Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp dược học đánh giá tác dụng điều trị bệnh parkinson của các hợp chất trong cây câu đằng (uncaria rhynchophylla) bằng phương pháp docking phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CAO THỊ LAN ANH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON CỦA CÁC HỢP CHẤT TRONG CÂY CÂU ĐẰNG (UNCARIA RHYNCHOPHYLLA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: Cao Thị Lan Anh ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON CỦA CÁC HỢP CHẤT TRONG CÂY CÂU ĐẰNG (UNCARIA RHYNCHOPHYLLA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2017.Y Người hướng dẫn : PGS.TS. Bùi Thanh Tùng Hà Nội - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Bùi Thanh Tùng, Trưởng bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy đã tận tình chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Tạ Thị Thu Hằng, sinh viên lớp K6 Dược học, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo, thầy cô Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại đây trong suốt 5 năm qua và thực hiện đề tài này. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, song với kiến thức, kỹ năng và thời gian còn hạn chế, luận văn của tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Cao Thị Lan Anh DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh A2AAR A2A Adenosine Receptor AR Adenosin receptor COMT Catechol-O-methyl-transferase IC50 The half-maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối concentration đa 50% L-dopa MAO-B MPTP Tiếng Việt Thuốc Levodopa Monoamine oxidase B 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine Vận động MS Motor Symptom NMDA N-methyl-D-aspartate NMS Non-Motor Symptom Không vận động PD Parkinson’s Disease Bệnh Parkinson DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Dopamine (trái) và Levodopa (phải)............. 6 Hình 1.2. Tiền chất liên hợp và các sản phẩm thủy phân: (a) Dạng thủy phân được quan sát chủ yếu trong não chuột, (b) Dạng thủy phân được quan sát chủ yếu trong máu người ....................................................................................... 8 Hình 1.3. Cây Câu đằng và các bộ phận dùng làm thuốc.............................. 10 Hình 2.1. Cấu trúc 3D của protein A2AAR (ID: 3EML) (trái) và MAO-B (ID: 2V5Z) (phải). ................................................................................................. 14 Hình 2.2. Hộp tìm kiếm (grid box) bao phủ vùng hoạt động của đích protein A2AAR (trái) và MAO-B (phải) ................................................................... 17 Hình 3.1. Kết quả sự chồng chất của phối tử đồng kết tinh ZMA (trái) và SAG (phải) trước và sau khi re-dock. ..................................................................... 19 Hình 3.2. Biểu diễn tương tác 2D của ZMA (trái) và SAG (phải) với các acid amin tương ứng tại vị trí hoạt động. .............................................................. 20 Hình 3.3. Biểu diễn tương tác 3D của các hợp chất Cinchonain Id (A), Acid hyptatic A (B), Acid uncarinic B (C), Acid ursolic lactone (D) với các acid amin trong vùng hoạt động của đích A2AAR ............................................... 26 Hình 3.4. Biểu diễn tương tác 3D của các hợp chất Cinchonain Id (A), Acid hyptatic A (B), Acid uncarinic B (C), Acid ursolic lactone (D) với các acid amin trong vùng hoạt động của đích MAO-B ............................................... 27 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của Cinchonain Id ............................................. 30 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của Acid hyptatic A........................................... 31 Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của Acid uncarinic B ......................................... 32 Hình 4.4. Cấu trúc hóa học của Acid ursolic lactone .................................... 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả mô phỏng docking của 9 hợp chất tiềm năng nhất và hai chất chứng dương.................................................................................................. 20 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm “giống thuốc” theo quy tắc 5 Lipinski. ....................................................................................................................... 21 Bảng 3.3. Kết quả phân tích các đặc tính dược động học và độc tính. .......... 22 MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh Parkinson .......................................................... 3 1.1.1. Bệnh Parkinson .......................................................................... 3 1.1.2. Chẩn đoán bệnh Parkinson ........................................................ 4 1.1.3. Điều trị bệnh Parkinson ............................................................. 4 1.2. Tổng quan về A2A adenosine receptor (A2AAR) và enzym monoamine oxidase B (MAO-B)................................................................. 6 1.2.1. A2A adenosine receptor (A2AAR) ............................................ 6 1.2.2. Enzym monoamine oxidase B (MAO-B)................................... 8 1.3. Tổng quan về cây Câu đằng (Uncaria rhynchophylla) .................... 9 1.4. Tổng quan về phương pháp in silico .............................................. 10 1.4.1. Docking phân tử ...................................................................... 11 1.4.2. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc ......................... 12 1.4.3. Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính .... 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 14 2.1. Đối tượng, nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ................................ 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................. 14 2.1.2. Nguyên liệu và thiết bị............................................................. 14 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 15 2.3.1. Sàng lọc bằng docking phân tử ................................................ 15 2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc ..................................... 17 2.3.3. Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính (ADMET) 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................. 19 3.1. Mô phỏng protein docking ............................................................. 19 3.1.1. Đánh giá quy trình docking ..................................................... 19 3.1.2. Kết quả sàng lọc docking của 80 hợp chất ............................... 20 3.2. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc ................................................. 21 3.3. Dự đoán các thông số ADMET ...................................................... 22 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................... 29 4.1. Cinchonain Id ................................................................................. 29 4.2. Acid hyptatic A............................................................................... 30 4.3. Acid uncarinic B ............................................................................. 31 4.4. Acid ursolic lactone ........................................................................ 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Ngày nay khi chất lượng cuộc sống càng được nâng cao thì tuổi thọ trung bình của con người ngày càng tăng lên, kéo theo đó là các vấn đề về già hóa dân số và các bệnh mắc phải ở người cao tuổi, đặc biệt là các bệnh về hệ thần kinh trung ương. Parkinson là bệnh rối loạn thoái hóa thần kinh phổ biển thứ 2 sau Alzheimer gây ra tình trạng rối loạn vận động và không vận động ảnh hưởng trực tiếp đến sinh hoạt hàng ngày, làm giảm chất lượng cuộc sống, thậm chí gây tử vong đối với người bệnh 1. Theo ước tính, hiện có hơn 6 triệu người trên toàn thế giới đang phải sống chung với Parkinson 2. Xu hướng bệnh ngày càng gia tăng do tuổi thọ trung bình tăng. Đã hơn 200 năm kể từ khi được bác sĩ người Anh James Parkinson công bố lần đầu vào năm 1817, đến nay thế giới vẫn chưa có phương pháp điều trị tối ưu cho căn bệnh này. Các thuốc điều trị hiện nay không làm giảm được một nửa tình trạng bệnh vì vậy, việc tìm kiếm các liệu pháp mới là vô cùng cần thiết 3. Theo Y học cổ truyền, Câu đằng là thảo dược quý làm giảm chứng kinh phong (co giật, run rẩy) là tiềm năng to lớn để điều trị Parkinson. Một nghiên cứu thử nghiệm ở những người mắc Parkinson tại Trung Quốc cho thấy việc sử dụng thảo dược này làm cải thiện tình trạng bệnh rõ rệt theo thời gian, đồng thời những người này đều thấy tăng khả năng giao tiếp, giảm bớt tình trạng lo lắng, khó ngủ, táo bón, chán ăn 4. Monoamine oxidase B và andenosine A2A receptor là 2 đích đến quan trọng trong điều trị Parkinson đã được chứng minh trong nhiều thử nghiệm in vitro và in vivo 5,6 . Trong những năm gần đây, in silico đã trở thành công cụ hiệu quả trong việc khám phá và phát triển các loại thuốc mới, vừa giúp tiết kiệm tiền bạc, thời gian, công sức mà còn tránh được nhiều rủi ro và sai sót 7. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp docking phân tử - phương pháp thường được sử dụng trong các nghiên cứu in silico nhằm tìm kiếm các hợp chất tiềm năng điều trị bệnh 7. 1 Từ các cơ sở nêu trên, đề tài “Đánh giá tác dụng điều trị bệnh Parkinson của các hợp chất trong cây Câu đằng (Uncaria rhynchophylla) bằng phương pháp docking phân tử” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: - Sàng lọc các hợp chất trong cây Câu đằng có tác dụng ức chế A2A adenosine receptor/Monoamine oxidase B bằng phương pháp docking phân tử. - Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc và tính toán các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Parkinson 1.1.1. Bệnh Parkinson Bệnh Parkinson (PD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phức tạp do mất các tế bào thần kinh dopamine và hình thành bất thường các thể Lewy chứa αsynuclein trong chất nền 8,9. Rối loạn vận động não, mất ổn định tư thế, rối loạn vận động mặt, cứng cơ và run là đặc trưng nổi bật của PD 10. Bên cạnh đó, rối loạn giấc ngủ, suy giảm nhận thức, trầm cảm, thay đổi tâm trạng, rối loạn tâm thần và sa sút trí tuệ được coi là những biến chứng không vận động 11. Bệnh thường khởi phát trung bình từ 65 đến 70 tuổi, tỉ lệ mắc tăng theo tuổi, chiếm 1-3% ở dân số trên 65 tuổi 12. Tuy nhiên có những trường hợp mắc bệnh trước 40 tuổi được gọi là PD khởi phát sớm, nguyên nhân chủ yếu do yếu tố di truyền. Tỉ lệ mắc bệnh hiện nay dao động từ 100 đến 200 trên 100.000 người và tỉ lệ mắc hàng năm là 15 trên 100.000 người. Nam giới có tỉ lệ mắc bệnh cao hơn nữ giới 13. Bệnh được chia thành 5 giai đoạn 14: - Giai đoạn 1: Triệu chứng 1 bên. Đây là mức độ nhẹ nhất. Bệnh nhân xuất hiện những cơn run đều, nhẹ và chưa ảnh hưởng tới cuộc sống hàng ngày khiến người mắc không ý thức được mình đang mắc bệnh nên chủ quan, bỏ qua. - Giai đoạn 2: Triệu chứng 2 bên, còn phản xạ tư thế. Dấu hiệu run, lắc rõ ràng hơn, dáng đi thay đổi do cứng cơ, nét mặt giảm biểu cảm. - Giai đoạn 3: Triệu chứng 2 bên, rối loạn phản xạ tư thế nhưng còn khả năng di chuyển độc lập. Người bệnh khó khăn trong sinh hoạt hàng ngày, dễ té ngã. - Giai đoạn 4: Triệu chứng trầm trọng đòi hỏi sự giúp đỡ. Người bệnh chỉ có thể tự đi được đoạn ngắn, không thể thực hiện các sinh họat hàng ngày mà cần sự trợ giúp từ người chăm sóc. 3 - Giai đoạn 5: Triệu chứng trầm trọng nhất, di chuyển trên xe lăn hoặc nằm liệt gường. Đây là giai đoạn cuối của bệnh, người bệnh không thể tự đứng hoặc đi lại, phụ thuộc hoàn toàn vào người giúp đỡ. Người bệnh ở giai đoạn này còn sinh ra ảo giác, hoang tưởng, lú lẫn, mất trí nhớ. 1.1.2. Chẩn đoán bệnh Parkinson Trước đây, PD được phát hiện dựa vào biểu hiện suy giảm chức năng vận động, ban đầu là bất đối xứng (một bên), sau đó các biểu hiện lan tỏa ra cả hai bên 11. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng PD là một rối loạn phức tạp bao gồm hàng loạt các đặc điểm liên quan đến vận động (Motor Symptom - MS) và không vận động (Non-Motor Symptom - NMS) với mức độ biểu hiện của từng đặc điểm là khác nhau giữa các bệnh nhân. Các MS chính bao gồm: run khi nghỉ, đơ cứng, vận động chậm, mất thăng bằng, rối loạn biểu cảm, rối loạn cử động mắt. Trong khi các NMS chính bao gồm: suy giảm khứu giác, rối loạn cảm giác, trầm cảm, táo bón, sa sút trí tuệ, rối loạn giấc ngủ 15. Cho đến nay, triệu chứng lâm sàng vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán PD, các bác sĩ sẽ tìm hiểu xem liệu bệnh nhân có biểu hiện các đặc điểm của bệnh hay không dựa trên việc quan sát, lấy thông tin từ người bệnh và tiến hành một số kiểm tra thần kinh. Trong những trường hợp cụ thể, các bác sĩ có thể sử dụng thêm một số chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm di truyền hay làm các xét nghiệm máu và dịch não tủy 16. Các dấu hiệu ở giai đoạn nhẹ của bệnh dễ bị nhầm tưởng do các vận động quá sức hàng ngày hoặc do một số vấn đề nào đó về cơ nên thường bị phớt lờ. Khi bệnh tiến triển đến giai đoạn nặng người bệnh mới đến bệnh viện thì phát hiện đã mắc bệnh nhiều năm. Vì vậy chỉ cần những bất thường nhỏ về cơ thể cần thực hiện các thăm khám ngay để giảm thiểu tối đa các nguy cơ và biến chứng sau này. 1.1.3. Điều trị bệnh Parkinson Nguyên nhân gây bệnh Parkinson đến nay vẫn chưa thật sự được xác định rõ ràng. Nhưng 3 yếu tố có thể kể đến là di truyền (đột biến gen mã hóa 4 β-glucocer ebrosidase), môi trường sống (thuốc trừ sâu, kim loại, lối sống) và các tương tác trong não bộ 17. Và cho đến hiện tại, căn bệnh vẫn chưa có phương pháp nào chữa khỏi được mà chỉ điều trị triệu chứng và bảo vệ thần kinh. Mục tiêu điều trị bệnh là cải thiện các rối loạn bệnh lý làm cản trở sinh hoạt hàng ngày, giữ cho bệnh nhân duy trì được hoạt động càng lâu càng tốt, hạn chế tối đa các biến chứng bệnh. Bệnh luôn tiến triển và không có cách nào có thể ngăn chặn hoặc trì hoãn tình trạng bệnh nên cần được điều trị càng sớm càng tốt 18. Điều trị không dùng thuốc: Điều trị không dùng thuốc bao gồm các phương thức điều trị như phẫu thuật cắt bỏ, vật lí trị liệu, liệu pháp vận động, liệu pháp ngôn ngữ, đào tạo nhận thức và kích thích não sâu cũng như kích thích não không xâm lấn 19. Ngoài ra tập thể dục (tập aerobic, tập đi, tập thăng bằng) cũng là biện pháp cải thiện cả các triệu chứng vận động và không vận động của bệnh nhân PD 20. Điều trị dùng thuốc: Thuốc Lovodopa (L-dopa) là thuốc điều trị triệu chứng hiệu quả nhất, được chỉ định dùng tại một số giai đoạn của bệnh ở hầu hết mọi bệnh nhân 21,22. Đây là tiền chất của dopamine, được sử dụng làm liệu pháp thay thế dopamine trong điều trị các triệu chứng vận động PD. Nó có khả năng xuyên qua hàng rào máu não, sau khi xâm nhập vào não, L-dopa được chuyển hóa bằng enzym thành dopamine thông qua phản ứng khử carboxyl. Dopamine này thay thế cho vị trí của dopamine tự nhiên bị thiếu hụt trong não 23,24 . Mặc dù L-dopa giúp làm giảm các triệu chứng, song việc sử dụng lâu dài có thể gây ra các tác dụng phụ như rối loạn vận động, hạ huyết áp, buồn nôn và nôn 25,26. 5 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Dopamine (trái) và Levodopa (phải) Ngoài ra, các chất chủ vận dopamine hoặc chất ức chế enzym, bao gồm chất ức chế catechol-O-methyl-transferase (COMT) và chất ức chế monoamine oxidase B (MAO-B), thường được sử dụng như chất bổ trợ cho L-dopa để làm giảm các biến chứng vận động. Các chất ức chế COMT thường được sử dụng, chẳng hạn như entacapone và opicapone, ức chế sự phân hủy L-dopa ở ngoại vi trong khi chất ức chế MAO-B thâm nhập vào hàng rào máu não, ức chế hoạt động MAO trung tâm trong thần kinh trung ương và do đó làm giảm sự thoái hóa dopamine 27. Tuy nhiên, những loại thuốc này chủ yếu để thay thế nồng độ dopamine trong não và chỉ giải quyết các triệu chứng vận động chứ không giải quyết các triệu chứng phi vận động 28. Do đó, cần phải phát triển các liệu pháp hiệu quả giải quyết đồng thời các triệu chứng vận động và các triệu chứng không vận động trong điều trị nội khoa PD 6. Tổng quan về A2A adenosine receptor (A2AAR) và enzym monoamine oxidase B (MAO-B) 1.2.1. A2A adenosine receptor (A2AAR) 1.2. Thụ thể adenosine A2A (A2AAR) là một loại trong các thụ thể adenosin (AR), ngoài ra còn có 3 loại thụ thể khác là thụ thể adenosine A1, A2B và A3 (tương ứng A1AR, A2BAR và A3AR) 24. Các AR được kích hoạt bởi chất nội sinh adenosine và được phân bố rộng rãi khắp các mô khác nhau của cơ thể vì vậy chúng trở thành mục tiêu thuốc tiềm năng để điều trị các tình trạng bệnh lý khác nhau, chẳng hạn như bệnh tim, ung thư, Parkinson 29. Cấu trúc của A2AAR bao gồm 7 vòng xoắn xuyên màng với mỗi vòng xoắn chứa 25-27 axit amin. Các vòng xoắn liên kết với nhau qua các vòng nội 6 bào và ngoại bào. Có 3 vòng nội bào được ký hiệu là IL1, IL2, IL3 và 3 vòng ngoại bào được ký hiệu là EL1, EL2 và EL3. Các vòng này có vai trò quan trọng trong việc kích hoạt và điều chỉnh hoạt động của A2AAR 24. Trong những năm gần đây, các chất đối kháng thụ thể adenosine đã thu hút nhiều sự chú ý trong việc phát triển các liệu pháp non-dopaminergic để điều trị PD vì các nghiên cứu chỉ ra chúng mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn 30-32 . Một nghiên cứu chỉ ra rằng có một tương tác đối kháng sinh lý giữa A2AAR và các thụ thể dopamine có trong thể vân. Do đó, một chất đối kháng A2AAR có thể bù đắp cho lượng dopamine bị suy giảm. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy rằng mức độ cao A2AAR có liên quan đến sự phát triển của chứng rối loạn vận động. Vì vậy, thuốc đối kháng A2AAR cũng có thể làm giảm các tác dụng phụ không mong muốn liên quan đến việc sử dụng L-dopa 24. Trong một nghiên cứu khác, Dalpiaz và cộng sự đã tổng hợp và đánh giá hoạt động của tiền chất liên hợp nhắm vào A2AAR. Tiền chất liên hợp được thiết kế bao gồm 3 phần: phần đầu tiên là chất đối kháng A2AAR, phần thứ hai là chất đệm là một phân tử succinate và phần cuối cùng là một phân tử dopamine (Hình 1.2). Chất đệm được kết nối với chất đối kháng A2AAR và dopamine thông qua liên kết amide - mục tiêu để thủy phân bởi các enzym có trong não và máu. Vì có hai liên kết amide dễ bị thủy phân trong tiền chất, nên có thể tạo ra hai chất chuyển hóa. Quan sát thấy rằng trong máu người, sự thủy phân diễn ra chủ yếu ở liên kết amide giữa chất đệm và chất đối kháng A2AAR. Mặt khác, trong não chuột, quá trình thủy phân diễn ra chủ yếu trên liên kết amide giữa chất đệm và phân tử dopamine A2AAR giúp giữ lại dopamin trong não. 7 24 . Như vậy, các chất đối kháng Hình 1.2. Tiền chất liên hợp và các sản phẩm thủy phân: (a) Dạng thủy phân được quan sát chủ yếu trong não chuột, (b) Dạng thủy phân được quan sát chủ yếu trong máu người Đặc tính bảo vệ thần kinh của các chất đối kháng A2AAR đã được chứng minh trong cả nghiên cứu in vitro và in vivo 33. Các kết quả đã chỉ ra sự gia tăng đáng kể các tế bào sống sót và bảo vệ chống lại stress oxy hóa dẫn đến việc tạo ra các gốc tự do. Do đó, người ta kết luận rằng hoạt động bảo vệ tế bào của các chất đối kháng A2AAR có thể hỗ trợ điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh bao gồm Parkinson 34. 1.2.2. Enzym monoamine oxidase B (MAO-B) Monoamine oxidase (MAO) là một protein phân bố trên màng ngoài của ti thể. Nó xúc tác quá trình khử oxy hóa của chất dẫn truyền thần kinh tyramine và monoamine như dopamine, phenethylamine, 5-hydroxytryptamine và norepinephrine. Có hai dạng đồng phân bao gồm MAO-A và MAO-B. MAOB chủ yếu phân bố trong tiểu cầu và tế bào thần kinh đệm, chiếm 80% tổng hoạt động MAO trong não. MAO-B chuyển hóa dopamine được giải phóng đến khe tiếp hợp và được các tế bào thần kinh đệm tiếp nhận. Số lượng tế bào thần 8 kinh đệm được chứng minh là tăng theo tuổi và trong các bệnh thoái hóa thần kinh 35. Trong não người, MAO-B phân hủy cả dopamine nội sinh và ngoại sinh thành hydrogen peroxide do đó nó liên quan tới những tổn thương trong PD. Đặc biệt, MAO-B là enzym chuyển đổi 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine (MPTP) thành chất có hoạt tính gây độc thần kinh, ion 1metyl-4-phenylpyridinium (MPP+), có thể gây ra PD thứ phát 36. Ức chế MAO-B dẫn đến tăng cường hoạt động dopaminergic ở thể vân bằng cách ức chế sự phân hủy dopamine 37. Kết quả làm tăng lượng dopamine và tăng tác dụng của L-dopa. Ức chế MAO-B cũng làm giảm sự tạo ra các gốc tự do phát sinh từ quá trình oxy hóa dopamine và ức chế sự biến đổi MPTP thành MPP+. Đối với bệnh nhân PD, thuốc ức chế MAO-B có thể bảo vệ tế bào thần kinh bằng cách ức chế các quá trình độc hại này 38. Rối loạn chức năng ti thể xảy ra trong PD đặc trưng bởi sự giảm hoạt động của phức hợp I ty thể và tăng sản xuất oxy phản ứng 39. Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng chất ức chế MAO-B có thể cải thiện chức năng của ti thể não bằng cách ức chế hoạt động của nitric oxide synthase và giảm sản xuất hydrogen peroxide 40. Ngoài ra, các chất ức chế MAO-B có thể điều chỉnh sự thay đổi tính thấm màng trong ti thể do độc tố thần kinh và stress oxy hóa gây ra, đồng thời ức chế dòng chảy canxi trong ti thể 41. α-synuclein là thành phần chính của thể Lewy. Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng các chất ức chế MAO-B có thể trì hoãn giai đoạn bắt đầu sự kết hợp α-synuclein, và điều này có thể dẫn đến giảm tốc độ tiến triển của bệnh 42. Dựa trên nhiều cơ chế dược lý ở trên, các chất ức chế MAO-B đã chứng minh được hiệu quả cao trong điều trị PD giai đoạn đầu và giai đoạn muộn 43. 1.3. Tổng quan về cây Câu đằng (Uncaria rhynchophylla) Câu đằng có tên khoa học là Uncaria rhynchophylla thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), là một loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc, còn được gọi 9 với tên “Gou-Teng” được sử dụng rộng rãi như một biện pháp can thiệp cho các bệnh thoái hóa thần kinh lâu năm 44. Ở Việt Nam Uncaria rhynchophylla mọc hoang dại nhiều ở vùng thượng du. Bộ phận dùng làm thuốc là đoạn thân hoặc cành có gai hình móc câu đã phơi hoặc sấy khô (Hình 1.3). Theo Đông y, Câu đằng có vị ngọt tính mát, quy vào kinh can và tâm bào, chủ trị các bệnh về thần kinh như đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, ù tai, sốt cao kinh giật. Chế biến cây thuốc này bằng cách lấy các dây Câu đằng bánh tẻ, chặt lấy các đoạn có móc câu theo kích thước quy định, đem phơi nắng hoặc sấy ở 50 đến 600C đến khô. Cách dùng là ngày dùng từ 12-16g dạng thuốc sắc, thời gian sắc không quá 10 phút 45. Hình 1.3. Cây Câu đằng và các bộ phận dùng làm thuốc Theo khoa học hiện đại, các alkaloid được phân lập từ Uncaria rhynchophylla được chứng minh có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về thần kinh trung ương trong đó có PD rhynchophylline, 46,47 isorhynchophylline, . Một số hoạt chất sinh học bao gồm corynoxeine, isocorynoxeine và hirsutine có tác dụng làm giảm huyết áp, giãn mạch, an thần và bảo vệ tế bào thần kinh chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ 48. Các alkaloid này ngăn chặn sự giải phóng canxi từ các kho dự trữ nội bào, ngăn chặn thiếu máu cục bộ, tổn thương hoặc tử vong do glutamate hoặc dopamine, ức chế các thụ thể NMDA và 5-HT2A 47. 1.4. Tổng quan về phương pháp in silico 10 In silico là các phương pháp trợ giúp bởi máy tính được ứng dụng vào nhiều khâu của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc, từ khâu tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Tên gọi này nhằm phân biệt với các phương pháp in vivo, in situ và in vitro. So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống các phương pháp in silico có ưu thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới vượt trội hơn, giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà không một thí nghiệm nào có khả năng làm được. Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng các mô hình toán học, nghiên cứu dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất. Hiện đây là một trong những công cụ hữu ích nhất trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc bởi độ chính xác cao, tiết kiệm chi phí, thời gian và rủi ro thấp. 1.4.1. Docking phân tử Docking phân tử ra đời vào những năm 1980, là phương pháp với sự hỗ trợ của phần mềm chuyên dụng sử dụng cấu trúc không gian 3 chiều (3D) mô phỏng sự gắn kết của các phân tử nhỏ (ligand) với phân tử mục tiêu (target) ví dụ như protein, enzym, ADN...49. Docking lấy mẫu sự tương thích của phối tử trong vị trí hoạt động của protein bằng các thuật toán; sau đó xếp hạng các sự tương thích này bằng cách cho điểm. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng liên kết của toàn hệ là thấp nhất. Từ đó dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế một protein chức năng đồng thời dự đoán tâm hoạt động và vị trí, cấu hình thuận lợi của cơ chất tham gia phản ứng khi xem xét cơ chế xúc tác của enzym 49. Quy trình docking gồm 3 bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking. Chuẩn bị cấu tử Cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu có sẵn như ZINC, Pubchem. Trong trường hợp không có sẵn, có thể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm ChemDraw, ChemSketch. Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, 11 cấu tử cần chỉnh sửa điện tích, gắn trường lực và tối ưu hóa năng lượng để chuẩn bị cho docking. Chuẩn bị protein Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank) “http://www.rcsb.org”. Có thể tự xây dựng cấu trúc 3D của protein theo phương pháp mô hình hóa tương đồng (Homology modeling) nếu cấu trúc protein không có sẵn. Tiếp theo, chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking bằng các phần mềm chuyên dụng: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và tạo file pdbqt. Mô phỏng docking Trước khi tiến hành mô phỏng docking, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán. Kích thước của vùng tìm kiếm cần được lựa chọn sao cho phù hợp, không nên quá lớn gây tốn kém thời gian, không nên quá nhỏ vì chỉ tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa. Thông thường, vị trí vùng tìm kiếm được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Khi thực hiện docking, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất. Việc phân tích các tương tác của các cấu dạng thu được thực hiện trên các phần mềm chuyên dụng như MOE, Pymol, Discovery studio... 1.4.2. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc Năm 1997, Christopher Lipinski và các cộng sự đã đưa ra bộ quy tắc số 5 (Rules of 5- RO5) về các hợp chất giống thuốc, theo đó các loại thuốc dùng đường uống thường có đặc tính hóa lý và cấu trúc trong một phạm vi giá trị nhất định 50. Nếu một hợp chất không vượt qua quy tắc RO5, nó sẽ có nguy cơ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống. Tuy vậy, một chất đáp ứng RO5 không đảm bảo nó sẽ trở thành thuốc, vì RO5 không đề cập đến các đặc điểm cấu trúc hóa học cụ thể được tìm thấy trong thuốc và hợp chất không phải thuốc. Một dược chất đường uống không vi phạm quá 2 trong 5 tiêu chí sau: - Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton. - Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH): HBD ≤ 5. 12