Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Khóa luận nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh h...

Tài liệu Khóa luận nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform lá đu đủ đực (carica papaya l.) thu hái tại quảng nam đà nẵng

.PDF
51
148
57

Mô tả:

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC Sinh viên thực hiện : Đặng Hồ Khánh Hòa Lớp : 14CHD Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường Đà Nẵng-Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập tại Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Đà Nẵng, bằng sự nổ lực của bản thân và sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, bạn bè và người thân, em đã hoàn thành khóa luận này. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến thầy giáo GS.TS.Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo để khóa luận được hoàn thành đúng tiến độ chương trình. Em xin chân thành cảm ơn cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Hóa - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng và Nhà trường đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Do những điều kiện chủ quan và khách quan chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong đón nhận những lời góp ý chân tình, thiết thực từ thầy cô, bạn bè để khóa luận đạt đến sự hoàn thiện nhất. Trân trọng cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Sinh viên thực hiện Đặng Hồ Khánh Hòa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2 4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 2 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết ........................................................... 2 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm ...................................................... 3 5. Bố cục của luận văn .................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ .................................................................... 4 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC....................................................................................................... 5 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC ..................................................................................................................... 6 1.4.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 8 1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 11 1.5.1. Phương pháp MTT .............................................................................. 11 1.5.2. Phương pháp SRB ............................................................................... 12 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ....................... 13 2.1.1. Nguyên liệu ......................................................................................... 13 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................................... 13 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 14 2.2.1. Xác định các thông số vật lý ................................................................ 14 2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực ................................................................................................. 15 2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực ..................................... 16 2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết ................................................................ 22 2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết chloroform ................................ 23 2.2.6. Định danh một số hợp chất có trong cao chiết chloroform ................... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 26 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG VẬT LÝ ......................... 26 3.1.1. Độ ẩm ................................................................................................. 26 3.1.2. Hàm lượng tro ..................................................................................... 26 3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại .............................................................. 27 3.2.KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU DỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI CHLOROFORM ...... 28 3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm ............................................................................................................. 28 3.2.2. Kết quả khảo thời gian chiết soxhlet trong dung môi chloroform ......... 31 3.2.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm trong dung môi chloroform .................................................................................... 32 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ...... 35 3.4. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT .......................................................... 37 3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CHLOROFORM TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC .................................................................................................. 37 3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS........................... 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 41 1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 41 2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 42 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BuOH: Buthanol CHCl3: Chloroform CH2Cl2: Diclomethane DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAc: Ethylacetate GC-MS: Gas chromatography-Mass spectrometry MeOH: Methanol SRB: sulforhodamin B DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng bảng Trang 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của lá Đu đủ đực 26 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong lá Đu đủ đực 26 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ đực Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi chloroform Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung môi chloroform Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi chloroform Kết quả khảo sát thời gian siêu âm tối ưu bằng dung môi chloroform Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm bằng dung môi chloroform 27 28 30 31 33 34 3.9 Định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực 36 3.10 Khối lượng cao chiết từng phân đoạn 37 3.11 Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết chloroform 38 3.12 Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực 39 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình hình Trang 1.1. Hình ảnh Đu đủ 5 1.2. Công thức cấu tạo các hợp chất trong cây Đu đủ 7 2.1. Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 13 2.2. Sơ đồ điều chế các cao chiết 22 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời gian chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo tỉ lệ Rắn/Lỏng Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời gian chiết Soxhlet Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời gian chiết siêu âm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo nhiệt độ chiết siêu âm Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực 29 30 32 33 35 39 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Thế kỷ thứ XXI là thế kỷ phát triển về mọi mặt của toàn nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao. Bên cạnh đó, con người cũng đang đứng trước nguy cơ mắc nhiều bệnh tật đặc biệt là các căn bệnh hiểm nghèo như ung thư. Con người đã và đang từng bước tìm ra các loại thuốc và các phương pháp có khả năng kìm hãm sự phát triển của chúng. Tuy nhiên, một trong những giải pháp hiện nay là dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta. Ở Việt Nam với khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của thảm thực vật, vì vậy nguồn dược liệu ở nước ta khá phong phú. Một trong số đó là cây Đu đủ. Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở nước ta, cây Đu đủ được trồng rất nhiều với diện tích trồng của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9]. Cây Đu đủ được biết đến như một vị thuốc hữu hiệu được ông cha ta sử dụng để chữa bệnh, bồi bổ và chăm lo cho sức khỏe. Trong quả Đu đủ xanh có các enzyme như papain, pepsin là một trợ giúp tuyệt vời cho quá trình tiêu hóa. Quả Đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột hoạt động bình thường [19]. Lá Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm [1,20]. Hợp chất phenol trong lá Đu đủ đã được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa mạnh [21]. Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ưng thư, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế phát triển khối u gây tế bào ung thư [6]. Chính bởi nguồn nguyên liệu có sẵn dồi dào và phong phú cùng với công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ. Thế nhưng những công trình nghiên cứu về lá đu đủ đực, hoa, rễ, thân vẫn còn rất hạn chế. 1 Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng NamĐà Nẵng”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.), góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Lá Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng. - Xác định chỉ số hóa lý. - Chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực trong dung môi chloroform bằng 3 phương pháp: ngâm dầm, soxhlet, siêu âm để lựa chọn phương pháp chiết tối ưu. Từ dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, tiến hành định danh các hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm. - Tiến hành chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi: methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết chloroform trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. - Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về lá cây Đu đủ. 2 - Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của các bộ phận của cây Đu đủ. 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm; - Phương pháp trọng lượng; - Các phương pháp chiết mẫu gồm: ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm; - Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC - MS) - Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào; - Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học. 5. BỐ CỤC CỦA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Khóa luận tốt nghiệp gồm 44 trang; 12 bảng; 10 hình ảnh và 23 tài liệu tham khảo. Với: Phần mở đầu (3 trang) Chương 1 – Tổng quan tài liệu (9 trang) Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (13 trang) Chương 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang) Kết luận và kiến nghị (1 trang) Tài liệu tham khảo (3 trang) 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi và một loài [1]. Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái (Hình 1.1). Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [5]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm: - Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp. - Giống Đu đủ Mehico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX. Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm, phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh. - Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao. Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam. - Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày. 4 - Giống Đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá. - Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9]. A: hoa cái D: trái của cây cái B: hoa lưỡng tính E: trái lưỡng tính C: hoa đực F: cây đực Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, 5 cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [2]. Năm 2014, Hồ Thị Hà tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được phân lập từ lá Đu đủ [3]. Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [4]. Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và β-sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [7]. 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [22]. Năm 2008, Krishna K.L. và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học các bộ phận cây Đu đủ, phát hiện trong lá Đu đủ có những chất như sau: Alcaloid carpaine, pseudocarpain và dehydrocarpaine I và II, choline, carposide, vitamin C, E [15]. Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GCMS bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và hexadecanoic acid, methyl ester (18,25%) [13]. 6 Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong lá Đu đủ: β-sitosterol Carpaine Dehydrocarpaine I Dehydrocarpaine II Kaempferol Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid Hình 1.2. Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ 7 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học các bộ phận của cây Đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá phong phú.  Tác dụng trị giun sán Năm 1994, Satrija F và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa Đu đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật: Tác dụng trên Asaris sum (sán lợn) ghi nhận liều 4g và 8g nhựa/kg có khả năng diệt được 80% và 100% sán sau 7 ngày trị liệu [14].  Tác dụng hạ huyết áp Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ trái Đu đủ Các kết quả này cho rằng nước ép từ quả Đu đủ gây hạ huyết áp do hoạt tính trên các thụ thể α-adrenoceptive [12].  Tác dụng kháng sinh, kháng nấm Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ Đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella. Rễ Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/mL, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/mL (với IC50 > 128 µg/ml) [3]. Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực. 8  Tác dụng trị u bướu, ung thư Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [8]. Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu hái ở Quảng Nam-Đà Nẵng. Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết chloroform có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B và ung thư vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/Ml [4]. Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan Ariyani đã chứng minh trong lá Đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs có khả năng gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/mL. Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D. Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63%. Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [23]. Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây Đu đủ cái có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư. Một số chất trong cây Đu đủ cái đã được chứng minh là tác dụng lên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Tuy nhiên vẫn tập trung vào các bộ phận lá cái và quả Đu đủ. Chưa có công bố về hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất phân lập từ các bộ phận khác như rễ, thân,… cây Đu đủ cái và hoa, lá cây Đu đủ đực.  Tác dụng chống oxy hóa 9 Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,... Năm 2010, Satrija F và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá Đu đủ. Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau như: DPPH, 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate), acid nitric, superoxit, hydroxylion và lipid peroxidase. Giá trị IC50 tương ứng của các phương pháp là: 198, 185, 244, 323, 461 và 922 µg/mL [14]. Năm 2013, Maisarah A.M. và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non. Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β-carotene. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt. Tuy nhiên, hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [11]. Như vậy, kết quả nghiên cứu khẳng định lá cây Đu đủ cái có hoạt tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ lá Đu đủ còn rất hạn chế. Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá Đu đủ đực.  Các tác dụng dược lý khác Ngoài những hoạt tính sinh học trên, lá của cây Đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm,… Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên chứng minh được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [3].  Công dụng trong dân gian 10 - Lá Đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu. - Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ em. 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng sự [18]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB. Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. 1.5.1. Phương pháp MTT Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [9]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào. Formaran (màu tím) Tetrazolium (màu vàng) 11 1.5.2. Phương pháp SRB Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Trisbase để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng. 12 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại. Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017. Lá Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu. Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 5,0 m là cây thân thảo, lá to có màu hơi xanh lục, lá mọc so le, có cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8-9 thùy sâu, đặc biệt cây đu đủ đực không có quả mà chỉ có hoa. Lá Đu đủ đực được chọn là lá không bị sâu, màu xanh lục không quá non hoặc quá già. Cây được chọn để thu hái có nhiều lá và hoa. Sau khi hái đem về loại sạch bụi bẩn, mủ, bỏ cuống, rửa sạch, thái nhỏ từ 1-2cm và đem phơi trong nắng nhẹ cho đến khi khô hẳn, rồi đem xay thành bột. Bột lá Đu đủ đực hơi thô, màu xanh lục, được bảo quản trong bình hút ẩm. Hình 2.1. Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Dung môi chiết chloroform. Một số hóa chất khác cũng được sử dụng. Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS 13
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan