Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Khóa luận nghiên cứu nhân giống cây chuối đỏ dacca (musa acuminata) bằng kỹ thuậ...

Tài liệu Khóa luận nghiên cứu nhân giống cây chuối đỏ dacca (musa acuminata) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

.PDF
52
219
116

Mô tả:

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ NGỌC THƯƠNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA (MUSA ACUMINATA) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn Đà Nẵng – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Thương LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Vũ Đức Hoàng, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Sinh - Môi trường đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của mình. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất. Đà Nẵng, tháng 5 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Thương MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề: ..............................................................................................................1 2. Mục tiêu...................................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...........................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................ 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 2 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT .......3 1.1.1. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro ở thực vật ...................................... 3 1.1.2. Cơ sở khoa học ............................................................................................. 3 1.1.3. Các bước nhân giống in vitro ....................................................................... 4 1.1.4. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ............................................ 7 1.2. NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC LOÀI CHUỐI BẰNG KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO ........................................................................................ 12 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 12 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................................... 14 3.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA .................................................17 3.1.1. Đặc điểm sinh học....................................................................................... 17 3.1.2. Giá trị sử dụng ............................................................................................ 17 3.1.3. Các nghiên cứu trên đối tượng nghiên cứu ................................................. 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................19 2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN .........................................................................19 2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu vật và tái sinh chồi ...................................... 20 2.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro .................................................. 20 2.3.3. Phương pháp tạo rễ in vitro – tạo cây hoàn chỉnh ................................... 21 2.3.4. Phương pháp xử lí thống kê ...................................................................... 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 22 3.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU VẬT VÀ TÁI SINH CHỒI IN VITRO .....................................................................................................................22 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA .....................................................................24 3.2.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca ......................................................................................................................... 25 3.2.2. Ảnh hưởng của BA, IBA phối hợp đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca ................................................................................................... 27 3.2.3. Ảnh hưởng của BA, NAA phối hợp đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca ................................................................................................... 29 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐHST IBA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH RỄ IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA ...............................................................32 3.4. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 37 * Kết luận .................................................................................................................37 * Đề nghị ..................................................................................................................37 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 38 *Tiếng Việt ................................................................................................................ 38 *Tiếng Anh................................................................................................................ 39 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid AC : Active carbon (than hoạt tính) BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine B5 : Gamborg (1968) Cs : Cộng sự CW : Coconut water (nước dừa) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IAA : Indole 3-acetic acid IBA : Indole 3-butyric acid KIN : Kinetin L : Lít MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid SH : Schenk và Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng 3.1. 