Tài liệu Khóa luận nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n hexane và ethyl acetate hoa đu đủ đực (carica papaya l.) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG Chuyên ngành : Hóa hữu cơ LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS. ĐỖ THỊ THÚY VÂN Đà Nẵng - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực. Tác giả luận văn Mai Thị Hoàng Yến MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ .............................................................. 4 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC ............................................................................................. 5 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC .............................................................................................. 5 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ .................................................................................................................. 5 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ............................................................................................................... 6 1.5.1. Phương pháp MTT .......................................................................... 6 1.5.2. Phương pháp SRB ........................................................................... 7 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 8 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................. 8 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................... 8 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 8 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 8 2.2.1. Xác định chỉ số vật lí....................................................................... 8 2.2.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật ................................................... 10 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ........... 11 2.3. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC...... 12 2.3.1. Alcaloid .............................................................................................. 12 2.3.2. Flavonoid ............................................................................................ 12 2.3.3. Coumarin ............................................................................................ 12 2.3.4. Saponin ............................................................................................... 13 2.3.5. Đường khử.......................................................................................... 13 2.3.6. Polyphenol .......................................................................................... 13 2.3.7. Steroid ................................................................................................ 13 2.3.8. Acid hữu cơ ........................................................................................ 14 2.3.9. Chất béo.............................................................................................. 14 2.3.10. Carotene ........................................................................................... 14 2.3.11. Polysaccharide.................................................................................. 14 2.3.12. Iridoid ............................................................................................... 14 2.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NHEXANE VÀ ETHYL ACETATE ................................................................ 15 2.5.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư ........................................................................................... 15 2.5.2. Các dòng tế bào .................................................................................. 15 2.5.4. Phương pháp thử độc tế bào ............................................................... 15 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 17 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC . 17 3.1.1. Độ ẩm ................................................................................................. 17 3.1.2. Hàm lượng tro .................................................................................... 17 3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại ............................................................. 18 3.2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC .................................. 19 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm... 19 3.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Soxhlet ....... 23 3.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm ....... 25 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC30 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS ............................................................................................................ 32 3.4.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết n-hexane hoa Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS ................................................................. 32 3.4.2. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS ........................................................... 35 3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC ........................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 41 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang 3.1. Độ ẩm hoa Đu đủ đực 17 3.2. Hàm lượng tro hoa Đu đủ đực 17 3.3 Hàm lượng một số kim loại trong hoa Đu đủ đực 18 bảng 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung môi n-hexane Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi n-hexane Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát thời gian chiết Soxhlet tối ưu dung môi bằng n-hexane Kết quả khảo sát thời gian chiết Soxhlet tối ưu bằng dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm bằng dung môi nhexane Kết quả khảo sát nhiệt độ siêu âm tối ưu bằng dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát thời gian siêu âm tối ưu bằng dung môi n-hexane 19 20 21 22 23 24 26 27 28 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm tối ưu bằng dung môi ethyl acetate Định tính các lớp chất trong hoa Đu đủ đực Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane trong hoa Đu đủ đực Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate trong hoa Đu đủ đực Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate 29 31 32 36 39 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình Trang 1.1. Hình ảnh Đu đủ 4 2.1. Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 8 hình 3.1. 