Tài liệu Khóa luận nghiên cứu biểu hiện gen hql1 và hql2 mã hóa hydroxyquinol 1,2 dioxygenase trong vi khuẩn escherichia coli m15

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: ThS. Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong nghiên cứu này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú nguồn gốc. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu kết quả là sản phẩm kế thừa hoặc đã công bố của người khác. Người cam đoan Nguyễn Ngọc Quỳnh ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến GS. Nguyễn Hoàng Lộc và ThS. Vũ Đức Hoàng đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS. Dương Đức Hoàng Sinh, người trực tiếp hướng dẫn cho em, tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Đồng thời, em cũng vô cùng biết ơn tất cả các anh chị, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm, các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho em trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Ngoài ra, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo trong Khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài, em xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc. Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc nhiều sai sót, em sẽ cố gắng tìm tòi và học hỏi hơn nữa để ngày một trưởng thành hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 27 tháng 4 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Ngọc Quỳnh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu ........................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ DIBENZOFURAN ............................................................. 3 1.1.1. Dioxin ........................................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc ..................................................................................................... 3 1.1.3. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 3 1.1.4. Tính chất lý hóa ............................................................................................ 3 1.1.5. Tác hại........................................................................................................... 4 1.1.6. Dibenzofuran ................................................................................................ 4 1.1.7. Nguồn gốc ..................................................................................................... 4 1.1.8. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 5 1.1.9. Tính chất lý hóa ............................................................................................ 6 1.1.10. Tác hại......................................................................................................... 7 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DIOXIN .............................................................. 8 1.2.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin trên thế giới ........... 8 iv 1.2.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin trong nước ............. 9 1.3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG PHÂN HỦY DIBEZOFURAN .................................................................................................... 11 1.3.1. Các enzyme phân giải dibenzofuran ........................................................... 11 1.3.2. Các vi sinh vật tái tổ hợp phân hủy dibenzofuran ...................................... 15 1.4. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP .................................. 17 1.5. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ENZYME HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE .................................................................................................... 