3.2. cây chuối đỏ Dacca 1 tháng tuổi sau 4 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng cây chuối đỏ Dacca 3 tháng tuổi sau 8 tuần nuôi cấy 22 23 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi in vitro 3.3. cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy 25 Ảnh cấy hưởng của BA và IBA kết hợp đến khả năng nhân 3.4. 3.5. 3.6. chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy in vitro cây chuối mốc sau 4 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng của BA và NAA kết hợp đến khả năng in vitro cây chuối mốc sau 4 tuần nuôi cấy nhân chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh rễ in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 20 ngày nuôi cấy sóc cây chuối mốc sau 2 tuần nuôi cấy 28 29 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình 2.1. Cây chuối đỏ Dacca ngoài tự nhiên 2.2. Sơ đồ thí nghiệm Trang 20 23 Chồi chuối đỏ Dacca 1 tháng tuổi sau hiệu quả khử 3.1. trùng bằng cồn 70o sau 4 tuần nuôi cấy 22 3.2. Chồi chuối đỏ Dacca 3 tháng tuổi sau hiệu quả khử in vitro cây chuối mốc sau 4 tuần nuôi cấy trùng bằng cồn 70o sau 8 tuần nuôi cấy 23 3.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy cấy 26 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh 3.4. chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy 29 cấy 3.5. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy 30 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh rễ in 3.6. vitro chuối đỏ Dacca 33 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay chuối là cây ăn quả được trồng phổ biến nhất, hay gặp trong các vườn gia đình. Chuối cung cấp cho hàng triệu người khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt cùng với các thực phẩm chủ yếu và được cho là một loại trái cây xuất khẩu rộng lớn trên thế giới. Hiện nay chuối được trồng trong 150 quốc gia trên thế giới trên khu vực 4.84 triệu ha, cung cấp 95.6 triệu tấn [50]. Chuối chiếm xấp xỉ 44% sản lượng trái cây tươi và là cây ăn trái quan trọng thứ hai trên thế giới, ở Châu Phi chiếm khoảng 35% sản lượng trên thế giới [53]. Ở nước ta, tại khu vực miền Nam Việt Nam, nơi có điều kiện trồng chuối thuận lợi, sản lượng chuối có thể đạt 1 triệu tấn mỗi năm, diện tích trên 5 vạn ha trong số 8 vạn ha của cả nước [14]. Mặt khác, các bộ phận của chuối đều có thể sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau mang lại những lợi ích thiết thực cho con người, đặc biệt có thể làm thuốc chữa các bệnh khác nhau như nõn chuối có tác dụng cầm máu nhanh [37]. Quả chuối có giá trị dinh dưỡng khá cao và được chế biến ra nhiều sản phẩm khác nhau như chuối sấy, mứt chuối, bánh chuối, kem chuối… đa dạng phục vụ cho giá trị dinh dưỡng cũng như tín ngưỡng của người Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Cây chuối đỏ Dacca có tên khoa học là Musa acuminata ‘Red Dacca’ thuộc chi Musa được tìm thấy ở Úc và Trung, Nam Mỹ [53], [39] (đề tài nghiên cứu về giống chuối đỏ Dacca nguồn gốc từ Úc). Chúng nhỏ hơn và có vỏ dày so với các loại thông thường, thịt chuối có màu trắng kem cho đến màu hồng với hương vị chuối thường đặc trưng hòa lẫn vị mâm xôi. Đây là món ăn yêu thích của vùng Trung Mỹ với hơn 6,4 tỉ đô la tiêu thụ mỗi năm. Chuối đỏ cũng rất tốt cho sức khỏe với hàm lượng 100 calo trên 10gr, đáp ứng 16% chất xơ (4gr), giàu Kali, vitamin B6 và vitamin C. Ngoài ra chuối đỏ còn có thể giảm nguy cơ mắc bệnh tim, tiểu đường type 2 [51]. Trong tự nhiên, chuối nói chung được nhân giống theo phương pháp nhân giống sinh dưỡng, nghĩa là bằng cách dùng cây chuối con vốn phát triển từ các chồi bên có nguồn gốc từ thân hành với một hay nhiều chồi được sử dụng [32]. Cây chuối được nhân giống theo phương pháp nhân giống sinh dưỡng có mức nhân giống thấp, thường sinh trưởng kém, phát triển chậm, cây không đồng đều, 2 lâu cho thu hoạch, thu hoạch không tập trung. Phương pháp này thường làm cây con mắc bệnh virus rất nguy hiểm dẫn đến tình trạng thoái hóa giống cao [54]. Vì vậy, vấn đề làm sao để tạo ra giống chuối đỏ sạch bệnh với năng suất và chất lượng tốt đang là vấn đề cấp thiết được các nhà khoa học đặt ra. Hiện nay kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống mới, hiện đại tạo ra số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh mà không có phương pháp nào có thể thay thế được. Tính đồng nhất của giống chuối nuôi cấy mô giúp chúng ta có thể điều khiển được thời gian thu hoạch, tăng năng suất và chất lượng trái [33]. Tại học viện Nông nghiệp Hà Nội đã nhập khẩu giống chuối đỏ Dacca từ Úc và tiến hành nuôi cấy mô cây giống thành công, tuy nhiên chưa có một quy trình nhân giống cụ thể được công bố. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây chuối đỏ Dacca (Musa acuminata) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”. 2. Mục tiêu Xây dựng quy trình nhân giống cây chuối đỏ Dacca bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro với hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp những dẫn liệu khoa học về nhân giống vô tính cây chuối đỏ Dacca bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nhân giống cây chuối đỏ Dacca. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu là cơ sở để chủ động sản xuất nhanh, liên tục với chất lượng cây giống tốt, giá thành rẻ, đáp ứng nhu cầu cây giống cũng như sản xuất thương phẩm chuối đỏ Dacca trên quy mô lớn. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT 1.1.1. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro ở thực vật Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy khử trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học [7]. Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện khử trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác [7]. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện khử trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture) [19]. Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy khử trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt) [19]. 1.1.2. Cơ sở khoa học 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào Haberlant (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tang để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [11]. Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh [11]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) được thực hiện dựa trên tính toàn năng của tế 4 bào, được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào riêng biệt, trong môi trường thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh, đặc trưng cho loài và có thể phát triển bình thường. Do trong nhân tế bào có chứa bộ DNA hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống hoàn chỉnh. 1.1.2.2. Tính phân hóa và phân phân hóa của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào [11]. Trong đó: Tính phân hóa của tế bào là sự biển đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành các mô riêng biệt [11]. Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các mô có chức năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ [11]. Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây [11]. Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân, rễ, lá… thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của cơ quan sinh dưỡng [53]. Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (cơ chế điều hòa hoạt động của gen) [53]. Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Do thông tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan hormone quy định. Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời và trong điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào [11]. 1.1.3. Các bước nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 5 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro [19]. Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 510 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962); Chất hữu cơ: đường sarcaroza; Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit; Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) [19]. Bước 3: nhân nhanh Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ 6 ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… [19]. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh [19]. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi… - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp [19]. 1.1.4. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 1.1.4.1. Ưu điểm Theo E.F. Gerge (1993) cho biết ưu điểm của nhân giống in vitro [9]. - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 -10 mm. 7 - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sạch bệnh - Sử dụng vật liệu sạch virus có khả năng nhân được các giống sạch bệnh - Có khả năng điều chỉnh các tác nhân ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều hòa sinh trưởng … theo ý muốn. - Hệ số nhân giống khá cao, có khả năng sản xuất lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. - Có thể tiến hành quanh năm, không chịu sự chi phối của các nhân tố môi trường. - Có thể bảo quản cây giống in vitro trong thời gian dài nếu chưa sử dụng [7]. 1.1.4.2. Nhược điểm Vì cây giống được cung cấp nguồn dinh dưỡng nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các chất hữu cơ kém. Cây giống được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa, nên khi trồng dễ mất cân bằng nước, gây ra hiện tượng héo rũ. Vì vậy, cây giống in vitro đưa ra trồng tự nhiên cần qua giai đoạn thích nghi để quen dần với điều kiện tự nhiên [16]. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 1.1.5.1. Môi trường nuôi cấy Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro lấy từ môi trường nuôi cấy. Thành phần cấu tạo nên môi trường nuôi cấy được chia thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất điều hoà sinh trưởng và các chất khác như agar, agarose .Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng. Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều chỉnh của nguồn Cacbon, nồng độ photphat, nguồn cung cấp nitơ và các chất điều hoà sinh trưởng [41]. + Nguồn Cacbon: các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Thông thường, saccharose (2-5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật. 8 Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong quá trình nuôi cấy. Các nguồn cacbon có thể sử dụng là saccharose, glucose, fructose và sorbitol [41]. + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và NO3- (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất. + Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho(P), kali (K), canxi (Ca), magiê (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L [19]. Các môi trường khoáng khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5. Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng. + Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây [15]. + Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin inositol, B1 (thiamin) và B6 (pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1 mg/L Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin 9 B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng đối với nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng sự có mặt của nó trong môi trường MS [15]. + Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxine, các gluxid của cytokinin [15]. + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy [15]. Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng ở thực vật. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid. Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy. 1.1.5.2. Điều kiện nuôi cấy Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ. + Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. 