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo thời gian chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời gian chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết n-hexane theo thời gian chiết Soxhlet Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo thời gian chiết Soxhlet Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết n-hexane theo nhiệt độ chiết siêu âm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo nhiệt độ chiết siêu âm Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo thời gian chiết siêu âm Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo thời gian chiết siêu âm Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexane hoa Đu đủ đực 19 21 22 23 24 25 26 27 28 30 32 Số hiệu hình 3.12 Tên hình Phổ MS của – Sitosterol Trang 35 3.13 Phổ MS của 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) 35 3.14. Phổ MS của n-Hexadecanoic acid 35 3.15. 3.16. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực Phổ MS của – Sitosterol 36 38 3.17. Phổ MS của n-Hexadecanoic acid 38 3.18. Phổ MS của 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) 39 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Đỗ Thị Thúy Vân người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình làm khoá luận. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Hóa Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng đã giảng dạy cho em kiến thức về các môn đại cương cũng như các môn chuyên ngành, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Một lần nữa xin gửi đến thầy cô, bạn bè cùng các cô chú, anh chị tại các doanh nghiệp lời cảm ơn chân thành và tốt đẹp nhất! Đà Nẵng, 15 tháng 4 năm 2018 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta. Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C. Sản lượng Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [9]. Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở khắp cả nước, trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa. Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9]. Cây Đu đủ = là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác nhau. Quả Đu đủ là nguồn cung cấp nhiều loại enzyme khác nhau. Papain, pepsin có trong quả xanh giúp tiêu hóa protein trong thức ăn ở môi trường acid, kiềm và trung tính. Lipase, một enzyme hydrolase liên kết chặt chẽ với phần không tan trong nước của quả xanh, là một chất xúc tác sinh học cố định. Folic acid trong quả Đu đủ là chất chuyển đổi homocysteine thành các acid amin như cysteine hoặc methionine. Nếu không chuyển đổi, homocysteine có thể trực tiếp làm hỏng các thành mạch máu, dẫn đến nguy cơ đau tim hoặc đột quỵ. Quả Đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột hoạt động bình thường [20]. Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [12, 13]. Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [16]. Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 1 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân dương, các loại nấm [1, 10]. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [12, 19]. Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư. Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7]. Người dân nước Úc đã dùng lá Đu đủ chữa trị bệnh ung thư [14]. Ngoài ra, dịch chiết từ lá Đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u [15]. Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng sử dụng hoa cây Đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng,…; các bệnh về hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đạo,…; chữa sỏi thận; tác dụng kích thích tiêu hóa. Ngoài ra, hoa Đu đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…[8, 10]. Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ phận khác như rễ, thân và hoa của chúng. Việc sử dụng hoa Đu đủ đực hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian, nhiều người còn e ngại vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n-hexane và ethyl acetate hoa Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến các phương pháp chiết (ngâm, soxhlet, siêu âm), khảo sát thành phần hóa học vàn hoạt tính sinh học của hoa Đu đủ đực góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 2 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân - Hoa Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng. - Chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực bằng các dung môi khác nhau. Từ các dịch chiết này, tiến hành khảo sát thành phần các hợp chất hoá học. - Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của một số phân đoạn dịch chiết từ hoa Đu đủ đực. 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới. - Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của hoa Đu đủ đực. 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm; - Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm; - Các phương pháp định danh thành phần hóa học; - Các phương pháp nghiên cứu xác định công thức cấu tạo hợp chất hóa học: Sắc ký khí-khối phổ (GC-MS), - Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học hoạt tính gây độc tế bào; - Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học. 5. Bố cục của luận văn Luận văn gồm 44 trang, 17 bảng, 18 hình ảnh, 20 tài liệu tham khảo. Với: Phần mở đầu (3 trang) Chương 1 – Tổng quan (4 trang) Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (9 trang) Chương 3 – Kết quả và thảo luận (24 trang) Kết luận (1 trang) Tài liệu tham khảo (3 trang) SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 3 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [17]. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi và một loài [1]. Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn được gọi Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1). Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [6]. A: hoa cái D: trái của cây cái B: hoa lưỡng tính E: trái lưỡng tính C: hoa đực F: cây đực Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 4 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [5]. Năm 2016, Trần Thanh Hải đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetatee trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn tỉnh Quảng Nam [4]. Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và βsitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [12]. 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố thành phần hóa học của hoa Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0,07%), alcaloid (0,05%), tannin (0,002%) và flavonoid (2,8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [11]. Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố kết quả trong hoa Đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoid, steroid, flavonoid, tannin, glycoside và saponin [14]. Tóm lại đã phân lập được Kaempferol, Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid (Glucosinolate), β-sitosterol glucoside (Sterol) trong hoa Đu đủ đực. Như vậy, thành phần hóa học hoa Đu đủ đực đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu còn khá ít. 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ  Tác dụng chống ung thư SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 5 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa Đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư vú [14]. Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu hái ở Quảng Nam-Đà Nẵng. Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết chloroform có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B và ung thư vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/mL.  Tác dụng chống oxy hóa Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,...  Công dụng trong dân gian Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ em. Ngoài ra hoa Đu đủ đực được dùng để chữa sỏi thận hiệu quả [6,11]. 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng sự [18]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB. 1.5.1. Phương pháp MTT Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [9]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 6 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào. 1.5.2. Phương pháp SRB Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường acid nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng. SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 7 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu hoa của cây Đu đủ đực được thu hái tại. Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017. Hoa Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu. Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 2,0 m có nhiều lá và hoa. Hoa Đu đủ đực nở theo chùm, màu trắng, hoa nở nhiều, còn nhiều nụ, không bị sâu. Cuống hoa hình trụ, màu xanh lục, thân xốp. Bột hoa Đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm. Hình 2.1. Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Dung môi chiết n-hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, ethanol và nước cất. Một số hóa chất khác cũng được sử dụng. Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS. Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, tủ sấy, tủ nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc,… 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định chỉ số vật lí  Độ ẩm SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 8 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân Tiến hành: Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong tủ sấy đến khối lương không đổi m0. Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ. Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu hoa Đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 1000C. Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2. Cách tính độ ẩm: Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu. Độ ẩm được tính theo công thức sau Trong đó: m0: Khối lượng cốc sứ (g) m1: Mẫu bột hoa Đu đủ đực (g) m2: Cốc sứ chứa bột hoa đu đủ sau khi sấy (g) W: Độ ẩm của mẫu (%) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.  Hàm lượng tro Tro toàn phần: Là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định. Tiến hành: Cân 5 mẫu hoa Đu đủ đực sấy khô ở trên với khối lượng m1 đem than hóa sơ bộ trên bếp điện rồi cho vào lò nung ở 400-4500C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng. Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu. SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 9 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân Sau đó cho vào nung 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi. Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy, là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung. Cách tính kết quả: Hàm lượng tro được tính bằng công thức: Trong đó: m0: Khối lượng cốc sứ m1: Mẫu hoa Đu đủ đực sau khi sấy khô (g) m2: Khối lượng của cốc sứ và hoa Đu đủ đực sau khi tro hóa (g) Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên.  Xác định hàm lượng kim loại Mẫu hoa đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL. Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. 2.2.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật Mẫu bột hoa Đu đủ đực thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng. Trong nghiên cứu này tiến hành 3 phương pháp chiết: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm. Chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu bột hoa Đu đủ đực trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả. Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate. Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, với thể tích dung môi n-hexane/ethyl acetate thay đổi từ 100mL đến 300mL, ngâm trong thời gian 1 ngày. Tiến hành chiết 5 mẫu với tỉ lệ Rắn/Lỏng khác nhau, lần lượt là 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân. SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 10 Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate. Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với tỉ lệ R/L = 1/20 gồm khoảng 10g bột hoa Đu đủ đực và 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate. Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5 ngày. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân. Chiết Soxhlet: Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng bộ Soxhlet. Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng10g, 200mL dung môi n-hexane ở nhiệt độ 78oC (dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ 87,1oC). Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 giờ. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân. Chiết siêu âm: Khảo sát nhiệt độ: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm. Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate trong 30’. Tiến hành chiết 5 mẫu với nhiệt độ khác nhau, lần lượt là 30, 40, 50, 60 và 700C. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân. Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm. Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate ở 500C. Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 30, 60, 90, 120 và 150 phút. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân. 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS. SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 11