19 1.5.1. Cấu tạo ........................................................................................................ 19 1.5.2. Tình hình nghiên cứu hydroxyquinol 1,2-dioxygenase trên thế giới ......... 19 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................. 21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 21 2.2.1. Phân lập gen HQL1 và HQL2 từ vi khuẩn E. coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 và pGEM®-T Easy/HQL2 .................................... 21 2.1.2. Tạo dòng gen HQL1 và HQL2 trong vector biểu hiện pQE30 .................. 23 2.1.3. Biểu hiện gen HQL1 và HQL2 trong E. coli M15 ..................................... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 27 3.1. PHÂN LẬP GEN HQL1 VÀ HQL2 TỪ VI KHUẨN E. COLI TOP10 MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP PGEM®-T EASY/HQL1 VÀ PGEM®-T EASY/HQL2 27 3.2.TẠO DÒNG GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN PQE30…. ..........................................................…………………………………..29 3.3. BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG E. COLI M15 ......................... 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ 1,2,3,4-TCDD : 1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 1,2,3,7,8-PeCDD : 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD : 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid AHR : Aryl hydrocarbon receptor (chất thụ cảm nhân thơm) AHRE : Aryl hydrocarbon response element bp : Base pair BPDO : Biphenyl dioxygenase DD : Dibenzo-p-dioxin DF : Dibenzofuran Epp : Eppendorf HpCDF : Heptachlorodibenzofuran HxCDD : Hexachlorodibenzo-p-dioxin HxCDF : Hexachlorodibenzofuran IARC : International Agency for Research on Cancer (Tổ chức nghiên cứu Ung thư quốc tế) IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside I-TEF : International toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương theo qui định quốc tế) LB : Môi trường Luria Bertani MSM : Minimal salt medium (Môi trường muối tối thiểu) OCDF : Octachlorodibenzofuran PCB : Polychlorinated biphenyl vi PCDD : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDD/F : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin và dibenzofuran PCDF : Polychlorinated dibenzofuran PCR : Polymerase Chain Reaction PeCDF : Pentachlorodibenzofuran TCDF : Tetrachlorodibenzofuran TEF : Toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương) TEQ : Toxic equivalent (độ độc tương đương) U : Unit (đơn vị) DW : Deionized water vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Hệ số độc tương đồng của các dẫn xuất DF ............................................... 7 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi ....................................................................................... 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của PCDD .................................................................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc của dibenzofuran và PCDF .......................................................... 5 Hình 1.3. Sự tạo thành DF trong quá trình oxy hóa .................................................... 6 Hình 1.4. Con đường chuyển hóa biphenyl bởi chủng Burkholderia sp. LB400 .... 12 Hình 1.5. Quá trình oxy hóa DF bởi các enzyme chuyển hóa biphenyl của chủng Burkholderia sp. LB400 ............................................................................................ 13 Hình 1.6. Con đường chuyển hóa carbazole bởi chủng Sphingomonas sp. XLDN2-5 ................................................................................................................................... 