10 Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux. + Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy. Nhiệt độ cho phép tế bào thực vật có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro là từ 23°C đến 29°C (Endress 1994; Fowler 1988). + Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô [7]. 1.1.5.3. Điều kiện vô trùng Bất kì hình thức nuôi cấy in vitro nào cũng đều cần có điều kiện vô trùng. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm nấm hoặc vi khuẩn, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp vào mẫu và các thao tác đúng quy cách, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng, bàn nuôi và dụng cụ nuôi cấy phải vô trùng [7]. 1.1.5.4. Các chất điều hòa sinh trưởng Ở thực vật, các chất điều hòa sinh trưởng còn được gọi là các phytohormon, có thể chia các chất phytohormon ra thành 5 nhóm: auxin, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid. Các chất ĐHST được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp, nồng độ sử dụng cao hay thấp là yếu tố quyết định đến sự thành công của nghiên cứu. Auxin và cytokinin là 2 nhóm chính thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Nhóm auxin gồm các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D. Trong đó, IAA ít được sử dụng do kém bền vững với nhiệt và ánh sáng, IBA, NAA, 2,4-D thường được sử dụng ở nồng độ thấp 0,1 – 2 mg/L, còn IAA thường được sử dụng ở nồng độ khá cao từ 1 - 30 mg/L [13]. Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, hình thành rễ, hình thành mô sẹo, phân chia rễ phụ… [15]. Cytokinin được bổ sung để kích thích sự phân chia tế bào, quyết định sự phân hóa chồi bất định từ mô sẹo vào cơ quan, làm tăng số chồi. Các chất cytokinin thường được sử dụng là BA, KIN, zeatin, … Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, đối với mỗi loài thực vật, mỗi giai đoạn nuôi cấy các chất ĐHST và nồng độ được sử dụng không giống nhau.Trong nghiên cứu của Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) nghiên cứu nhân giống cây sa 11 nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BA hoặc 1,0 mg/L KIN cho hiệu quả tái sinh chồi tốt nhất, nhưng nồng độ 1,5 mg/L BA có kết hợp với 0,25 mg/L NAA lại thích hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi loài cây này [1]. + Auxine: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA, IAA, NAA, 2,4-D trong nuôi cấy mô thực vật auxine thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [15]. Lấy ví dụ cụ thể, 2,4-D được bổ sung với nồng độ cao nhằm thúc đẩy sự tăng sinh của callus [41]. + Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất thường sử dụng là: KIN, BAP, Zip, Zeatin… Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 106 M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [15]. + Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất là GA3. GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973). Ngoài ra, nó còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây. + Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ [6]. ABA được sử dụng để gây phôi soma trong hệ thống nuôi cấy mô thực vật và trong nghiên cứu giống cây tổng hợp. Chống thoát hơi nước, tăng thời gian thích ứng với điều kiện khí hậu của cây nuôi cấy mô và làm giảm sự mất nước của lá [44]. Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một số trường hợp, ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này [15]. 12 1.2. NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC LOÀI CHUỐI BẰNG KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới Chuối là loại cây ăn quả rất gần gũi và có giá trị, đã góp một phần đáng kể phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu. Vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới. Rahman và cs (2004) nghiên cứu trên ảnh hưởng của chất ĐHST BAP và NAA trên giống chuối BARI-I ở nồng độ BA (0,1,2,3,4,5 và 6 mg/L) riêng rẽ và kết hợp BA (0, 4 và 5 mg/L), NAA (0; 0,5; 1; 1,5 và 2 mg/L). Số lượng chồi tái tạo đạt cao nhất (4,52 chồi) với chiều cao thân cao nhất đạt 3,62 cm ở môi trường MS cơ bản bổ sung 4 mg/L BAP + 1,5 mg/L NAA [43]. Năm 2006, Akbar và cs nghiên cứu trên Musa sapientum L., sự hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy khi chúng được tách riêng lẻ và nuôi cấy ở môi trường MS bán lỏng, bổ sung 1,0 mg/L IBA, nhưng tỷ lệ rễ phát sinh và phát triển ở môi trường lỏng cao hơn so với môi trường thạch bổ sung thạch agar [23]. Theo kết quả nghiên cứu tái sinh cây chuối mốc của Ghanem và cs (2008) ghi nhận khả năng tạo rễ tốt nhất trên môi trường bổ sung 0,5 mg/L NAA (11,6 rễ/chồi) sau 5 tuần nuôi cấy [42]. Buah và cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng khác nhau của nồng độ các cytokinin trong nhân chồi in vitro giống Plantain (Musa sp.) cho thấy môi trường MS cơ bản bổ sung 4,5 mg/L BAP cho số lượng chồi cao nhất sau 8 tuần nuôi cấy. BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất đối cả các giống nghiên cứu so với sử dụng Kinetin và 2-ip [25]. Năm 2010, Siamak và cs nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin bao gồm BAP, kinetin, TDZ đến sự phát triển chồi in vitro của các giống chuối khác nhau (Musa spp.) nhóm AAA và AAB cho thấy BAP ở mức 22,2 µM là tối ưu cho sự phát triển cũng như kéo dài chồi của các giống chuối [49]. Năm 2010, Olivia Saha Roy và cs nhân giống và sản xuất giống chuối Musa paradisiaca ‘Malbhog’ nhóm AAB cho thấy môi trường MS cơ bản bổ sung 1 mg/L IBA cho số rễ in vitro cao nhất (6 rễ/ chồi) sau 2 tuần nuôi cấy, huấn luyện trong điều kiện nhà kính và trồng thực nghiệm, kết quả theo dõi cho thấy khả năng sống sót đạt 95% sau 5 tháng [46].
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan