phóng kiểm soát hoặc kéo dài trong suốt quá trình vận chuyển và ở vị trí khu trú, biến đổi sự phân bố tại các cơ quan và sự thanh thải của thuốc để làm tăng hiệu quả điều trị và giảm tác dụng không mong muốn [28, 39, 42]. Thuốc nano có thể dùng nhiều đường khác nhau như đường tiêm, đường uống, qua da, phổi, mắt và kiểm soát sự giải phóng thuốc ở đường tiêu hóa [42]. Có thể dễ dàng điều chỉnh các đặc tính giải phóng và phân hủy các hạt tiểu phân nhờ lựa chọn chất mang phù hợp. 1.1.1.2. Nhược điểm Khó khăn trong quá trình bào chế Kích thước hạt khi bào chế bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: dung môi hòa tan, nồng độ dược chất, tốc độ khuấy trộn, nhiệt độ, thời gian khuấy trộn, tỷ lệ dung môi. Việc đảm bảo nghiêm ngặt các điều kiện này trong suốt quá trình bào chế là tương đối khó khăn, hơn thế các tiểu phân có xu hướng dễ kết tụ do năng lượng tự do bề mặt lớn, do vậy nếu không kiểm soát tốt sẽ không đạt được kích thước tiểu phân (KTTP) mong muốn [46]. Khó khăn trong bảo quản Trong quá trình bảo quản, các tiểu phân nano trong hệ luôn có xu hướng kết tập với nhau tạo thành các tiểu phân nano lớn hơn để giảm năng lượng bề mặt tự do, đặc biệt là các hệ có KTTP từ 10 đến 100 nm. Độc tính của hệ nano Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh rất nhiều ưu điểm như tăng sinh khả dụng, tác dụng tại đích, ổn định dược chất thì một vài hệ nano có thể có nguy cơ gây độc cho cơ thể [26, 43]. Các tiểu phân nano hấp thu qua đường dạ dày – ruột có khả năng gây độc tính do tích tụ tại các mảng Peyer. Hạt nano có thể vào não thông qua hai đường chính là hấp thu qua hàng rào máu não và qua kênh “trans – synaptic” sau tiếp xúc với niêm mạc mũi. Điện thế bề mặt của hạt nano làm thay đổi tính thấm của hàng rào máu não và gây độc cho não [26]. 6 1.2.3. Ứng dụng Phương pháp tạo hệ nano mang lại nhiều lợi ích nên nhiều lĩnh vực đã ứng dụng phương pháp này vào thực tiễn để tăng hiệu quả sử dụng của vật liệu, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm. Thiết kế bào chế các loại thuốc nano sử dụng theo nhiều đường khác nhau cho thấy hiệu quả, thuận tiện; kéo dài đời sống của thuốc; tiết kiệm chi phí cho người bệnh; ít độc tính. Tiểu phân nano được ứng dụng cho điều trị và chẩn đoán được chia thành 2 nhóm: tiểu phân nano hữu cơ (lyposome, micelle, polymeic, dendrimer...) và tiểu phân nano vô cơ (vàng, sắt, bạc...). Tiểu phân nano vô cơ đã thành công trong thử nghiệm tiền lâm sàng và được ứng dụng trong lâm sàng trong điều trị bệnh và chẩn đoán hình ảnh. Tiểu phân nano vàng với đặc tính dễ tổng hợp, dễ kiểm soát hình dạng và kích thước, ổn định, tương thích sinh học đã ứng dụng trong trị liệu và chẩn đoán ung thư [50]. Cùng với tiểu phân nano vàng thì tiểu phân nano sắt oxid cũng được ứng dụng như chất mang của thuốc điều trị ung thư bao gồm 5-FU [18], doxorubicin [29], paclitacel [34],.. Tiểu phân nano hữu cơ được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng như thuốc điều trị ung thư, thuốc điều trị virus… Nhiều thuốc ung thư được sử dụng gây nhiều tác dụng không mong muốn cho cơ thể bởi tính không đặc hiệu như thuốc hóa trị. Công nghệ nano ra đời đã tạo ra một bước ngoặt trong điều trị bệnh hướng đích, giảm tác dụng độc hại lên những tế bào lành trong cơ thể [49]. Chất mang nano thường được dùng là liposome, polyme micelle, dendrimer… Một số thuốc bào chế dưới dạng polyme micelle được sử dụng như cisplastin, NK012, SP1049, Genexol PM [44]. 