14 Hình 1.7. Chuyển hóa catechol bởi enzyme catechol 1,2-dioxygenase . .................. 15 Hình 2.1. Vector biểu hiện pQE30 ………………………………………………...21 Hình 3.1. Vector pGEM®-T Easy/HQL1 và pGEM®-T Easy/HQL2……………..27 Hình 3.2. Cắt hạn chế pGEM®-T Easy/HQL1 và pGEM®-T Easy/HQL2 bằng BamHI và HindIII ..................................................................................................... 28 Hình 3.3. Tinh sạch gen HQL2 và HQL1 ................................................................. 28 Hình 3.4. Tinh sạch vector pQE30 ............................................................................ 29 Hình 3.5. PCR khuẩn lạc E. coli TOP10 mang pQE30/HQL1 và pQE30/HQL2..... 29 Hình 3.6. Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 và pQE30/HQL2 ................................... 30 Hình 3.7. PCR khuẩn lạc E. coli M15 mang vector pQE30/HQL1 và pQE30/HQL2 ................................................................................................................................... 31 Hình 3.8. Tiểu đơn vị protein được mã hóa bởi gen HQL1 và HQL2 ..................... 32 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa chlorine bao gồm các hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử chlorine trong phân tử. Đây là các chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử chlorine trong phân tử. Các chất này được gọi chung là dioxin [2], và được chia thành 3 nhóm hợp chất là polychlorinated dibenzo-p-dioxin, polychlorinated dibenzofuran và polychlorinated bipheny [1]. Chúng được hình thành trong quá trình sản xuất hóa chất, giấy và bột giấy... Thời gian bán hủy của chúng trong đất từ 15 đến 100 năm nên khi chúng di chuyển càng sâu vào đất thì thời gian tồn tại trong môi trường càng lâu dài, đe dọa đến hệ sinh thái và sức khỏe con người [1]. Các đồng phân dibenzofuran chứa chlorine, furan không chứa chlorine và hydrocarbon thơm đa nhân là những hợp chất độc ngày càng phát tán rộng rãi trong môi trường. Một số chất được hình thành trong quá trình sản xuất thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu hoặc trong quá trình thiêu đốt ở các đô thị hoặc một số đồng phân là sản phẩm phụ tạo ra ngoài ý muốn do công nghệ lạc hậu. Những chất này bị phân hủy rất kém và một số chất có chu trình bán phân hủy đến vài chục năm [3]. Việc khử độc các chất ô nhiễm và khôi phục môi trường tại những vùng đất bị nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin là rất cấp bách. Có nhiều phương pháp để xử lý đất ô nhiễm dioxin như phương pháp vật lý, hóa học và sinh học. Tuy nhiên, các phương pháp này thường có giá thành cao và khó kiểm soát được ô nhiễm thứ cấp [3]. Phương pháp phân hủy sinh học dựa trên kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa phân hủy các chất ô nhiễm đã và đang thu hút được kết quả khả quan trong tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin [4]. Phân hủy sinh học là một phương pháp có nhiều triển vọng vì giá thành thấp so với các phương pháp vật lý và hóa học. Ngoài ra, phương pháp này an toàn đối với môi trường do không tạo ra sản phẩm thứ cấp. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thời gian lâu hơn các phương pháp khác. Quá trình oxy hóa cắt vòng benzene ở điều kiện hiếu khí hay khử loại chlorine ở điều kiện kỵ khí được thực hiện bởi các enzyme của vi sinh vật thông qua các phản ứng sinh hóa [3]. 2 Trong năm 2016-2017, tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học-Bộ môn Công nghệ Sinh học-Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học-Đại học Huế, đã phân lập thành công 2 chủng Burkhoderia cepacia DF2 và Burkhoderia cepacia DF4 có khả năng phân hủy sinh học dibenzofuran. Qua đó, đã khuếch đại và gắn thành công 4 gen (BphA, CAT1, ATH, HQL) mã hóa enzyme dioxygenase vào vector pGEM®T Easy, tạo dòng thành công trong tế bào E. coli TOP10. Để tiếp tục định hướng nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen HQL1 và HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase trong vi khuẩn Escherichia coli M15” 2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các kỷ thuật sinh học phân tử và công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu hiện gen HQL1 và HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase trong vi khuẩn E. coli M15 nhằm tiến tới sản xuất protein tái tổ hợp có giá trị trong xử lý các hợp chất độc dibenzofuran. 3. Nội dung nghiên cứu Tạo dòng biểu hiện gen HQL1 và HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2dioxygenase trong vector biểu hiện pQE30. Biểu hiện gen HQL1 và HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase trong E. coli M15. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về quy trình tạo dòng biểu hiện và biểu hiện gen HQL1 và HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase trong tế bào E. coli M15. Ý nghĩa thực tiễn: Biểu hiện thành công gen HQL1 và HQL2, tạo cơ sở để sản xuất hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, có khả năng phân hủy sinh học dibenzofuran, phục vụ trong công tác xử lý môi trường. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về dibenzofuran 1.1.1. Dioxin Dioxin và dẫn xuất của chúng là một nhóm bao gồm hàng trăm hợp chất hữu cơ độc hại và tồn tại bền vững trong môi trường, trong đó có 3 nhóm hợp chất là polychlorinated dibenzo-p-dioxin, polychlorinated dibenzofuran và polychlorinated biphenyl [1]. 1.1.2. Nguồn gốc Các quá trình đốt cháy và quá trình nhiệt luôn được xem là nguồn phát thải chính dioxin vào môi trường. Ngoài ra, chúng có thể được hình thành trong quá trình sản xuất của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp hóa chất, công nghiệp xi măng, tinh luyện hoặc tái chế kim loại, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may...[1], [37]. 1.1.3. Cấu trúc hóa học Polychlorinated dibenzo-p-dioxin hay còn gọi là dioxin, được cấu tạo bởi hai vòng thơm liên kết với nhau bằng hai nguyên tử oxy nên chúng có thể được coi như là diether của hai vòng benzene. Nó bao gồm 75 chất, được chia thành 8 nhóm tương ứng với số nguyên tử chlorine trong phân tử từ 1 đến 8 (Hình 1.1) [1]. Hình 1.1. Cấu trúc của PCDD [1] 1.1.4. Tính chất lý hóa Ở điều kiện thường, dioxin là chất rắn màu trắng, kết tinh rất mịn, bền vững trong môi trường. Nhiệt độ nóng chảy 305-306oC, nhiệt độ sôi 412oC, nhiệt độ tạo thành 750900oC, bị phân hủy hoàn toàn ở nhiệt độ 1200-1400oC hoặc cao hơn. Áp suất bay hơi và 4 hằng số Henry của chúng thấp. Do độ phân cực rất thấp nên chúng gần như không tan trong nước mà tan tốt hơn trong các dung môi hữu cơ như 1,2-dichlorobenzene, chlorobenzene, chloroform, benzene... và đặc biệt tan tốt trong dầu mỡ [1]. Các phản ứng phân hủy doxin được thực hiện trong các điều kiện đặc biệt về nhiệt độ cao, chất xúc tác, các acid có tính oxy hóa mạnh, kiềm đặc... Ở nhiệt độ khoảng 250oC, chúng bị các acid vô cơ có tính oxy hóa mạnh phân hủy hoàn toàn thành những chất không độc. Dưới tác dụng của kiềm đặc, nhiệt độ và áp suất cao, các nguyên tử chlorine bị thay thế dần bằng các nhóm hydroxyl để trở hành hợp chất ít độc hơn. Tia tử ngoại phân hủy dioxin theo hướng đề chlorine hoá, sinh ra các sản phẩm thế chlorine thấp hơn hoặc không chứa chlorine [1]. 1.1.5. Tác hại Dioxin là một trong những hợp chất độc nhất mà con người biết đến. Trong đó, 2,3,7,8-TCDD là chất độc nhất, nó là chất gây ung thư cho người (ung thư tổ chức phần mềm, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đường hô hấp như ung thư phổi, phế quản, khí quản, thanh quản), ngoài ra nó còn là tác nhân gây ra các bệnh nguy hiểm khác như bệnh sạm da, bệnh tiểu đường, bệnh đa u tủy, u lympho ác tính, bệnh thần kinh ngoại vi... có thể dẫn đến tử vong. Nguy hiểm hơn, nó còn gây ra thiểu năng sinh dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai, dị dạng...và được tổ chức nghiên cứu Ung thư quốc tế - IARC xếp vào nhóm độc loại 1, tức là nhóm gây ung thư dẫn đến tử vong đối với người [1], [2], [38]. 1.1.6. Dibenzofuran Dibenzofuran là thành phần phổ biến trong các chất gây ô nhiễm môi trường, và được xác định có trong không khí, nước ngầm, khí đốt nhiên liệu, khói từ lò đốt rác thải đô thị, khí thải từ động cơ diesel...[17]. 1.1.7. Nguồn gốc Dibenzofuran và dẫn xuất của nó được hình thành từ các nguồn như đốt cháy than đá, dầu, gỗ, rác thải hay các hợp chất hữu cơ như thuốc lá, công nghiệp hóa chất, công nghiệp bột giấy và giấy có sử dụng chlorine để tẩy, sự cố tràn dầu... Chúng có thể được tìm thấy trong bề mặt của dầu thô, than đá, nhựa than đá, dầu... Giống như dioxin, DF và 5 dẫn xuất của nó có mặt trong môi trường nước, không khí, và đất. Ngoài ra, chúng còn có trong thịt, trứng, sữa, cá... Trong không khí, chúng đồng thời tấn công và liên kết vào phần tử bụi như cát sau đó tích tụ trong đất hoặc trầm tích [8], [46], [14]. Quá trình chlorine hóa DF đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành PCDF trong công nghiệp hóa chất [15]. Schauer và công sự (1999) đã báo cáo DF trong nhiên liệu diesel khoảng 29 µg/g và trong khí thải của động cơ diesel khoảng 28,7 µg/km [16]. 1.1.8. Cấu trúc hóa học Dibenzofuran (C12H8O) hay còn gọi với những tên khác như 2,2’- biphenylene oxide, dibenzo (b,d) furan, diphenylene oxide. Thuộc loại cấu trúc hydrocarbon thơm đa vòng [16]. Là hợp chất có cấu trúc gồm 2 nhân benzene nối với nhau bởi một cầu nối biaryl có chứa nguyên tử oxygen, cùng dạng cấu trúc hóa học với fluorene và carbazole (Hình 1.2). Hiện nay, dibenzofuran được sử dụng như mô hình trong các nghiên cứu về cơ chế phân hủy các chất dạng dioxin trong phòng thí nghiệm [7]. PCDF hay còn gọi là furan, gồm 135 chất và được chia thành 8 nhóm tương ứng với số nguyên tử chlorine trong phân tử từ 1 đến 8 (Hình 1.2) [1], [18]. Hình 1.2. Cấu trúc của dibenzofuran và PCDF [1], [18] 6 1.1.9. Tính chất lý hóa Ở nhiệt độ thường, DF có dạng tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 82°C, nhiệt độ bay hơi 287°C, áp suất hơi 2,48 x 10-3 mmHg ở 25oC. Tan tốt trong acetic acid, acetone, ethanol, ether, benzene, toluene, ethylbenzene [16]. Các dẫn xuất của DF có tính chất vật lí tương tự dioxin, chúng là chất rắn ở nhiệt độ thường, nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao, áp suất hơi và hằng số Henry thấp nên chúng cũng tan rất ít trong nước và tan tốt trong dầu mỡ [1]. Đây cũng là những hợp chất bền vững, có ái lực mạnh đối với trầm tích và có khả năng tích tụ cao trong các mô sinh học [46]. Thời gian bán hủy của DF trong đất ở điều kiện hiếu khí ước tính từ 7 – 28 ngày, ở điều kiện kị khí từ 28 – 112 ngày, và trong nước ngầm từ 8 – 35 ngày. Trong khí quyển, thời gian bán hủy của nó khoảng từ 1,9 – 19 giờ dựa vào phản ứng của nó với gốc OH [16]. DF được tạo thành trong quá trình oxy hóa các hợp chất như phenanthrene, fluorene, 9-methylfluorene, 9-fluorenone (Hình 1.3) [15]. Hình 1.3. Sự tạo thành DF trong quá trình oxy hóa [15] 7 1.1.10. Tác hại Dibenzofuran có thể đi vào cơ thể qua đường hô hấp hoặc tiếp xúc với da. Khi tiếp xúc nhiều với DF thì có thể gây phát ban hoặc biến đổi màu da [19]. Dựa vào số lượng nguyên tử chlorine và vị trí của chúng trong phân tử mà xác định độc tính của PCDF, trong đó các phân tử có 4 nguyên tử chlorine trở lên và ở vào các vị trí 2, 3, 7 và 8 cũng có cơ chế gây độc tương tự như 2,3,7,8-TCDD nhưng độ độc kém hơn. Chúng có khả năng gây ảnh hưởng ngay cả ở những liều tiếp xúc rất nhỏ và ảnh hưởng có thể kéo dài từ thế hệ này sang thế hệ khác, có khả năng ảnh hưởng tới quá trình sao mã các thông tin di truyền và tổng hợp protein tại nhân tế bào. Việc tổng hợp protein một cách không kiểm soát của cơ thể là nguyên nhân gây ra những tai biến về sức khỏe. Thêm vào đó, việc gây nhiễu loạn trong quá trình sao mã cũng dẫn tới hậu quả làm thay đổi các thông tin di truyền và gây ra những đột biến về gen di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác [1]. Tương tự như dioxin, chúng có thể kết hợp với chất thụ cảm nhân thơm AHR trong tế bào, cặp phức chất này tương tác tiếp với phối tử chuyển nhân và di chuyển vào nhân tế bào. Tại đây, chúng tương tác với một đoạn gen đặc hiệu trong chuỗi DNA có tên gọi là AHRE, kết quả là dẫn tới sự sao mã sai lệch của mRNA và gây ra sự tổng hợp của nhiều gen và enzyme khác nhau [1], [20], [14]. Mức độ tương đối về độ độc của các chất hữu cơ khó phân hủy được biểu thị thông qua một giá trị được gọi là hệ số độc tương đương (Toxic Equivalency Factor), trong đó giá trị TEF của 2,3,7,8-TCDD được qui định là 1. Giá trị TEF cho 10 dẫn xuất của DF theo qui định quốc tế (International-TEF) thể hiện ở bảng 1.1 [1]. Bảng 1.1. Hệ số độc tương đồng của các dẫn xuất DF [1] Tên chất I-TEF Tên chất I-TEF 2,3,7,8-TCDF 0,1 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 1,2,3,7,8-PeCDF 0,05 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 2,3,4,7,8-PeCDF 0,5 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 OCDF 0,001 8 Những chất này được giữ lại trong cơ thể động vật và người, tập trung chủ yếu ở mỡ, gan... Mặc dù, chúng có thể được cơ thể người chuyển hóa và bài tiết nhưng quá trình này xảy ra rất chậm và thời gian bán hủy của chúng trong cơ thể người từ vài năm đến vài chục năm [1], [46]. Thí nghiệm trên động vật, các PCDF có các chlorine ở các vị trí 2,3,7,8 có độc tính tương tự PCDD. Một số PCDF đã được chứng minh là gây quái thai ở chuột [14]. Nghiên cứu về những người đã ăn phải dầu gạo bị ô nhiễm bởi PCB, PCDF ở Nhật Bản và Đài Loan. Trong cả hai trường hợp, ngộ độc tương tự ngộ độc chloracne, nồng độ triglyceride cao, triệu chứng thần kinh bất thường, thay đổi nhãn khoa và thay đổi các thông số miễn dịch [14]. Phụ nữ tiếp xúc với một vài miligram furan trong dầu gạo bị ô nhiễm ở dẫn đến sinh con dị tật hoặc tử vong ở trẻ sơ sinh [46]. 1.2. Tình hình nghiên cứu Dioxin 1.2.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin trên thế giới Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh một số loài vi sinh vật chứa các gen tham gia quá trình phân hủy, xúc tác hay chuyển hóa các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran, các congener khác của polychorinated dibenzo-p-dioxin và polychlorinated dibenzofuran như Sphingomonas sp. RW1, chủng Pseudomonas HH69, NCGB 9816, CA10..., Terrabacter sp. DPO136, 360, Staphylococcus auriculans DBF63, một vài loài của chi Rhodococcus, nấm đảm Phanerochaete chrysosporium, P. Sordida YK-624, nấm men, nấm sợi...[7]. Takada và đồng tác giả (1996) đã nghiên cứu khả năng phân hủy polychlorinated dibenzo-p-dioxin và polychlorinated dibenzofuran bởi nấm mục rửa trắng Phanerochaete sordida YK-624. Kết quả cho thấy khả năng phân hủy polychlorinated dibenzo-p-dioxin: 40% (tetra-chloro-) đến 76% (hexachloro-) và khả năng phân hủy polychlorinated dibenzofuran: 45% (tetra-chloro-) đến 70% (hexachloro-) [21]. Fukuda và đồng tác giả (2002) đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn Klebsiella sp. HL1 và Sphingomonas sp. HL7 có khả năng sử dụng dibenzofuran như một nguồn carbon duy nhất được phân lập từ các mẫu đất của khu đất hoang. Các chất chuyển 9 hóa từ dibenzofuran của chủng HL1 và HL7 tương tự như những vi khuẩn phân hủy dioxin Sphingomonas sp. RW1. Chủng HL7 có gen tương đồng với gen mã hóa enzyme dioxygenase (dxnA1) của chủng Sphingomonas sp. RW1 [22]. Năm 2004, Hong và đồng tác giả đã phân lập được chủng Pseudomonas veronii PH-03 từ đất bị ô nhiễm bằng kỹ thuật tăng sinh chọn lọc. Chủng PH-03 sử dụng dibenzo-p-dioxin và dibenzofuran như nguồn carbon. Hơn nữa, 1chlorodibenzo-p-dioxin, 2-chlorodibenzo-p-dioxin và các chất chuyển hóa dioxin khác, salicylic acid và catechol cũng được chuyển hóa tốt [25]. Năm 2006, Jin và đồng tác giả đã phân lập chủng Janibacter terrae XJ-1 có khả năng sử dụng dibenzofuran. Chủng này có khả năng nhân đôi sau 12 giờ ở 300C và phân giải hoàn toàn 100 mg/L dibenzofuran trong 5 ngày, sản sinh 2,2', 3trihydroxybiphenyl, salicylic acid, gentisic acid, và các chất chuyển hóa khác [23]. Peng và đồng tác giả (2013) đã phân lập được chủng Rhodococcus sp. p52 có thể sử dụng dibenzofuran và loại bỏ hoàn toàn dibenzofuran ở 500 mg/L trong vòng 48 giờ. Chủng p52 có thể loại bỏ 70% 2-chlorodibenzofuran ở 100 mg/L trong 96 giờ và có thể chuyển hóa các hợp chất thơm như dibenzo-p-dioxin, biphenyl, fluorene, dibenzothiophene, 2,8-dichlorodibenzofuran... Hai gen mã hóa enzyme dioxygenase (DbfA và DfdA) được khuếch đại và giải trình tự [24]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin trong nước Năm 2004, Hoàng Thị Mỹ Hạnh và đồng tác giả đã nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20 được phân lập tại đất ô nhiễm chất độc hóa học. Kết quả xác định một phần trình tự gen 18S rRNA cho thấy FDN20 có độ tương đồng 97,3% với chi Acremonium. Chủng FDN20 có khả năng phát triển tốt trong môi trường chứa 3% NaCl, pH 6 và ở 280C. Sau 7 ngày nuôi cấy, trong môi trường muối khoáng chứa 1% glucose, chủng FDN20 phân hủy 30% dibenzofuran và 44% 2,4D [3]. Mai Anh Tuấn và đồng tác giả (2004) đã nghiên cứu phân loại và khả năng sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran của chủng xạ khuẩn XKDN19 được phân lập tại khu đất nhiễm chất độc ở sân bay Đà Nẵng. Kết quả chủng xạ khuẩn XKDN19 có khả năng phân hủy 78,7% anthracene, 22,36% flouranthene với nồng độ ban đầu của 10 các chất này là 100 ppm nhưng chủng này không sử dụng dibenzofura như là nguồn năng lượng và carbon duy nhất [10]. Nguyễn Đương Nhã và đồng tác giả (2005) đã nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân và dibenzofuran của chủng xạ khuẩn XKDN12 được phân lập từ đất bị ô nhiễm dioxin ở sân bay Đà Nẵng. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA (khoảng 550 bp) của chủng này được đăng ký trong ngân hàng gen. Chủng XKDN12 phát triển tốt ở nồng độ NaCl 1%, pH 7 và nhiệt độ 300C. Sau 7 ngày nuôi cấy lắc, 32,72% phenanthrene; 39,01% anthracene; 39,01% fluoranthene đã bị phân hủy khi nồng độ ban đầu của các chất này là 100 ppm. Chủng xạ khuẩn này cũng phân hủy 32,1% dibenzofuran sau 10 ngày nuôi cấy ở điều kiện lắc [7]. Nguyễn Bá Hữu và Đặng Thị Cẩm Hà (2007) đã xác định gen mã hóa dioxygenase của chủng xạ khuẩn phân hủy dibenzofuran Rhodococcus sp. HDN3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng. Kết quả trình tự đoạn gen mã hóa enzyme dioxygenase của chủng HDN3 có mức tương đồng cao 99% với đoạn gen mã hóa enzyme dioxygenase của các chủng xạ khuẩn Terrabacter sp. DBF63, Mycobacterium sp. YK18; 98% với gen mã hóa tiểu đơn vị alpha angular dioxygenase của chủng xạ khuẩn Rhodococcus sp. YK2, Rhodococcus sp. DFA3 [6]. Năm 2008, Nguyễn Bá Hữu và đồng tác giả đã xác định các đoạn gen mã hóa enzyme chuyển hóa chất diệt cỏ từ ba chủng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran. Kết quả các đoạn gen tfdA, tfdAα và giống cadA đã được phát hiện trong 3 chủng vi khuẩn sử dụng dibenzofuran Rhodococcus sp. HDN3, Paenibacillus sp. Ao3 và Terrabacter sp. DMA phân lập từ đất và trầm tích nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở Đà Nẵng [4]. Nguyễn Nguyên Quang và đồng tác giả (2009) đã phân lập và phân loại nấm sợi sử dụng chất diệt cỏ chứa dioxin từ đất nhiễm chất độc hóa học tại căn cứ quân sự cũ Đà Nẵng. Kết quả phân lập được 15 chủng nấm sợi: 4 chủng sử dụng dịch chiết đất chứa dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất; 5 chủng có khả năng phát triển trên môi trường có chứa 2,4,5-T và glucose; 6 chủng phát triển trên môi trường chứa dịch chiết đất chứa dioxin và glucose. Ba chủng FDN4, FDN9 và FDN10 có thể phát triển tốt trên môi trường khoáng bổ sung 2,4,5-T hoặc dịch chiết đất khi có mặt của glucose hoặc không bổ sung glucose. Dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào 11 tử và so sánh một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA của chủng FDN9, chủng này có thể được xếp vào chi Aspergillus và có tên là Aspergillus sp. FDN9 [9]. Năm 2012, Phùng Khắc Huy Chú và đồng tác giả đã phân lập, phân loại chủng vi khuẩn BHNA1, xác định gen tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2,4-D từ đất nhiễm chất diệt cỏ/ dioxin thuộc khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa. Kết quả đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trên dịch chiết đất chứa dioxin, 2,4,5T và 2,4-D như là nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn BHNA1 thuộc chi Pseudomonas và được đặt tên là Pseudomonas sp. BHNA1. Chủng này có mang đoạn gen tfdA mã hóa cho enzyme 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase. Đoạn gen này có mức tương đồng từ 67-96% với gen chức năng tương tự đã được công bố [5]. 1.3. Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong phân hủy dibezofuran 1.3.1. Các enzyme phân giải dibenzofuran a) Biphenyl 2,3-dioxygenase Biphenyl 2,3-dioxygenase hay còn gọi là biphenyl dioxygenase, là enzyme xúc tác bước đầu tiên của con đường chuyển hóa biphenyl. Nó cũng oxy hóa một loạt các chất tương tự biphenyl, bao gồm PCB, DF, và DD [26]. Enzyme này ở chủng Burkholderia sp. LB400 là enzyme phân giải PCB tốt nhất có nguồn gốc tự nhiên. Biphenyl dioxygenase là một enzyme ba thành phần. Nó bao gồm iron-sulfur protein làm xúc tác cho việc bổ sung phân tử oxygen, flavoprotein reductase và ferredoxin liên quan đến việc chuyển các electron từ NADH đến iron-sulfur protein. Các thành phần biphenyl dioxygenase được mã hóa bởi bphA (tiểu đơn vị α của iron-sulfur protein), bphE (tiểu đơn vị β của iron-sulfur protein), bphF (ferredoxin) và bphG (flavoprotein reductase) trong chủng Burkholderia sp. LB400 (Hình 1.4) [26]. 12 Hình 1.4. Con đường chuyển hóa biphenyl bởi chủng Burkholderia sp. LB400 [26] Gần đây, biphenyl 2,3-dioxygenase, enzyme oxy hóa ban đầu trong con đường chuyển hóa biphenyl của chủng Burkholderia sp. LB400 và chủng P. pseudoalcaligenes KF707 đã được báo cáo có khả năng oxy hóa góc DF và DD (Hình 1.5) [27]. Tuy nhiên, biphenyl dioxygenase của chủng Burkholderia sp. LB400 oxy hóa DF không hiệu quả [26].