1.2.4. Các phương pháp bào chế tiểu phân nano Hiện nay các phương pháp bào chế tiểu phân nano được chia thành 2 nhóm: Từ dưới lên “Bottom - up” và từ trên xuống “Top - down”. 1.2.4.1. Phương pháp từ trên xuống Top - down gồm các phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân có kích thước lớn thành các các tiểu phân nhỏ hơn bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau như nghiền, đồng nhất tốc độ cao, đồng nhất áp lực cao [12, 41]… Các phương pháp này không sử dụng dung môi độc hại nhưng cần năng lượng đầu vào cao và hiệu quả phương pháp thấp và hạn chế trong giảm kích thước tiểu phân, yêu cầu thời gian dài để giảm kích thước tiểu phân đến dưới 100nm. Các phương pháp bao gồm: a. Kỹ thuật nghiền ❖ Nghiền ướt 7 Hỗn hợp được đưa vào máy nghiền có chứa các bi nghiền nhỏ. Bi nghiền được xoay vòng với tốc độ cao ở nhiệt độ xác định, chúng di chuyển bên trong buồng nghiền và va chạm với lớp vật liệu nằm ở thành buồng phía đối diện. Sự kết hợp của lực ma sát và lực va chạm mạnh làm giảm kích thước tiểu phân [45]. Vật liệu nghiền là các bi làm bằng chất liệu cứng như: thép, kẽm oxid, thủy tinh hoặc polyme đặc biệt (polystyren siêu cứng). ❖ Nghiền khô Trong phương pháp này, hợp chất được nghiền khô với polyme hòa tan và các đồng polyme sau đó phân tán trong nước. Các polyme hòa tan và đồng polyme thường được sử dụng là PVP, PEG, HPMC và các dẫn xuất của cyclodextrin [54, 57]. Tính chất hóa lý và khả năng hòa tan của các dược chất kém tan có thể được cải thiện bằng phương pháp nghiền khô do cải thiện mức độ phân cực bề mặt và chuyển đổi từ dạng kết tinh sang dạng vô định hình. Phương pháp áp dụng cho hoạt chất dễ bị phân hủy khi có mặt của nước. b. Đồng nhất hóa phân cắt cao Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao cấu tạo gồm có một roto và một stato. Roto được thiết kế bao gồm nhiều lưỡi cắt, còn stato có nhiều khe hở hướng theo chiều dọc hoặc đường chéo xung quanh trục đồng hóa. Các lưỡi cắt được đặt đồng tâm và nằm bên trong stato. Khi roto quay, chất lỏng được ly tâm buộc phải đi qua các khe hở của stato. Một lực hút được tạo ra và làm cho một lượng lớn chất lỏng được rút lên vào khu vực bên trong roto. Một năng lượng cơ học lớn được đưa vào trong một không gian nhỏ với việc hình thành tối thiểu các dòng xoáy làm giảm kích thước các tiểu phân trong khối chất lỏng. Hai lực tác động chủ yếu của quá trình là lực ly tâm gây va chạm cơ học vào phần stato và lực phân cắt được tạo ra trong vùng hỗn loạn giữa roto và stato [53]. c. Đồng nhất hóa áp suất cao Trong phương pháp này, hỗn dịch của dược chất được nén dưới áp lực cao qua một van có kích thước nhỏ. Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển dựa trên nguyên tắc của phương pháp này như dissocubes, nanopure, nanoedge [33]. ❖ Dissocubes Nguyên tắc: Khi đi qua khe hở nhỏ của van đồng nhất, áp suất động của dòng chất lỏng tăng đồng thời với việc giảm áp suất tĩnh xuống dưới điểm sôi của nước ở nhiệt độ phòng. Kết quả, nước bắt đầu sôi tại nhiệt độ phòng và hình thành các bong 8 bóng khí, chúng bị nổ tung khi hỗn dịch ra khỏi kẽ hở hẹp và trở lại áp suất không khí bình thường. Lực nổ của bóng khí đủ để phá vỡ các vi hạt thành các tiểu phân nano. Như vậy kích thước tiểu phân giảm thông qua quá trình tạo bọt, ngoài ra còn nhờ lực cắt lớn và lực va chạm giữa các tiểu phân. Kích thước tiểu phân thu được phụ thuộc vào các yếu tố như độ cứng của tinh thể dược chất, nhiệt độ, áp suất đồng nhất và số vòng đồng nhất. ❖ Nanopure Nanopure là kỹ thuật đồng nhất trong môi trường không phải là nước hoặc các hỗn hợp với thành phần nước tối thiểu. Với kỹ thuật này, hỗn dịch được đồng nhất ở 0°C thậm chí ở dưới mức đóng băng, rất thích hợp với các chất không bền với nhiệt. ❖ Nanoedge Trong kỹ thuật này, hỗn dịch thu được bằng phương pháp kết tủa tiếp tục được đồng nhất hóa, do đó kích thước tiểu phân tiếp tục được làm giảm và tránh được sự lớn lên của tinh thể, khắc phục được hạn chế của phương pháp kết tủa. Kết quả là kích thước tiểu phân nhỏ hơn và có độ ổn định tốt hơn. 1.2.4.2. Phương pháp từ dưới lên Bottom - up còn được gọi rộng ra là quá trình ngưng tụ bởi vì nguyên tắc áp dụng là tạo tiểu phân thuốc ngưng tụ từ dung dịch thuốc quá bão hòa. Sự ngưng tụ xảy ra khi tăng sự quá bão hòa của hệ bằng cách hóa hơi dung môi, giảm nhiệt độ hoặc trộn dung dịch với dung môi kết tủa. Phương pháp có nhiều ưu diểm như đơn giản, yêu cầu thiết bị đơn giản, ít năng lượng, không quá tốn kém, có thể sử dụng cho thuốc kém bền với nhiệt [10]. Để đạt được tinh thể nano thuốc với sự phân bố kích thước mong muốn thì có một số phương pháp kết tủa được sử dụng như kết tủa trong dung môi, sử dụng dung môi siêu tới hạn và sử dụng năng lượng cao. ❖ Kết tủa trong dung môi Phương pháp kết tủa trong dung môi và các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình sẽ được trình bày ở mục sau. ❖ Sử dụng dung môi siêu tới hạn Sử dụng dung môi siêu tới hạn bao gồm carbon dioxid, ammoniac, fluoroform, ethane và ethylen. Tuy nhiên do độc tính và khả năng dễ bốc cháy cho nên hạn chế 9 sử dụng dung môi này trong ứng dụng dược phẩm. CO2 được sử dụng nhiều nhất bởi áp suất cần thiết tương đối nhỏ, nhiệt độ cần thiết gần nhiệt độ xung quanh làm cho CO2 dễ chuyển thành trạng thái siêu tới hạn. Hơn nữa nó không độc, có sẵn, không đắt, không dễ cháy. Kĩ thuật nhờ khả năng khuếch tán cao và bốc hơi nhanh ở áp suất thấp của dung môi siêu tới hạn để kết tủa tiểu phân dược chất. ❖ Sử dụng năng lượng cao (kết hợp các kĩ thuật) Năng lượng cao được cung cấp trong suốt quá trình hoặc sau khi quá trình hoàn tất. Năng lượng cao có thể được cung cấp bằng nhiều cách như đồng nhất áp suất cao, sóng âm, trộn năng lượng cao… 1.3. Phương pháp kết tủa trong dung môi Đây là phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất. Phương pháp áp dụng không chỉ với phân tử hữu cơ tổng hợp mà còn cả những hợp chất từ tự nhiên. Trong quá trình này hoạt chất được hòa tan trong một dung môi có thể trộn lẫn được với nước để tạo độ hòa tan phù hợp. Sau đó dung dịch này được trộn lẫn với dung môi kết tủa – đa phần là nước. Việc lựa chọn dung môi hoà tan và dung môi kết tủa, tỉ lệ thể tích hai dung môi này, thiết bị trộn là thông số cần thiết trong quá trình. Và quá trình này có thể bao gồm phương pháp trộn đơn giản hoặc phương pháp trộn khác. 1.3.1. Phương pháp trộn đơn giản Trong quá trình này dung dịch dược chất được trộn với dung môi kết tủa bằng cách sử dụng lực trộn cơ học. Dung môi thường là dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, methanol, isopropanol… Dung môi được lựa chọn là dung môi cho độ tan của hoạt chất cao nhất. Và dung môi kết tủa là dung dịch thân nước của chất ổn định. 1.3.2. Phương pháp trộn khác Tiểu phân có kích thước nhỏ hơn bằng cách sử dụng phương pháp trộn biến đổi, kết quả của quá trình trộn nhanh hơn sẽ ảnh hưởng tới giai đoạn tạo mầm hoặc hạn chế sự phát triển hơn nữa của tiểu phân. ➢ Sóng siêu âm Sóng siêu âm được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu để tạo sự kết tinh. Năng lượng sóng siêu âm có thể tạo ra bằng cách nhúng đầu dò siêu âm vào bình chứa dung môi kết tủa. Dung môi hòa tan được thêm từ từ vào dung môi kết tủa. Siêu âm làm tăng quá trình trộn mức micro, giảm sự lớn lên và kết tập tiểu phân. Kết quả của phương pháp có thể đạt được là tiểu phân vô định hình với sự phân bố kích thước 10 đồng nhất. Kích thước tiểu phân phụ thuộc vào thời gian siêu âm, cường độ, sự tạo bong bóng, độ sâu và chiều dài của giá. ➢ Kĩ thuật ngưng tụ hóa hơi Trong quá trình này, hoạt chất được hòa tan trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp và được đun nóng đến nhiệt độ sôi của dung môi. Sau đó, dung dịch đun nóng trên được phun vào dung môi chứa chất ổn định đã được đun nóng. 1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa trong dung môi 1.3.3.1. Dược chất Tiểu phân thuốc nano với diện tích bề mặt lớn, năng lượng tự do bề mặt lớn nên trong quá trình bảo quản có xu hướng tái kết tinh hoặc ‘chín muồi Ostwald’ - tức là lắng đọng để ổn định. Nồng độ dược chất là một trong những thông số ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân. Nồng độ dược chất tối ưu là nồng độ yêu cầu để đạt kích thước tiểu phân nhỏ hơn. Tuy nhiên khi nồng độ dược chất vượt qua nồng độ tối ưu thì dẫn đến tăng kích thước tiểu phân. Điều đó cho thấy khi nồng độ dược chất tăng lên thì tốc độ tạo mầm càng tăng, lớn hơn nhiều tốc độ tăng trưởng do sự quá bão hòa càng cao. Khi tăng nồng độ dược chất sẽ làm tăng độ nhớt của dung dịch do vậy giảm tốc độ khuếch tán giữa hai pha. Điều đó dẫn đến các tiểu phân có xu hướng kết tụ lại với nhau tạo tiểu phân có kích thước lớn hơn. Như vậy để đạt được tiểu phân thuốc nano mịn thì cần tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ dược chất khác nhau để xác định nồng độ tối ưu [59]. 1.3.3.2. Dung môi hòa tan và dung môi kết tủa Thông thường dung môi được chọn cần đáp ứng một số tiêu chí như hòa tan hoạt chất tốt, dễ loại khỏi trong quá trình để thu dạng bột nano, có thể trộn lẫn được với dung môi kết tủa. Dung môi có thể là một hoặc hỗn hợp dung môi để hòa tan hoạt chất tốt nhất. Khi dung môi trong hỗn hợp trộn lẫn không được loại bỏ thì làm tăng hiện tượng “chín muồi Ostwald” do làm tăng độ tan nội sinh của hoạt chất [14]. Do vậy việc loại bỏ dung môi là rất cần thiết để tăng độ ổn định cho tiểu phân thuốc nano. Tỉ lệ thể tích dung môi hoà tan/dung môi kết tủa cũng là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình kết tủa trong dung môi. Tỉ lệ này ảnh hưởng tới mức độ quá bão hòa, từ đó dẫn đến ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân. Tỉ lệ dung môi hoà tan/dung môi kết tủa càng giảm thì mức độ quá bão hòa càng cao [52]. Điều này dẫn đến làm tăng tốc độ tạo mầm, giảm tốc độ tăng trưởng, giảm kích thước tiểu phân. Tuy nhiên tỉ lệ 11 này cũng có giới hạn tối ưu, nếu vượt qua tỉ lệ tối ưu thì việc giảm kích thước tiểu phân ít có ý nghĩa. 1.3.3.3. Quá trình trộn Để đạt được tiểu phân rất mịn thì dung môi hoà tan và dung môi kết tủa phải được trộn lẫn ở mức tối đa [38]. Khi tăng tốc độ dòng sẽ làm giảm thời gian trộn lẫn giữa hai pha, do vậy quá trình bão hòa đạt nhanh và đồng nhất dẫn đến tăng tốc độ tạo mầm, giảm kích thước tiểu phân [60]. Tốc độ khuấy cũng ảnh hưởng lên kích thước tiểu phân. Khi tăng tốc độ khuấy thì hỗn hợp có thể đạt mức độ phân tử, quá trình quá bão hòa đạt nhanh dẫn đến giảm kích thước tiểu phân, đồng thời giảm diện tích bề mặt đặc hiệu giữa 2 pha, tăng tốc độ khuếch tán của các tiểu phân giữa hai pha tránh sự kết tụ. Tuy nhiên, việc tăng tốc độ khuấy còn tiêu tốn năng lượng, gây tốn kém chi phí. Bên cạnh đó thời gian khuấy cũng cần quan tâm. Tăng thời gian khuấy cũng gây tiêu tốn năng lượng, chi phí và làm tăng kích thước tiểu phân [16, 36, 38]. 1.3.3.4. Chất ổn định Khi tiểu phân giảm kích thước xuống mức nano thì sẽ tăng diện tích bề mặt và năng lượng tự do bề mặt dẫn đến kém bền về mặt nhiệt động học, tiểu phân có xu hướng kết tập lại với nhau để tối thiểu năng lượng bề mặt. Các chất ổn định sẽ bao gói hoặc ngăn cản thuốc khỏi sự kết tập hoặc hấp phụ lên bề mặt tiểu phân thuốc. Chất ổn định sẽ ổn định theo 2 cơ chế là cản trở về không gian hoặc tĩnh điện trên bề mặt tiểu phân để đẩy nhau khi đứng gần nhau tránh hiện tượng kết tụ tiểu phân [51] . 1.4. Một số nghiên cứu về nano rutin Nước ngoài Năm 2009, Rachmat Mauludin và cộng sự đã nghiên cứu phát triển công thức tinh thể nano rutin đường uống. Phương pháp được các tác giả sử dụng là đồng nhất hóa ở áp suất cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau quá trình bào chế thu được nano rutin với KTTP là 717nm và PDI là 0,265 [37]. Năm 2020, Sarmistha Saha và cộng sự nghiên cứu bào chế hạt nano rutin và tác dụng của nó đối với sự phát triển có kiểm soát và hình thái của các tinh thể canxi oxalat. Phương pháp được nhóm tác giả sử dụng là kết tủa trong dung môi và dung môi hòa tan được sử dụng là ethanol. Kích thước tiểu phân nano rutin nhóm tác giả bào chế được là 379 nm và PDI là 0,221 [47]. 12